Summary
在这里, 我们提出一个协议, 冻结和切片的大脑组织从多个动物作为一个玩意替代处理单一的大脑。这减少了免疫组化过程中的染色变异性, 减少了时间 cryosectioning 和成像。
Abstract
组织学和免疫组化是常规的分析方法, 以可视化显微解剖和本地化蛋白质在生物组织。在神经科学, 以及其他科学领域, 这些技术被使用。免疫组化可以做在幻灯片上的组织或自由浮动部分。准备幻灯片安装的示例是一个时间密集型的过程。以下技术的协议, 称为 Megabrain, 减少了 cryosection 和安装大脑组织的时间高达 90%, 通过结合多个大脑到一个单一的冰冻块。此外, 这种技术减少了染色回合之间的变异, 在一个大的组织化学研究。在下游免疫组化分析中, 利用啮齿动物脑组织对现有技术进行了优化;然而, 它可以应用到不同的科学领域, 使用 cryosectioning。
Introduction
在这里, 我们提出了一种新方法的协议, 我们称之为 Megabrain, 发展为 cryosection 多鼠大脑同时为下游免疫组化程序。Megabrain 允许生产含有多种动物组织的单张幻灯片。这项技术已被优化, 以切割冠状部分从9成年大鼠半球, 或5成人全脑, 同时。因此, 该技术最适用于大型免疫组化研究或其他分析, 对从一大群动物的幻灯片安装的脑组织进行。
免疫组化涉及使用特定的抗体针对感兴趣的蛋白质, 以了解和表征其表达和细胞变化的特定组织1,2,3。免疫组化的应用在神经科学研究中普遍存在, 在其他科学学科中, 帮助对大脑的细胞和分子的理解4。涉及许多动物和脑部的大规模研究可以是资源和时间密集型的。因此, Megabrain 的发展有多方面的理由: 减少花 cryosectioning、安装和染色组织的时间, 同时使用较少的试剂。此外, 在同一回合中简化过程和染色多个大脑的能力有助于缓解染色批次之间的一些变异性, 这是免疫组化3的局限性。此外, 切片 Megabrain 是一个节省时间的替代品切片单个冰冻啮齿动物的大脑, 并允许快速比较的组织之间的动物, 甚至治疗组的显微技术。
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Protocol
用1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 对雄性成年 C57Bl6 小鼠5、幼年大大鼠和成年 Megabrain 大大鼠进行了全脑和 hemisected 的优化。4% 多聚甲醛6。在两性和不同年龄的老鼠和老鼠的其他品系也可以取得类似的结果。为这篇手稿生成数据的研究使用了大鼠, 并获得了亚利桑那大学机构动物保育和使用委员会的批准, 并根据实验室的护理和使用指南对实验动物进行了照顾。动物7。
1. 抗冻脑灌注
- 成功的 transcardial 灌注6, 收集完整的大脑6,8从动物和后修复通过放置到一个25毫升瓶4% 多聚甲醛在 PBS 为 24 h。
注意: 多聚甲醛是一种有毒的组织固定剂;小心处理。将多聚甲醛转移到一个专门标记的废物容器中, 在化学油烟机中识别其浓度和体积, 然后贮存在化学废物柜中, 直到化学安全或训练有素的人员处置为止。 - 24小时后, 在一个油烟机, 删除大脑从4% 多聚甲醛使用铲。将大脑转移到大约20毫升的15% 蔗糖溶液中, 在1x 的三缓冲盐水 (tb), 直到大脑下沉到瓶子的底部 (约24小时)。
- 在此之后, 将大脑转移到大约20毫升30% 蔗糖溶液的小瓶, 在 1x tb, 直到大脑下沉到瓶子的底部 (大约 24–48 h)。
2. 脑冷冻
- 将500毫升的玻璃烧杯放在冰桶里干冰的床上。将300–400毫升的异戊烷 (2 甲基丁烷) 倒入玻璃烧杯中。
- 允许异戊烷的温度达到摄氏-45 摄氏度和-50 摄氏度之间。用温度计密切监视和保持这个温度范围, 保持它在整个过程中的恒定。确保从溶液中间取出温度读数, 而不是触摸烧杯的底部或侧面。
- 在台式上, 填充一个一次性嵌入模具 (见材料清单) 约1/2 充分的最佳切削温度 (OCT; 见材料表) 化合物。确保 OCT 中没有气泡。如果空气中有气泡, 用刮刀或针将其移走。
-
将第一个大脑从30% 个蔗糖瓶中取出一把刮刀。在这一点上, 要么冻结大脑整体或 hemisect, 取决于研究设计。
- 对于 hemisected 的大脑, 使用新的剃刀刀片, 使一个干净的切割通过组织, 以分离的半球。如果没有必要的研究, 删除小脑和嗅觉灯泡在这个阶段。如果小脑是需要进行的研究, 建议在大脑后端切开一个平坦的区域, 以帮助大脑站立在模子里直。如果这项研究只需要一个局部区域的组织, 一个啮齿动物的大脑矩阵可以用来阻止大脑的基础上已知的坐标。
- 给大脑一个数字命名系统。绘制图, 如图 1所示。将第一个大脑的数量写在位置2的 Megabrain 模具中, 将位置1作为空白, 以帮助快速识别大脑被冻结的方向。
- 使用钝钳或镊子, 拿起大脑放置在位置1。将大脑与侧面切开, 首先朝向向上。将大脑放在合适的位置, 用镊子调整其位置, 直到它独立站立。
- 重复步骤2.3–2.5 为剩余的大脑/半球被冻结的位置3–10。避免在对称布局中定位大脑/半球。
- 检查 Megabrain 模具中的所有9个大脑。一旦大脑独立, 直立, 并正确地定位在 OCT (如图 2B所示), 添加更多的 oct 到模具 (直到大脑的顶部被覆盖)。再次, 确保 OCT 中没有可见气泡。
- 使用镊子保持模具的角落, 确保镊子不会成为部分淹没在 OCT (图 3A)。小心保持模具水平, 降低模具进入异戊烷 (-45 °c 至 50°c), 使模具底部第三个淹没。在这里保持它, 允许任何在 OCT 的气泡上升到表面和远离组织 (图 3B)。
- 三十年代后, 将整个模具降低到异戊烷中, 并从镊子中释放, 使 Megabrain 淹没至少3分钟 (图 3C)。确保模具保持水平, 使大脑保持直立和等距 (图 3D)。
- 3分钟后, 使用镊子从异戊烷中取出含有冰冻的 OCT 嵌入大脑的模具 (图 3E)。
- 立即将模具及其内容包装在铝箔上, 用动物编号或 Megabrain 标识标明。尽量少接触冷冻 Megabrain, 以免解冻组织。
- 这个 Megabrain 现在可以转移到一个-20 °c 冰箱和存储至少24小时。
注意: 协议可以在这里暂停, Megabrain 可以存储在 cryosectioning 发生之前冻结。
3. 准备 Megabrain 切片恒温器
- 将恒温器的机柜温度设置为-19 摄氏度。请确保在继续之前达到此温度。贯穿切片, 确保橱柜温度保持在-18 摄氏度和-20 摄氏度之间。
- 把 Megabrain 从-20 °c 冷藏库放进恒温器。另外, 放置一个适当尺寸尺寸的恰克, 和两个薄的倾斜画笔进入恒温器。离开 Megabrain 和恰克在恒温器至少15分钟来温度的恒温器。
- 使用 Megabrain 标识号和幻灯片编号适当地标记幻灯片。将这些幻灯片放在较暖和的幻灯片上 (35–45°c)。
- 从铝箔上打开 Megabrain。使用剃刀刀片垂直切割模具的角落, 让从模具容易删除的 OCT 块 (图 4A)。
- 将 OCT 的薄层 (大约3毫米厚) 放到恰克上。
- 快速, 在手指和 OCT 之间的最小接触, 把 Megabrain 在恰克, 在所需的方向。大钳也可用于这一步骤, 以尽量减少解冻。在开始节之前, 将 Megabrain 装入的卡盘留在恒温器中以 15–20 min, 以允许 OCT 完全冻结。
- 一旦 OCT 的基层冻结, 在 Megabrain 的两侧应用一个2毫米厚层的 OCT, 并允许它从两侧向下运行到恰克。这有助于保护 Megabrain 到恰克。再次, 在继续之前, 离开 Megabrain 安装恰克在恒温器为15–20分钟允许 OCT 冻结。
- 使用剃刀刀片从恰克的两侧或底部删除任何多余的 OCT (图 4B)。
4. Cryosectioning Megabrain
- 在开始之前, 确保装有至少20毫升 1x PBS 的烧杯可以访问。
- 将恰克安装在 Megabrain 上, 放入恒温器上的卡头 (图 4B)。
- 将恒温器设置为在所需的厚度处剪切。目前的方法已经优化了10µm 到50µm 节。
- 根据需要修剪 OCT 和组织以到达所需的大脑区域以进行组织收集 (图 4C)。
- 当准备收集组织, 降低反卷板, 直到它休息在舞台上, 并打开恒温器手柄采取一个单一的部分。慢慢地抬起防卷板, 小心, 切片 Megabrain 不附着在防卷板上, 不脱落的舞台图 4D)。
- 轻轻地使用画笔展开 Megabrain 节, 直到它在恒温器舞台上平躺 (图 5A)。(如有需要, 使用画笔来控制 OCT 平面以防止滚动)。
- 从幻灯片中删除幻灯片, 然后将幻灯片、标签边向下悬停在舞台上的 Megabrain 节上, 允许该节粘贴到幻灯片上。
- 快速地将一滴 1x PBS 应用于幻灯片上的每个组织部分, 并且不允许它们干燥, 直到它们被刷平 (见步骤 4.9)。
- 使用一个细尖的画笔蘸在 1x PBS, 以刷出任何气泡在组织和展开的组织, 使它是平躺在幻灯片上 (图 5B)。注意不要改变脑部的位置, 从而失去相对位置的其他组织部分。小心操作纸巾以免流泪。将大脑部分远离幻灯片的边缘, 因为在某些染色协议中, 盖玻片和 PAP 笔应用程序需要外围空间。
- 将幻灯片放回幻灯片上, 使其干燥45分钟, 以防灰尘在组织上沉淀。干燥后, 将幻灯片保存在-80 摄氏度, 直到进一步使用。
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Representative Results
这个过程的一个积极的结果是, 组织是平的在幻灯片上, 没有气泡或眼泪, 在他们被冻结的方向。组织切片是均匀间隔和容易辨认, 由于良好的位置的大脑在 OCT 和良好的符号如图 1所示。假设大脑组织是从类似年龄的动物那里收集的, 并且该组织在 OCT 中正确排列, 那么在幻灯片上收集的部分应该代表一个类似的冠状平面, 允许动物之间的大脑区域进行比较。如果组织冻结良好, 冷冻工件最少, 可进行 H & E 染色, 以评估抗冻质量9。免疫组化可以进行, 如图 6所示的染色显示。
图 1: 建议的 Megabrain 布局的代表性图.这显示了来自9种不同动物的组织的位置表示法。数字系统的设计如所示;但是, 可以使用任何编号系统。"X" 代表空白空间, 旨在明确显示组织被冻结的方向。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在模具中正确定位大脑.(A) 在 OCT 中, 大脑半球的顶端和侧面差得很低。(B) 从顶部和侧面排列在 OCT 上的良好的大脑半球。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 大脑凝固的阶段.(A) Megabrain 在被淹没在-45 °c 异戊烷之前。(B) Megabrain 淹没在异戊烷。(C) Megabrain 完全淹没在异戊烷。(D) Megabrain 被降为异戊烷, 表明大脑在这一过程中应保持直立并彼此等距。(E) 嵌入模具中的冻结 Megabrain。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 切割 Megabrain 的关键阶段.(A) Megabrain 从恒温器中嵌入模具。(B) 恰克安装了 Megabrain。(C) 修剪 Megabrain。(D) Megabrain 节恒温器阶段。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 前置和后装 Megabrain 部分.(A) 在恒温器阶段冻结 Megabrain 科 (40 µm)。(B) 装有 Megabrain 组织的玻璃滑梯。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 用 Iba1 染色的 Megabrain 滑块的免疫组化.(a) 从 Megbrain 中取出的组织在研究中显示不同大脑之间的均匀染色。(B) 从每个安装的大脑的体感桶场 (S1BF) 皮层区域拍摄的20x 显微图像, 显示出一致的电离钙结合适配器分子 1 (Iba1) 在大脑之间的小胶质细胞染色。刻度条 = 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
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Discussion
在这一过程中应考虑到 Megabrain 及其周围环境的温度必须不断监测, 以防止组织的解冻和再冷冻。大脑只能从-20 °c 冷冻库中除去, 每次被接触和留在恒温器, 随着温度的升高, 组织解冻和 refreezes, 导致果冻像质地和异常的组织完整性10。因此, 最好同时切断 Megabrain。
组织固定和抗冻是本议定书的关键部分, 以尽量减少冰晶形成, 减少外部微生物生长, 停止酶反应, 从而保持组织完整性10。如果大脑不 cryoprotected 蔗糖, 那么在冷冻过程中, 组织内的水就会形成冰晶, 从而粉碎组织, 形成空洞。虽然我们建议在稀释的蔗糖系列, 大脑可以直接放置在30% 蔗糖长时间 (48-72 小时), 以达到类似的抗冻。然而, 强烈建议, 蔗糖解决方案是用 tb. 如使用 PBS 或水将导致抗冻的 Megabrain 和组织质量较差。Haematoxylin 和伊红 (H & E) 染色可用于评估抗冻的质量和随后的冷冻工件11。良好的组织质量 (有极小的孔) 在组织学研究中是必不可少的, 因为孔可以破坏抗体的结合, 并减少细胞的组织完整性与精细的过程, 这可能会影响分析的一些污点。避免大脑的对称放置, 因为这可能会导致混淆, 当试图找出每一个大脑获得的动物。
目前的技术已被优化的日冕部分;然而, 它可以很容易地适应切割矢状和横断面。这些切割修改需要在步骤2.5 至2.7 中适当改变大脑的位置。应该指出的是, 这些 adaptions 可能会减少大脑的数量, 可以容纳一个嵌入的模具。
此技术的一个关键修改是位置号为1的空白空间 (如图 1所示)。这个空间的设计, 以便于识别的 Megabrain 方向, 因此确定与每个大脑相关的动物。
这项技术已被修改, 使组织从更大数量的动物被冻结, 同时削减在 Megabrain。因此, 啮齿动物的大脑大小取决于性别、年龄和物种;适合于模具的大脑数量可能会有所不同。不建议将不同年龄、性别或治疗组隔离为单独的 Megabrains。虽然这可以确保大小的均匀性, 它也可能增加偏见和主观性在成像和分析。此外, 在免疫组化期间, 在任何协议中, 幻灯片之间不可避免地存在差异, 这可能会导致年龄/性别群体之间的不一致。
一个长方形, 更大的恰克被使用了, 代替圆一个, 提供增加的支持在 Megabrain 之后。
由于霉菌和它的内容是一个更大的体积比一个单一的大脑在 OCT 模具, 需要更多的时间来冻结大脑在异戊烷。通过试验和误差, 确定了提供良好冷冻质量的时间长度 (3.5 分钟)。Megabrain 可以留在异戊烷更长的时间;然而, 温度必须停留在-45 °c 到50°c 范围内, 以避免开裂的 OCT。
由于 Megabrain 幻灯片上有许多单独的组织, 所以在刷牙的过程中, 组织可能会干燥, 从而变得更加脆弱。为了对付这个问题, 一滴 PBS 应该放在每个单独的脑部, 以保持它湿润, 直到它被刷掉。
hemisecting 大脑的技术, 对于这是必需的研究, 是取得良好结果的关键。当 hemisecting 大脑时, 重要的是, 这二分是为了确保所有大脑区域是完整的正确的半球。如果小脑或嗅觉灯泡与研究无关, 则可以将其移除。去除这个 ' 多余 ' 组织减少了需要修剪的组织的数量, 当 cryosectioning 时。摘除小脑可以让大脑在被冰冻之前更容易在 OCT 中站立。
当被刷出来, 保持组织部分远离幻灯片的边缘。这就允许了一排的 PAP 笔, 一个疏水屏障, 环绕组织, 这是一些免疫组化协议的要求。此外, 盖玻片还需要空间。
如果半球/大脑在 Megabrain 冰冻过程中跌倒或倾斜, 那么这些剖面将不会被共同刨去。一个类似的结果可能导致如果一个大脑比其他人在一个单一的 Megabrain。要克服这一点, 可以选择更多的幻灯片, 以着色的大脑 (s) 在适当的兴趣领域。
这项技术的一个限制是, 所有的组织被冻结在一个街区的 OCT;如果有技术上的错误, 例如由于温度不正确导致的严重冰冻, 那么来自多个动物的组织将受到影响 (5-9 只动物大脑而不是仅仅 1)。这是一个问题, 当使用全脑, 而不是 hemisected 部分, 因为剩余的半球可以被冻结和单独切片, 以获得所需的部分。
这种方法的另一个局限性是, 在调整恒温器以减少 Megabrain 时, 必须采取最佳的方法。这是由于所有的大脑在不同的角度, 而这不是一个问题时, 切片一个奇异的冰冻大脑。在冷冻过程中, 这种效果可以通过确保大脑的直立和类似的大小来减少。
使用这种技术超过冷冻大脑的最大好处之一是, 它缩短了冻结和削减大脑的总时间高达 90%, 如果9的切割速度与1的大脑相同。这项技术的另一个主要优点是, 它允许少量的幻灯片, 其中包含组织从所需的动物被染色。这增加了免疫组化染色的可靠性和一致性, 因为所有的幻灯片都在同一回合染色。在同一时间被染色的幻灯片之间可能有不一致, 但是 Megabrain 可以让几个研究大脑在一张幻灯片上表示出来, 从而减少变异并提高分析的有效性。具有一致的染色是任何组织学研究的一个关键优势和使用该技术的重要意义。最后, 较少的幻灯片也会导致较低的供应成本。
这项技术可以很容易地修改, 以切割的矢状切片的啮齿动物的大脑。它也可以用于 cryosectioning 组织从不同的动物模型和不同类型的组织, 如肌肉或肝脏样本。Adaptions 的协议, 包括优化所使用的解决方案的数量, 恒温器刀片/阶段的大小, 以及嵌入模具的体积。
这项技术也可适用于自由浮动技术, 在步骤4.6 之前, 议定书将保持不变。在这一步, 大脑将需要分开, 并被抬入单独的板块井, 以染色。需要格外小心, 不要混淆脑切片的排序过程。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
PCH 特派团支助基金支持本手稿中报告的研究。作者想感谢丹尼尔. 格里菲斯拍摄了数字中使用的图像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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