Summary
Здесь мы представляем протокол к замораживанию и раздел мозговой ткани из нескольких животных как экономия времени альтернатива для обработки одного мозги. Это уменьшает окрашивание изменчивость во время иммуногистохимии и уменьшает время cryosectioning и томографии.
Abstract
Обычные методы анализа для визуализации микроскопической анатомии и Локализация белков в биологической ткани гистологии и иммуногистохимии. В неврологии, а также множество других научных областях используются эти методы. Иммуногистохимия может быть сделано на слайд монтируется ткани или свободно плавающего секций. Подготовка образцов слайда монтируется это время интенсивного процесса. Следующий протокол для метод, называемый Megabrain, сократить время, необходимое для cryosection и горе ткани мозга до 90% путем объединения нескольких мозги в единый блок замороженные. Кроме того этот метод снижение изменчивости между пятнать раундов, в большой гистохимических исследований. Текущий метод был оптимизирован для использования грызунов мозговой ткани в течению Иммуногистохимический анализ; Однако она может применяться в различных научных областях, использующих cryosectioning.
Introduction
Здесь мы представляем протокол для метода роман, который мы называем Megabrain, разработан для cryosection, несколько грызунов мозги одновременно течению иммуногистохимических процедур. Megabrain позволяет для производства одного слайдов, содержащих ткани от нескольких животных. Эта техника была оптимизирована для вырезать корональных разделы из 9 взрослых крыс полушарий, или 5 взрослых полное мозги, одновременно. Таким образом методика является наиболее применимым в больших иммуногистохимические исследования или другие анализы, сделали на ткани головного мозга, слайд установлен с большой когорты животных.
Иммуногистохимия предполагает использование специфических антител, направленные против протеинов интереса для понимания и характеризуют их выражения и клеточные изменения в конкретных тканей1,2,3. Использование иммуногистохимия преобладает в неврологии исследований, среди других научных дисциплин, пособничество в клеточном и молекулярном понимания мозга4. Крупномасштабные исследования, с участием многих животных и секции мозга может быть как ресурсов, так и во время интенсивного. Таким образом, является многогранной обоснование разработки Megabrain: сократить время провел cryosectioning, монтаж и окрашивание ткани, а следовательно с использованием менее реагентов. Кроме того возможность рационализировать процесс и пятно несколько мозги в том же раунде помогает облегчить некоторые из изменчивость между пятнать пакетов, ограничение иммуногистохимия3. Кроме того секционирование Megabrain является экономия времени альтернативой секционирование отдельных замороженных грызунов мозги и позволяет для быстрого сравнения ткани между животных или даже группы лечения методами микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Megabrain техника была оптимизирована с помощью состава и hemisected мозги от мужчины взрослых мышей C57Bl65, несовершеннолетних крысах Sprague-Dawley и взрослых крыс Sprague-Dawley, которые были transcardially, увлажненную с 1 x фосфатный буфер (PBS) после параформальдегида 4%6. Аналогичные результаты может осуществляться в других штаммов мыши и крысы, у обоих полов и в разном возрасте. Исследование для создания данных для этого манускрипта используется несовершеннолетних крысах Sprague-Dawley и был одобрен университета штата Аризона институционального ухода за животными и использования Комитетом, и были заботятся согласно руководство для ухода и использования лабораторных экспериментальных животных 7животных.
1. криозащиты перфузии мозга
- После успешного transcardial перфузии6, собирать полный мозга6,8 от животных и пост исправить путем размещения в 25 мл флакон параформальдегида 4% в PBS на 24 часа.
Предупреждение: Параформальдегида является токсичным ткани фиксатором; обращаться с осторожностью. Передача параформальдегида в специально обозначенных контейнер для отходов, который идентифицирует его концентрации и объема внутри Химический вытяжной шкаф и затем хранить в химических отходов, кабинета до утилизации химической безопасности или должным образом подготовленного персонала. - По истечении 24 h в Зонта, удалите мозги из параформальдегида 4%, с помощью шпателя. Передача мозга во флакон примерно 20 мл раствора 15% сахарозы в 1 x трис амортизированное saline (TBS) до тех пор, пока мозг опускается на дно флакона (примерно 24 h).
- После этого передать мозг флакон примерно 20 мл раствора 30% сахарозы в 1 x TBS, до тех пор, пока мозг опускается на дно флакона (около 24-48 ч).
2. мозг замораживания
- Место стеклянный стакан 500 мл на ложе из сухого льда в ведёрке со льдом. Налейте в стакан стеклянный 300 – 400 мл изопентана (2 метил Бутан).
- Разрешить температуры изопентана до-45 ° C до-50 ° C. Внимательно контролировать и поддерживать этот диапазон температур с помощью термометра, сохраняя его постоянной на протяжении всей процедуры. Убедитесь, что показания температуры взяты из середины решения, а не дотрагиваться до нижней и боковой стакан.
- На benchtop, заполнить одноразовые, встраивание формы (см. перечень материалов) примерно 1/2 полный оптимальной температуры вырезывания (Окт; см. Таблицу материалы) соединения. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в центре развертывания Office. Если есть любые пузыри воздуха удалить их с помощью шпателя или иглы.
-
Удалите первый мозг из флакона 30% сахарозы с помощью шпателя. На данный момент либо заморозить мозг полностью или hemisect, в зависимости от дизайна исследования.
- Для hemisected мозги используйте новые лезвия бритвы сделать чистая прорезать ткани, чтобы отделить полушарий. Если не требуется для исследования, удалите мозжечка и обонятельные луковицы на данном этапе. Если мозжечка необходим для исследования, предлагается сократить плоской области в конце заднего мозга, чтобы помочь мозга в стоя прямо в форме. Если исследование требует только ткани из локализованных региона, матрицу грызунов мозга может использоваться для блокирования мозга, основанные на известных координат.
- Дать мозги Числовое именование системы. Нарисуйте диаграмму, как показано на рисунке 1. Напишите номер первого мозга, чтобы быть помещены в Megabrain плесень в позиции 2, оставив позиции 1 как пустое пространство, чтобы помочь в быстрой идентификации ориентации, в которой были заморожены мозги.
- Использование тупой щипцами или пинцетом, подобрать мозг быть помещены в позиции 1. Ориент мозга с в сторону, чтобы вырезать первый вверх. Ниже мозга в центре развертывания Office в соответствующее место, используя пинцет скорректировать свою позицию до тех пор, пока он стоит самостоятельно.
- Повторите шаги 2.3-2.5 для оставшихся мозги/полушарий быть заморожены в позициях 3 – 10. Избегайте позиционирования мозги/полушарий в макете симметрично.
- Просмотрите все 9 мозги в Megabrain форму. Как только мозги стоят самостоятельно, вертикально и правильно ориентированных в центре развертывания Office (как показано на рисунке 2B), добавьте больше OCT плесень (до тех пор, пока в верхней части мозги покрыты). Опять же убедитесь, что есть нет видимых воздушных пузырьков в центре развертывания Office.
- Используйте щипцы провести углу формы, обеспечивая щипцы не стать частично погруженным в центре развертывания Office (рис. 3A). Будьте осторожны сохранить уровень плесень, опустите плесень в изопентана (-45 ° C до-50 ° C) так что нижней трети погружен прессформу. Держите разрешить любые пузыри в центре развертывания Office, чтобы подняться на поверхность и от ткани (рис. 3B).
- После 30 s, меньше всего плесень в изопентана и освобождения от щипцы, оставляя Megabrain погружения для по крайней мере 3 мин (рис. 3 c). Убедитесь, что плесень уровне, поэтому мозг остаются вертикально, так и на равном расстоянии (рис. 3D).
- После 3 минут используйте щипцы для удаления плесени, содержащий замороженные, OCT встроенных мозги (Рисунок 3E) из изопентана.
- Сразу же оберните прессформы и его содержимое в алюминиевой фольги и маркировать его с поголовья или Megabrain идентификации. Как можно избежать оттаивания тканей скупо сенсорных замороженных Megabrain.
- Этот Megabrain может теперь переведен в морозильной камере-20 ° C и хранить в течение как минимум 24 часа.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и Megabrain может храниться до cryosectioning занимает место.
3. Подготовка Megabrain для разрезания на криостат
- Установите кабинета температуру криостата до-19 ° C. Убедитесь, что эта температура достигается прежде чем продолжить. На протяжении секционирование, гарантировать шкафа температуры от-18 ° C до -20 ° C.
- Возьмите Megabrain из морозильной камеры-20 ° C и поместите его в криостата. Кроме того место Чак соответствующие размеры и два тонким наконечником кисти в криостата. Оставьте Megabrain и патрон в криостат для по крайней мере 15 минут прийти к температуре криостата.
- Надлежащим образом ярлык слайды с Megabrain идентификационный номер и номер слайда. Положите эти слайды на слайде с подогревом (35 – 45 ° C).
- Развертки Megabrain из алюминиевой фольги. Используйте лезвие вертикально срезать углы формы позволяют легко удаления блока октября от плесени (рис. 4A).
- Распределить тонким слоем (толщиной около 3 мм) октября на патрон.
- Быстро с минимальным контактом между пальцами и OCT, место Megabrain на патрон, в желаемой ориентации. Большие щипцы могут также использоваться для этого шага для сведения к минимуму оттаивания. Перед началом раздел, оставьте Megabrain установлен патрон в криостат для 15-20 минут позволить OCT заморозить полностью.
- После того, как замороженные базовый слой OCT, применять слоем толщиной 2 мм OCT вокруг стороны Megabrain и позволить, чтобы бежать вниз с сторон на патрон это. Это помогает защитить Megabrain в патрон. Опять же прежде чем продолжить, оставьте Чак Megabrain смонтированы в криостат для 15-20 минут позволить OCT заморозить.
- Для удаления любой избыток октября от стороны или нижней части патрона (рис. 4B) используйте лезвием бритвы.
4. Cryosectioning Megabrain
- Перед началом, убедитесь, что доступен стакан, содержащий по меньшей мере 20 мл ПБС.
- Расположите Чак, монтируется с Megabrain, в зажимную головку на криостата (рис. 4В).
- Установите криостата Cut на желаемую толщину. Нынешняя методология была оптимизирована для 10 мкм до 50 мкм секций.
- Трим OCT и ткани, необходимых для достижения желаемого мозг региона для коллекции ткани (рис. 4 c).
- Когда будете готовы собирать ткани, Нижняя пластина уголка, до тех пор, пока он лежит на сцене и поверните ручку криостата принять одну секцию. Медленно поднимите пластину уголка, стараясь секционного Megabrain не присоединен к пластина уголка и не упасть этапе Рисунок 4 d).
- Аккуратно используйте кисти раскатать в Megabrain разделе до тех пор, пока он лежит плашмя на сцене криостата (Рисунок 5A). (При необходимости, провести OCT плоская, с помощью кисти для предотвращения прокатки).
- Удалить слайд из слайда с подогревом и наведите слайд, этикеткой вниз, над Megabrain на сцене, позволяя в разделе Вставить на слайд.
- Быстро применить капли ПБС к каждому разделу ткани на слайде и не позволяют эти высохнуть до тех пор, пока они были чистили плоский (см. шаг 4.9).
- Использование тонкой наконечником кистью, смоченной в однократном ПБС кисть из любые пузыри в ткани и разворачиваться ткани, так что он лежит плашмя на слайде (Рисунок 5B). Заботиться, чтобы не изменять положение секции мозга и таким образом потерять относительное положение в других разделах ткани. Манипулировать ткани с осторожностью, чтобы избежать слезы. Держите секции мозга от края слайда, как периферийные пространство требуется для coverslip и пап перо приложения в некоторых пятная протоколы.
- Поместите слайд обратно на слайд, теплым и сухим для 45 мин покрытие для предотвращения пыли от урегулирования на ткани. После высыхания, храните слайды при температуре-80 ° C до дальнейшего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Положительный конечный результат этой процедуры является ткань, которая лежит плашмя на слайде, без пузырей или слезы, в ориентации, в котором они были заморожены. Разделах ткани равномерно распределены отдельно и легко идентифицировать благодаря хорошее размещение мозга в центре развертывания Office и хорошо нотации, как это было продемонстрировано на рисунке 1. Предполагая, что ткани мозга была собрана из животных того же возраста, и что ткани был надлежащим образом согласован в центре развертывания Office, разделы, собранные на слайде должен представлять аналогичные корональных плоскости, позволяя сравнения регионов мозга между животными. Условии, что хорошо, замороженные ткани с минимальными замораживание артефакт, H & E пятно может осуществляться для оценки качества криозащиты9. Иммуногистохимия может осуществляться как показано с окрашивание показано на рисунке 6.
Рисунок 1: представитель схема макет предлагаемых Megabrain. Это показывает позицию нотации ткани, производный от 9 различных животных. Номер система предназначена как продемонстрировано; Однако может использоваться любой системы нумерации. «X» является представителем пустое пространство, призванные четко показывают направление, в котором ткани был заморожен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: правильно и неправильно позиционируется мозги в плесень. (A) мозг полушарий, плохо выравниваются в OCT с верхней и боковой. (B) полушарий хорошо выровненные мозга в OCT с верхней и боковой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: этапы замораживания мозга. (A) Megabrain до погружения в изопентана-45 ° С. (B) Megabrain когда погружены в изопентана. (C) Megabrain полностью погруженной в изопентана. (D) Megabrain опускают в изопентан, демонстрируя, что мозг должен оставаться вертикально и на равном расстоянии друг от друга во время этого процесса. (E) A замороженные Megabrain в встраивание формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: основные этапы в резки Megabrain. (A) Megabrain удаляется из встраивания плесень в криостата. (B) Чак монтируется с Megabrain. (C) отделаны Megabrain. Megabrain (D) раздел на стадии криостата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: до и после навесные секции Megabrain. (A) замороженных Megabrain раздел (40 мкм) на сцене криостата. (B) стекло монтируется с Megabrain ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: иммуногистохимия слайд Megabrain окрашенных с Iba1. (A) ткани, взяты из Megbrain показывает равномерное окрашивание между различными мозги в исследовании. (B) 20 x микроскопических изображений из области коры поля (S1BF) соматосенсорные баррель каждого подключенного мозга, показаны последовательно ионизированного кальция привязки адаптера молекула 1 (Iba1) окрашивание микроглии между мозгом. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время этой процедуры следует рассматривать, что температура Megabrain и его окрестностях должен постоянно контролироваться предотвратить Размораживание и повторное замораживание ткани. Мозг можно только удалить из морозильной камеры-20 ° C до до 3 раза как каждый раз, когда он коснулся и оставили в криостат с теплее колебания температуры, ткани тает и refreezes, вызывая желе, как текстуры и аномальные ткани целостности10. Таким образом это оптимально сократить Megabrain все сразу.
Фиксации ткани и криозащиты являются ключевыми элементами этого протокола к минимуму образование кристаллов льда, сокращения внешних микробного роста и остановить ферментативных реакций, тем самым сохраняя целостность ткани10. Если мозги не cryoprotected с сахарозой, вода внутри ткани могут образовываться кристаллы льда во время процесса замораживания, который лоскуток ткани и вызвать отверстия в форме. Хотя мы предлагаем серийных разведений сахарозы в TBS, мозг могут быть размещены непосредственно в 30% сахарозы для длительного периода (48-72 часов) для достижения аналогичных криозащиты. Однако настоятельно рекомендуется, что сахароза решения сделаны с TBS. вариации как использование PBS или воды приведет к плохой криозащиты Megabrain и бедных ткани качества. Гематоксилин и эозином (H & E) пятно может использоваться для оценки качества криозащиты и последующее замораживание артефакт11. Качество хорошее ткани (с минимальными отверстиями) имеет важное значение в гистологических исследований как отверстия может нарушить связывание антител, а также снижению целостности ткани клеток с тонкой процессы, которые могут повлиять на анализ некоторых пятен. Избегайте симметричные размещение мозги, как это может вызвать путаницу при попытке определить животное, из которого был получен каждый мозг.
Текущий метод был оптимизирован для коронковой секций; Однако она может быть легко адаптирована сократить разделы сагиттальной и поперечные. Эти изменения резки потребует соответствующего варьирования мозга размещения в шагах 2.5 через 2.7. Следует отметить, что эти приспособления может уменьшить количество мозги, которые могут поместиться в одну форму внедрения.
Основные модификации этой техники является пустое пространство в позиции № 1 (как показано на рис. 1). Это пространство предназначен для позволяют легко идентифицировать Megabrain ориентации и поэтому определить животное, связанные с каждым мозга.
Эта техника была изменена чтобы позволить ткани от большего числа животных, чтобы быть заморожены и одновременно сократить в Megabrain. Размер грызунов мозга зависит от пола, возраста и видов поэтому; количество мозги, которые вписываются в плесень может варьироваться. Не рекомендуется для разделения разных возрастов, полов или лечения группы в отдельные Megabrains. Хотя это может обеспечить единообразие размер, он также может увеличить предвзятости и субъективность во время обработки изображений и анализа. Кроме того Есть неизбежные расхождения между слайдами во время иммуногистохимия в любой протокол, который может привести к окрашивание несоответствие между группами возраст/пол.
Прямоугольный, больший патрон был использован вместо один циркуляр, предусматривающий увеличение поддержки за Megabrain.
Как плесень и его содержимое были большего объема, чем у единственного мозга в OCT плесень, чтобы заморозить мозг в изопентана требуется больше времени. Путем проб и ошибок была определена продолжительность времени, что качество хорошее замораживания (3,5 минут). Megabrain можно оставить в изопентана дольше; Однако, температура должна оставаться в диапазоне от-45 ° C до 50 ° C до избежать растрескивания центра развертывания Office.
Поскольку существует множество отдельных кусков ткани на слайде Megabrain, вполне возможно, что ткани могут высохнуть и поэтому становятся более хрупкими во время чистки шаги. Для борьбы с этой проблемой, капля PBS следует положить на каждой секции индивидуальных мозга держать его влажной до тех пор, пока его щеткой из.
Методика hemisecting мозга, для проведения исследования, в которых это необходимо, имеет решающее значение для получения хороших результатов. Когда hemisecting мозга, важно, что эта Биссектриса делается именно для того, чтобы убедиться, что все регионы мозга нетронутыми с правильным полушария. Если мозжечка или обонятельной луковицы не относятся к исследованию, они могут быть удалены. Удаление этой «излишки» ткани уменьшает количество ткани, которые должны быть обрезаны, когда cryosectioning. Удаление мозжечка позволяет мозги, чтобы более легко встать в центре развертывания Office перед замораживанием.
Хотя время щеткой из, держите разделов ткани от края слайда. Это позволяет номер для линии Пап пера, гидрофобный барьер, чтобы окружающие ткани, которая является требованием для некоторых протоколов иммуногистохимия. Кроме того Космос необходим для coverslip.
Если полушария/мозга падает или наклона во время замораживания Megabrain, секции не будет совместно строгального станка. Аналогичный результат может привести, если один мозг больше, чем другие, в одном Megabrain. Чтобы преодолеть это, более слайдов можно выбрать пятно, где в brain(s) находятся на соответствующей области интереса.
Одним ограничением этой методики является то, что, как все ткани замораживается в одном блоке Окт; Если есть технические ошибки, такие, как плохо заморозить из-за неправильной температуры, то ткани от нескольких животных будут затронуты (5-9 животных мозг вместо просто 1). Это больше проблем при использовании полностью мозга и не hemisected секции, потому что оставшиеся полушария могут быть заморожены и секционного отдельно для получения желаемого секций.
Еще одним ограничением этого метода является, что при корректировке криостата сократить Megabrain, наилучшего подхода должны быть приняты. Это объясняется все мозги на слегка различными углами друг к другу, в то время как эта проблема не возникает при резании сингулярно замороженного мозга. Последствия этого могут быть минимизированы во время замораживания путем обеспечения мозги вертикально и аналогичного размера.
Один из самых больших преимуществ, используя эту технику на сингулярно замораживания мозги, что это сокращает общее время, затраченное замораживания и резки мозги до 90%, если 9 сокращаются в том же темпе, как 1 мозга. Другим ключевым преимуществом этого метода является, что он позволяет меньшее количество слайдов, которые содержат ткани от требуемых животных, чтобы быть окрашены. Это увеличивает надежность и единообразие иммуногистохимическое окрашивание, так как все слайды окрашенных в том же раунде. Там может быть несоответствие между слайдами, окрашенных в то же время, но Megabrain может позволить несколько исследование мозги, чтобы быть представленными на одном слайде, таким образом уменьшая изменчивость и повышение обоснованности анализа. После последовательного окрашивание является ключевым преимуществом в любой гистологическое исследование и важное значение использования этого метода. И наконец меньше слайды также нести затраты на поставки.
Этот метод может быть легко модифицирован для резки сагиттальной секции грызунов мозга. Это также может быть адаптирована для использования в cryosectioning ткани из моделей различных животных и различных видов тканей, таких как мышцы или печени образцы. Адаптации к Протоколу должны быть сделаны, включая оптимизацию количество решений, размер лезвия криостата/сцены и объем внедрения плесень.
Этот метод также может быть адаптирована для свободного плавания методы, где протокол будет оставаться же до шаг 4.6. На этом шаге мозги необходимо быть отделены и поднял в отдельные лунках чтобы быть окрашены. Особую осторожность необходимо следить, чтобы не путать срезы мозга в процессе сортировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не раскрытия.
Acknowledgments
Фонды поддержки миссии PCH поддерживает исследования, о которых сообщалось в этой рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить Даниэль Гриффитс нашли изображения, используемые в цифрах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
