Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتجميد والفرع أنسجة المخ من الحيوانات متعددة كبديل للوقت لتجهيز العقول واحدة. هذا يقلل من تقلب المصبوغة أثناء إيمونوهيستوتشيميستري، ويقلل من الوقت كريوسيكتيونينج والتصوير.
Abstract
علم الأنسجة و immunohistochemistry هي الأساليب الروتينية من تحليل لتصور التشريح المجهري وترجمة البروتينات داخل الأنسجة البيولوجية. في علم الأعصاب، فضلا عن عدد كبير من المجالات العلمية الأخرى، تستخدم هذه التقنيات. يمكن أن يتم إيمونوهيستوتشيميستري على الشريحة التي شنت الأنسجة أو أقسام التعويم الحر. إعداد عينات محمولة على الشريحة عملية مكثفة وقت. البروتوكول التالي لتقنية، تسمى ميجابرين، تقليل الوقت الذي يستغرقه لانسجة المخ كريوسيكشن وجبل بنسبة تصل إلى 90% بالجمع بين العقول متعددة في كتلة واحدة مجمدة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب خفض التباين بين تلطيخ جولات، في دراسة histochemical كبيرة. وقد تم تحسين الأسلوب الحالي لاستخدام أنسجة الدماغ القوارض في تحليلات المناعي المتلقين للمعلومات؛ ومع ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على مختلف الميادين العلمية التي تستخدم كريوسيكتيونينج.
Introduction
نقدم هنا، البروتوكول المتعلق بأسلوب رواية، الذي نسميه ميجابرين، البلدان المتقدمة النمو إلى كريوسيكشن العقول القوارض متعددة في نفس الوقت للإجراءات المناعي المتلقين للمعلومات. ميجابرين يسمح لإنتاج شرائح مفردة تحتوي على الأنسجة من الحيوانات متعددة. وقد تم تحسين هذا الأسلوب قطع المقاطع الاكليلية من 9 الفئران الكبار نصفي الكرة الأرضية، أو 5 العقول الكاملة الكبار، في أن واحد. ولذلك، هذا الأسلوب الأكثر قابلية للتطبيق في الدراسات المناعي كبيرة أو تحليلات أخرى للقيام بذلك في أنسجة المخ مثبتة على شريحة من مجموعة كبيرة من الحيوانات.
إيمونوهيستوتشيميستري ينطوي على استخدام أجسام مضادة محددة موجهة ضد البروتينات ذات الأهمية لفهم ووصف التعبير والتغيرات الخلوية في أنسجة محددة1،،من23. استخدام immunohistochemistry السائد في أبحاث علم الأعصاب، فيما بين التخصصات العلمية الأخرى، تساعد في فهم الدماغ4الخلوية والجزيئية. يمكن أن تكون دراسات واسعة النطاق تشمل العديد من الحيوانات وأجزاء الدماغ كل من الموارد والوقت المكثف. على هذا النحو، هناك أساس منطقي متعددة الأوجه وراء تطوير ميجابراين: لتقليل الوقت المستهلك كريوسيكتيونينج، المتصاعدة، وتلطيخ الأنسجة، بينما استخدام الكواشف أقل وبالتالي. وعلاوة على ذلك، القدرة على تبسيط العملية ووصمة عار العقول متعددة في نفس الجولة يساعد على التخفيف من حدة بعض التفاوت بين تلطيخ دفعات، حد من إيمونوهيستوتشيميستري3. وباﻹضافة إلى ذلك، تقطيع ميجابرين هو بديل توفير وقت لتقطيع أدمغة القوارض المجمدة فرادى ويسمح بمقارنة سريعة للأنسجة بين الحيوانات أو حتى معاملة الفئات بتقنيات الفحص المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تحسين تقنية ميجابرين استخدام العقول الجامعة وهيميسيكتيد من الذكور البالغين C57Bl6 الفئران5والأحداث سبراغ داولي الجرذان والفئران سبراغ داولي الكبار التي كانت ترانسكارديالي perfused مع 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يتبع بارافورمالدهيد 4%6. ويمكن تحقيق نتائج مماثلة في السلالات الأخرى من الماوس وفار، وفي كلا الجنسين وفي مختلف الإعمار. الدراسة لتوليد البيانات لهذه المخطوطة تستخدم الفئران سبراغ داولي الأحداث ووافقت عليه لجنة الاستخدام ومؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة أريزونا، وكانت الحيوانات التجريبية يعتني بهم وفقا لدليل لرعاية واستخدام المختبرات 7من الحيوانات.
1-كريوبروتيكشن العقول Perfused
- ترانسكارديال الناجحة التالية نضح6، جمع6،الدماغ الكامل8 من الحيوانات وبعد إصلاح وضع في قنينة 25 مل من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني عن 24 ساعة.
تنبيه: بارافورمالدهيد مثبت أنسجة سامة؛ التعامل مع الرعاية. نقل بارافورمالدهيد إلى حاوية نفايات على وجه التحديد مسمى الذي يعرف به التركيز والحجم داخل غطاء الأبخرة كيميائية وثم الموظفين المدربين مخزن في النفاية الكيميائية مجلس الوزراء حتى يتم التخلص منها "السلامة الكيميائية" أو بشكل صحيح. - بعد مرور 24 ساعة، في غطاء دخان، إزالة العقول من بارافورمالدهيد 4% باستخدام ملعقة. نقل الدماغ في قنينة من حوالي 20 مل محلول السكروز 15% في 1 x تريس مخزنة المالحة (تبس) حتى الدماغ المصارف إلى أسفل القنينة (حوالي 24 ساعة).
- وفي أعقاب ذلك، نقل الدماغ لقنينة من حوالي 20 مل محلول السكروز 30% في x TBS 1، حتى الدماغ المصارف إلى أسفل القنينة (حوالي ح 24 – 48).
2. تجميد الدماغ
- ضع كوب زجاج 500 مل على سرير من الثلج الجاف دلو الجليد. صب الكأس الزجاج 300-400 مل إيسوبينتاني (الميثيل 2-البوتان).
- درجة الحرارة من إيسوبينتاني تصل إلى ما بين-45 درجة مئوية و-50 درجة مئوية. ترصد عن كثب والحفاظ على درجة الحرارة هذه بحرارة، إبقائها ثابتة طوال فترة الإجراءات. ضمان أن تؤخذ قراءات درجة الحرارة من الشرق من الحل، ولا بينما لمس أسفل أو الجانب الكأس.
- في benchtop، قم بملء المتاح تضمين العفن (انظر قائمة المواد) كامل حوالي 1/2 من "درجة الحرارة المثلى في قطع" (أكتوبر؛ انظر الجدول للمواد) مركب. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء في OCT. إذا كان هناك أي فقاعات الهواء بإزالتها مع ملعقة أو إبرة.
-
إزالة الدماغ الأولى من قنينة السكروز 30% مع ملعقة. عند هذه النقطة، أما تجميد كل العقول، أو هيميسيكت، اعتماداً على تصميم الدراسة.
- للعقول هيميسيكتيد، استخدام شفرة حلاقة جديدة لجعل قطع نظيفة من خلال الأنسجة لفصل في نصفي الكرة الأرضية. إذا كان غير مطلوب للدراسة، إزالة المخيخ والمصابيح شمي في هذه المرحلة. إذا كان المخيخ المسبق للدراسة، يقترح خفض مساحة مسطحة في نهاية الخلفي من الدماغ للمعونة في الدماغ في وضع الأمور في نصابها في القالب. إذا فقط يتطلب الدراسة أنسجة من منطقة محلية، يمكن استخدام مصفوفة الدماغ القوارض كتلة المخ استناداً إلى إحداثيات معروفة.
- إعطاء العقول رقمي تسمية النظام. رسم تخطيطي كما هو مبين في الشكل 1. كتابة عدد الدماغ الأولى لتوضع في القالب ميجابرين في موقف 2، تاركاً الموقف 1 كمساحة فارغة للمساعدة في سرعة تحديد التوجه الذي تم تجميد العقول.
- استخدام الملقط حادة أو الملقط، تلتقط الدماغ لوضعها في الموضع 1. توجيه الدماغ مع الجانب لقص الأولى التي تواجه صعودا. انخفاض استخدام الملقط تعديل موقفها حتى يقف الدماغ في OCT في الموقع المناسب، بشكل مستقل.
- كرر الخطوات من 2.3-2.5 للعقول/نصفي الكرة المتبقية، ستجمد في المواقف 3 – 10. تجنب تحديد المواقع العقول/نصفي الكرة الأرضية في تخطيط متناظرة.
- استعراض جميع العقول 9 في العفن ميجابراين. بمجرد العقول يقفون بشكل مستقل، منتصبا، وموجهاً توجيها صحيحاً في OCT (كما هو موضح في الشكل 2)، إضافة أكتوبر أكثر للقالب (حتى تغطي الجزء العلوي من العقول). مرة أخرى، تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء مرئياً في OCT.
- استخدام الملقط عقد ركن العفن، ضمان الملقط لا تصبح جزئيا غارقة في OCT (الشكل 3A). الحرص على الحفاظ على مستوى العفن، انخفاض العفن في إيسوبينتاني (-45 درجة مئوية إلى-50 درجة مئوية) حيث أن الجزء السفلي الثالث من العفن هو المغمورة. اضغط هنا للسماح لأي فقاعات في OCT لترتفع إلى السطح، وبعيدا عن الأنسجة (الشكل 3B).
- بعد 30 ق، أقل المغمورة العفن أسرة في إيسوبينتاني والإفراج عن الملقط، تاركاً في ميجابرين لمدة 3 دقائق على الأقل (الشكل 3). ضمان هذا العفن هو إبقاء المستوى، حتى تظل العقول تستقيم ومسافة واحدة (3D الشكل).
- بعد 3 دقائق، مضمنة استخدام الملقط لإزالة القالب الذي يتضمن المجمدة، أكتوبر العقول (رقم 3E) من إيسوبينتاني.
- على الفور، التفاف العفن ومحتوياته في رقائق الألومنيوم وتسميته بإعداد الحيوانات أو تحديد ميجابرين. اللمس ميجابرين المجمدة اقتصد قدر الإمكان لتجنب ذوبان الأنسجة.
- هذا ميجابرين يمكن الآن نقل إلى ثلاجة-20 درجة مئوية وتخزينها لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ويمكن تخزينها في ميجابرين مجمدة لحين كريوسيكتيونينج.
3-إعداد ميجابرين لتمزيقها على كريوستات
- تعيين درجة حرارة كريوستات مجلس الوزراء-19 درجة مئوية. تأكد من أن يتم التوصل إلى درجة الحرارة هذه قبل المتابعة. في جميع أنحاء تمزيقها، ضمان بقاء مجلس الوزراء درجة الحرارة بين-18 درجة مئوية و-20 درجة مئوية.
- تأخذ ميجابراين من الثلاجة-20 درجة مئوية، ووضعه في كريوستات. أيضا، ضع تشاك أبعاد الحجم المناسب، وفرشاة التلوين مقلوب رقيقة اثنين إلى كريوستات. ترك في ميجابراين وتشاك في كريوستات لمدة 15 دقيقة على الأقل للتوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
- على النحو المناسب تسمية الشرائح مع رقم التعريف ميجابرين ورقم الشريحة. وتكمن هذه الشرائح على شريحة أكثر دفئا (35 – 45 درجة مئوية).
- بسط ميجابرين من رقائق الألومنيوم. استخدام شفرة الحلاقة لقص زوايا العفن السماح بسهولة إزالة كتلة أكتوبر من العفن (الشكل 4 أ) عمودياً.
- الاستغناء عن طبقة رقيقة (حوالي 3 مم) من أكتوبر على تشاك.
- بسرعة، مع الحد الأدنى من الاتصال بين الأصابع وفي أكتوبر، وضع في ميجابرين على تشاك، في الاتجاه المطلوب. يمكن أيضا استخدام الملقط الكبير لهذه الخطوة للحد من ذوبان الجليد. قبل أن تبدأ بالقسم، وإجازة في ميجابرين شنت تشاك في كريوستات لمدة 15 – 20 دقيقة للسماح OCT لتجميد تماما.
- مرة واحدة قد جمدت الطبقة الأساس لاكتوبر، تطبيق طبقة سميكة مم 2 أكتوبر حول جانبي ميجابرين والسماح بتشغيل لأسفل من الجانبين على تشاك هذا. وهذا يساعد على تأمين ميجابرين لتشاك. ومرة أخرى، قبل المتابعة، ترك تشاك ميجابرين التي شنت في كريوستات لمدة 15 – 20 دقيقة للسماح OCT لتجميد.
- استخدام شفرة حلاقة لإزالة أي أكتوبر الزائدة من الجانبين أو أسفل تشاك (الشكل 4 باء).
4-كريوسيكتيونينج ميجابرين
- قبل البدء، تأكد من كوب يحتوي على مالا يقل عن 20 برنامج تلفزيوني 1 x مل موجوداً.
- ضع تشاك، شنت مع ميجابراين، إلى رأس تشاك في كريوستات (الشكل 4 باء).
- تعيين كريوستات قطع في السمك المطلوب. تم تحسين المنهجية الحالية ميكرومتر 10 إلى 50 ميكرومتر المقاطع.
- تقليم OCT والأنسجة حسب الحاجة للوصول إلى منطقة الدماغ المطلوبة لجمع الأنسجة (الشكل 4).
- عندما تصبح جاهزة لجمع الأنسجة وانخفاض لفة المضادة اللوحة ثم ضعه على المسرح ودورة مؤشر كريوستات لتأخذ مقطع واحد. ببطء رفع قبالة لوحة لفة المضادة، مع الحرص على أن ميجابرين مقطعة لا تعلق على لوحة لفة المضادة ولا تقع قبالة المرحلة رقم 4).
- بلطف استخدام فرشاة التلوين لإلغاء المقطع ميجابرين حتى أنه هو الاستلقاء على مرحلة كريوستات (الشكل 5A). (إذا لزم الأمر،، أن يعقد في أكتوبر مسطحة باستخدام فرشاة التلوين منع المتداول).
- إزالة شريحة من الشرائح الأكثر دفئا وتحوم الشريحة، الملصق أسفل، فوق المقطع ميجابرين في مرحلة السماح للقسم عصا على الشريحة.
- بسرعة تطبيق قطره 1 x برنامج تلفزيوني لكل قسم الأنسجة على الشريحة ولا تسمح هذه لتجف حتى يكون قد نحي مسطحة (راجع الخطوة 4.9).
- استخدام الرسام مقلوب غرامة انخفضت في برنامج تلفزيوني 1 x فرشاة خارج أي فقاعات في الأنسجة، وتتكشف الأنسجة حيث أنه هو الاستلقاء على الشريحة (الشكل 5 (ب)). الحرص على عدم تغيير موقف أجزاء الدماغ وهكذا تفقد الوضع النسبي للمقاطع الأخرى في الأنسجة. معالجة الأنسجة بعناية لتجنب الدموع. إبقاء أبواب الدماغ بعيداً عن الحواف الشريحة، مطلوب مساحة هامشية ساترة وتطبيق القلم PAP في بعض البروتوكولات المصبوغة.
- ضع الشريحة مرة أخرى على الشريحة الأكثر دفئا والجافة عن 45 دقيقة الغطاء حسب الحاجة لمنع الغبار من تسوية في الأنسجة. وبمجرد جفاف، تخزين الشرائح في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتيجة نهاية إيجابية لهذا الإجراء هي الأنسجة التي تقع الشقة على الشريحة، مع عدم وجود فقاعات أو الدموع، في الاتجاه الذي كانت قد جمدت. أقسام الأنسجة متباعدة بالتساوي عن بعضها البعض ويمكن تحديدها بسهولة بسبب موضع جيد للدماغ في OCT وتدوين جيدة كما يتبين في الشكل 1. افتراض أن أنسجة المخ وجمعت من حيوانات سن مماثلة، وأن تمت محاذاة الأنسجة بشكل صحيح في OCT، ينبغي أن تمثل الأجزاء التي تم جمعها على شريحة طائرة الاكليلية مماثلة، مما يتيح المقارنة بين مناطق الدماغ بين الحيوانات. شريطة أن تجمد الأنسجة أيضا، مع قطعة أثرية تجميد الحد الأدنى، يمكن أن تنفذ وصمة عار ح & ه لتقييم جودة كريوبروتيكتيون9. يمكن القيام إيمونوهيستوتشيميستري كما هو موضح تلطيخ هو مبين في الشكل 6.
رقم 1: مخطط الممثل لتخطيط ميجابراين المقترحة. ويبين هذا التدوين موقف من الأنسجة المستمدة من الحيوانات المختلفة 9. تم تصميم نظام رقم كما هو موضح؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أي نظام الترقيم. 'X' هو الممثل لمساحة فارغة مصممة لتظهر بوضوح الاتجاه الذي تم تجميد الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: وضع بشكل صحيح وصحيح العقول في العفن. (أ) الدماغ نصفي الكرة الأرضية سيئة الانحياز في أكتوبر من الأعلى والجانب. (ب) الدماغ جيدا الانحياز نصفي الكرة في أكتوبر من الأعلى والجانب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: المراحل من تجميد الدماغ. (أ) ميجابراين قبل يجري المغمورة في إيسوبينتاني-45 درجة مئوية. (ب) ميجابرين عندما غرق في إيسوبينتاني. (ج) ميجابراين مغمورة تماما في إيسوبينتاني. (د) ميجابرين التي خفضت في إيسوبينتاني، مما يدل على أن العقول يجب أن تبقى منتصبة ومسافة واحدة من بعضها البعض خلال هذه العملية. (ﻫ) ميجابرين A المجمدة في العفن تضمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مفتاح المراحل في قطع ميجابرين. ميجابرين (A) يتم إزالتها من تضمين العفن في كريوستات. تشاك (ب) شنت مع ميجابرين. (ج) تقسيم ميجابراين. (د) ميجابراين القسم في مرحلة كريوستات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: قسم ميجابرين ما قبل وما بعد شنت. ميجابراين المجمدة (أ) الفرع (40 ميكرومتر) في مرحلة كريوستات. (ب) شنت الشريحة الزجاجية مع الأنسجة ميجابرين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إيمونوهيستوتشيميستري لشريحة ميجابرين ملطخة Iba1. (أ) الأنسجة المأخوذة من ميجبراين يظهر تلطيخ بين العقول المختلفة في دراسة موحدة. عرض متسقة المتأين الصور المجهرية 20 x (ب) مأخوذة من الحقل (S1BF) البرميل somatosensory منطقة قشرة الدماغ المحملة كل جزيء محول ربط الكالسيوم 1 (Iba1) تلطيخ من microglia بين العقول. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فإنه ينبغي النظر في أثناء هذا الإجراء أنه يجب باستمرار رصد درجة الحرارة في ميجابرين والمناطق المحيطة بها لمنع ذوبان الجليد وإعادة تجميد الأنسجة. المخ يمكن فقط إزالة من الثلاجة-20 درجة مئوية تصل إلى 3 مرات ككل مرة أنه لمس واليسار في كريوستات، مع درجة حرارة أدفأ متقلبة، الأنسجة يذوب وريفريزيس، مما تسبب جيلي مثل النسيج و سلامة أنسجة غير طبيعية10. ولذلك، فمن الأمثل قطع ميجابراين في كل مرة.
تثبيت الأنسجة وكريوبروتيكشن هي الأجزاء الرئيسية من هذا البروتوكول التقليل من تشكيل كريستال الجليد، والحد من نمو الميكروبات الخارجية، ووقف التفاعلات الانزيمية، وبالتالي المحافظة على سلامة الأنسجة10. إذا كانت العقول غير كريوبروتيكتيد مع السكروز، ثم الماء داخل الأنسجة يمكن أن تشكل بلورات الثلج أثناء عملية التجميد، الذي اجاد في الأنسجة ويسبب ثقوب للنموذج. في حين أننا نقترح تخفيف المسلسل السكروز في تبس، يمكن وضع العقول مباشرة في السكروز 30% لفترة طويلة (48-72 ساعة) لتحقيق كريوبروتيكشن مماثلة. ومع ذلك، المستحسن جداً أن تصنع حلول السكروز مع "الاختلافات tbs." مثل استخدام برنامج تلفزيوني أو المياه سيؤدي إلى سوء كريوبروتيكتيون ميجابراين ونوعية الأنسجة الفقيرة. وصمة عار (H & E) Haematoxylin وويوزين يمكن استخدامها لتقييم نوعية كريوبروتيكشن وما يترتب عليها من تجميد قطعة أثرية11. نوعية الأنسجة الجيدة (مع الحد الأدنى من ثقوب) أمر أساسي في دراسات نسيجية كما يمكن تعطيل الثقوب الربط من الأجسام المضادة، فضلا عن الحد من سلامة الأنسجة من الخلايا مع العمليات الدقيقة، التي يمكن أن تؤثر على تحليل بعض البقع. تجنب التنسيب متناظرة من العقول، وهذا يمكن أن يسبب الارتباك عندما تحاول التعرف على الحيوان الذي حصل على كل الدماغ.
وقد تم تحسين الأسلوب الحالي للأقسام الاكليلية؛ بيد أنه يمكن بسهولة تكييف قطع المقاطع السهمي وعرضية. سوف تتطلب هذه التعديلات خفض تباين مناسبة لموضع الدماغ في خطوات 2.5 من خلال 2.7. تجدر الإشارة إلى أن هذه أدابتيونس قد يقلل من عدد العقول التي يمكن أن تندرج في واحدة العفن التضمين.
تعديل رئيسية لهذا الأسلوب هي المساحة الفارغة في الموضع رقم 1 (كما هو موضح في الشكل 1). تم تصميم هذه المساحة السماح بسهولة تحديد اتجاه ميجابرين، وتحديد ذلك الحيوان المرتبطة بكل الدماغ.
تم تعديل هذا الأسلوب للسماح للأنسجة من عدد أكبر من الحيوانات تجميد وخفض في الوقت نفسه في ميجابراين. حجم الدماغ القوارض فتعتمد على الجنس والعمر والأنواع؛ يمكن أن يختلف عدد العقول التي تناسب في القالب. لا ينصح للفصل بين مختلف الإعمار، والجنسين، أو مجموعات العلاج في ميجابرينس منفصلة. على الرغم من أن هذا يمكن ضمان اتساق حجم، قد أيضا زيادة التحيز وعدم الموضوعية أثناء التصوير والتحليل. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حتمية للفرق بين الشرائح أثناء إيمونوهيستوتشيميستري في أي بروتوكول، الذي يمكن أن يؤدي إلى عدم تناسق المصبوغة بين الفئات العمرية ونوع الجنس.
تشاك مستطيلة، أكبر استخدمت، بدلاً من أحد تعميم، الذي يوفر الدعم المتزايد وراء ميجابرين.
كما العفن ومحتوياته ذات حجم أكبر من ذلك الدماغ المفرد في العفن OCT، كان يطلب مزيدا من الوقت تجميد الدماغ في إيسوبينتاني. من خلال التجربة والخطأ، عازمة طول المدة التي تقدم نوعية جيدة تجميد (3.5 دقيقة). يمكن أن تترك في ميجابراين في إيسوبينتاني لفترة أطول؛ ومع ذلك، يجب أن تبقى درجة الحرارة في النطاق من-45 درجة مئوية إلى-50 درجة مئوية لتفادي تكسير OCT.
كما أن هناك العديد من قطع منفصلة من الأنسجة على الشريحة ميجابرين، فمن الممكن أن الأنسجة يمكن أن تجف ونتيجة لذلك أصبحت أكثر هشاشة خلال الخطوات الفرشاة. ولمكافحة هذه المشكلة، ينبغي أن توضع قطره من برنامج تلفزيوني على كل قسم الدماغ الفردية الاحتفاظ بها رطبة حتى أنه نحي بها.
تقنية هيميسيكتينج الدماغ، لدراسة فيه وهذا المطلوب، أمر حاسم للحصول على نتائج جيدة. عندما هيميسيكتينج الدماغ، فمن المهم أن يتم هذا التنصيف تحديداً للتأكد من جميع مناطق الدماغ سليمة مع الكرة الصحيحة. إذا كان المخيخ أو المصابيح شمي ليست ذات صلة بالدراسة، يمكن إزالتها. إزالة هذا النسيج 'الزائدة' يقلل من كمية الأنسجة التي ستحتاج إلى يتم اقتطاعها عند كريوسيكتيونينج. إزالة المخيخ يسمح العقل المدبر الوقوف بسهولة أكبر في أكتوبر قبل التجميد.
بينما يجري نحي بها، إبقاء أبواب الأنسجة بعيداً عن الحافة الشريحة. وهذا ما يسمح غرفة لخط القلم PAP، حاجز مسعور، لتحيط الأنسجة، وهو شرط لبعض البروتوكولات إيمونوهيستوتشيميستري. بالإضافة إلى ذلك، الحاجة إلى الفضاء ساترة.
إذا تقع نصف الكرة الغربي/الدماغ أو يميل خلال ميجابراين تجميد، ثم الفروع لن يكون استواء المشارك. يمكن أن يؤدي إلى نتائج مماثلة إذا كان الدماغ واحد أكبر من الآخرين في ميجابرين واحد. للتغلب على هذا، يمكن تحديد المزيد من الشرائح وصمة عار حيث يتم brain(s) في السؤال في المنطقة المناسبة للفائدة.
واحد الحد من هذا الأسلوب أن كل من الأنسجة تجميد في كتلة واحدة من أكتوبر؛ إذا كان هناك خطأ تقني، مثل تجميد سيئة إلى درجة حرارة غير صحيحة، ثم الأنسجة من الحيوانات متعددة ستكون المتضررة (5-9 أدمغة الحيوانات بدلاً من 1 فقط). هذا أكثر من مشكلة عند استخدام الدماغ كاملة وليس مقاطع هيميسيكتيد، لأنه يمكن تجميد نصف الكرة الأرضية المتبقية ومقطوع منفردة للحصول على المقاطع المطلوبة.
قيد آخر لهذا الأسلوب أن عند ضبط كريوستات قطع في ميجابرين، يجب أن تؤخذ بنهج أنسب. ويرجع جميع العقول في زوايا مختلفة قليلاً إلى أحد آخر، في حين أن هذه ليست مشكلة عند تقطيع المخ متفرد مجمدة. يمكن التقليل من آثار هذا أثناء التجميد بضمان العقول تستقيم وذات حجم مماثل.
واحدة من أكبر الفوائد من استخدام هذا الأسلوب على تجميد العقول متفرد أنه يقصر الوقت الإجمالي أنفاق التجميد والعقول خفض نسبة تصل إلى 90%، إذا قطع 9 بنفس الوتيرة كالدماغ 1. ميزة رئيسية أخرى لهذا الأسلوب هو أنه يسمح لعدد أصغر من الشرائح التي تحتوي على الأنسجة من الحيوانات المطلوبة ليكون ملون. هذا يزيد من موثوقية واتساق المناعي تلطيخ، منذ ملطخة كافة الشرائح في الجولة نفسها. يمكن أن يكون هناك تناقض بين الشرائح الملون في نفس الوقت، ولكن يمكن أن تسمح ميجابرين العقول الدراسة عدة أن تكون ممثلة على شريحة واحدة، وبالتالي الحد من تقلب وزيادة صلاحية التحليل. بعد تلطيخ يتفق ميزة أساسية في أي دراسة نسيجية وله أهمية كبرى لاستخدام هذا الأسلوب. وأخيراً، تتحمل أقل الشرائح أيضا انخفاض تكاليف الإمدادات.
هذا الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة لقطع المقاطع السهمي الدماغ القوارض. كما يمكن تطويعها للاستخدام في كريوسيكتيونينج الأنسجة من نماذج حيوانية مختلفة وأنواع مختلفة من الأنسجة، مثل عينات العضلات أو الكبد. أدابتيونس إلى البروتوكول سوف يتعين القيام بها، بما في ذلك الاستغلال الأمثل لكمية الحلول المستخدمة، وحجم كريوستات بليد/المرحلة، وحجم العفن التضمين.
هذا الأسلوب يمكن أيضا تكييف التقنيات التعويم الحر، حيث تظل نفس البروتوكول حتى الخطوة 4.6. في هذه الخطوة، ستحتاج العقول فصلها ورفعت في آبار لوح منفصل يكون ملون. الرعاية الإضافية سوف تحتاج إلى مراعاة عدم الخلط بين شرائح المخ في عملية الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف.
Acknowledgments
PCH بعثة دعم صناديق دعم البحث عنها في هذه المخطوطة. الكتاب يود أن يشكر غريفيث دانيال لأخذ الصور المستخدمة في هذه الأرقام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
