Samtidige Cryosectioning af flere gnaver hjerner

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at fryse og afsnit hjernevæv fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til forarbejdning enkelt hjerner. Dette reducerer farvning variabilitet under Immunhistokemi og reducerer tid cryosectioning og billedbehandling.

Abstract

Histologi og Immunhistokemi er rutinemæssige analysemetoder til at visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner inden for biologisk væv. I neurovidenskab, samt et væld af andre videnskabelige felter bruges disse teknikker. Immunhistokemi kan gøres på dias monteret væv eller frit svævende sektioner. Slide monterede prøver er en intensiv proces, tid. Følgende protokol for en teknik, kaldet Megabrain, reduceres den tid at cryosection og mount hjernevæv af op til 90% ved at kombinere flere hjerner i et enkelt frosne blok. Desuden, denne teknik nedsat variabilitet set mellem farvning runder, i en stor histokemiske undersøgelse. Den nuværende teknik er blevet optimeret til at bruge gnaver hjernevæv i downstream immunhistokemiske analyser; Det kan imidlertid anvendes til forskellige videnskabelige områder, der bruger cryosectioning.

Introduction

Vi præsenterer her, protokol for en roman metode, som vi kalder Megabrain, udviklet til at cryosection flere gnaver brains samtidig for downstream immunhistokemiske procedurer. En Megabrain giver mulighed for fremstilling af enkelt dias indeholdende væv fra flere dyr. Denne teknik er blevet optimeret til at skære koronale sektioner fra 9 voksen rotte halvkugler, eller 5 voksne fuld hjerner, samtidigt. Teknikken er derfor mest gældende i store immunhistokemiske undersøgelser eller andre analyser udført på dias-monteret hjernevæv fra en stor kohorte af dyr.

Immunhistokemi indebærer brug af specifikke antistoffer rettet mod proteiner af interesse at forstå og beskrive deres udtryk og cellulære ændringer i bestemte væv^1,2,3. Brugen af Immunhistokemi er udbredt i neuroscience research, blandt andre videnskabelige discipliner, medvirken i den cellulære og molekylære forståelse af hjernen⁴. Storstilede undersøgelser, hvor mange dyr og hjernen sektioner kan være både ressourcen og tiden intensivt. Der er således en mangesidig rationalet bag udviklingen af Megabrain: at reducere tid brugt cryosectioning, montering, og farvning væv, mens derfor bruge mindre reagenser. Desuden mulighed for at strømline processen og plette flere hjerner i samme runde hjælper med at afhjælpe nogle af variabiliteten mellem farvning partier, en begrænsning af Immunhistokemi³. Derudover skæring en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til skæring individuelle frosne gnaver hjerner og giver mulighed for hurtig sammenligning af væv mellem dyr eller endda behandlingsgrupper ved mikroskopi-teknikker.

Protocol

Megabrain teknikken er blevet optimeret ved hjælp af hele og hemisected hjerner fra mandlige voksne C57Bl6 mus⁵, juvenil Sprague-Dawley rotter og voksen Sprague-Dawley rotter, der var transcardially perfunderet med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) efterfulgt af 4% PARAFORMALDEHYD⁶. Lignende resultater kan opnås i andre stammer af mus og rotter, i begge køn og i forskellige aldre. Undersøgelse til at generere data til dette manuskript bruges juvenile Sprague-Dawley rotter og blev godkendt af University of Arizona institutionelle dyrs pleje og brug udvalget og forsøgsdyr blev plejet ifølge Guide For Care og brug af laboratorium Dyr⁷.

1. Cryoprotection af perfunderet hjerner

1. Følgende vellykket transcardial perfusion⁶, indsamle fuld hjernen^6,8 fra dyr og post løse ved at placere i et 25 mL hætteglas med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 24 timer.
   Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige væv fiksativ; håndterer med omhu. Overføre PARAFORMALDEHYD til et specifikt mærket spildbakken, der identificerer dets koncentration og volumen inde en kemisk stinkskab og derefter butikken i det kemiske affald kabinet indtil overdraget kemikaliesikkerhed eller ordentligt uddannet personale.
2. Efter 24 timer er gået, i et stinkskab, fjerne hjerner fra 4% PARAFORMALDEHYD ved hjælp af en spatel. Overføre hjernen i et hætteglas med ca. 20 mL 15% rørsukkeropløsning 1 x Tris-bufferet saltvand (TBS), indtil hjernen synker til bunden af hætteglasset (ca. 24 h).
3. Efter dette, skal du overføre hjernen til et hætteglas med ca. 20 mL 30% rørsukkeropløsning i 1 x TBS, indtil hjernen synker til bunden af hætteglasset (ca. 24 – 48 h).

2. brain indefrysning

1. Placer en 500 mL glas bægerglas på en seng af tøris i en isspand. Hæld 300-400 mL af isopentane (2-methyl-butan) i glas bægerglas.
2. Tillad temperaturen i isopentane at nå mellem-45 ° C og -50 ° C. Nøje overvåge og vedligeholde dette temperaturområde med et termometer, at holde det konstant under hele proceduren. Sikre at temperaturmålinger er taget fra midten af løsningen og ikke mens du rører bunden eller siden af bægerglasset.
3. Benchtop, Udfyld en engangs indlejring mold (Se materialer liste) ca 1/2 fuld af Optimal opskæring temperatur (okt; Se Tabel af materialer) sammensatte. Sikre, at der er ingen luftbobler i OLT. Hvis der er Fjern eventuelle luftbobler dem med en spatel eller nål.
4. Fjerne den første hjernen fra hætteglas med 30% saccharose med en spatel. På dette tidspunkt, fryser enten hjerner hele eller hemisect, afhængigt af undersøgelsen design.
   1. For hemisected hjerner, skal du bruge en ny barberblad for at gøre et rent snit gennem væv til at adskille halvkugler. Hvis ikke er nødvendige for undersøgelsen, fjerne lillehjernen og olfaktoriske pærer på dette stadium. Lillehjernen er nødvendig for undersøgelsen, er det foreslået for at skære et fladt område ved den bageste ende af hjernen til at støtte hjernen i stående lige i formen. Hvis undersøgelsen kun kræver væv fra et lokaliseret område, kan en gnaver hjernen matrix bruges til at blokere hjernen baseret på kendte koordinater.
5. Giv hjernen en numerisk navngivning system. Tegne et diagram som vist i figur 1. Skriv antallet af første hjernen skal placeres i Megabrain mold i position 2, forlader position 1 som en tom plads til støtte i hurtig identifikation af den orientering, hvor hjerner blev frosne.
6. Bruger stump tang eller pincet, afhente hjernen skal placeres i position 1. Orientere hjernen med side skal skæres først vender opad. Lavere hjernen i OLT i den korrekte placering, bruger pincet til at justere sin holdning, indtil det står uafhængigt.
7. Gentag trin 2,3-2,5 for de resterende hjerner/hjernehalvdele skal indefryses i positioner 3 – 10. Undgå at placere hjerner/hjernehalvdele i en symmetrisk layout.
8. Gennemgå alle 9 hjerner i formen Megabrain. Når hjernen stående uafhængigt, tilføje oprejst, og korrekt orienteret i OLT (som vist i figur 2B), flere OCT til formen (indtil toppen af hjerner er dækket). Igen, sikre, at der er ingen synlige luftbobler i OLT.
9. Bruge pincet til at holde hjørnet af mug, sikre pincet ikke blive delvist neddykket i OLT (figur 3A). Være omhyggelig med at holde niveauet skimmel lavere formen i isopentane (-45 ° C-50 ° C) så nederst tredjedel af formen er neddykket. Holde det her til at tillade nogen bobler i OLT til at stige til overfladen og fra væv (figur 3B).
10. Efter 30 s, lavere hele formen ind i isopentane og udgivelse fra pincet, forlader Megabrain nedsænket i mindst 3 min. (figur 3 c). Sikre at mug er holdt niveau, så hjerner forblive oprejst og ækvidistante (figur 3D).
11. Efter 3 min. integreret brug pincet til at fjerne skimmelsvamp indeholdende de frosne, OCT hjerner (figur 3) fra isopentane.
12. Straks, wrap formen og indholdet i aluminiumsfolie og mærke det med det animalske numre eller Megabrain identifikation. Tryk den frosne Megabrain så sparsomt som muligt for at undgå optøning i vævet.
13. Denne Megabrain kan nu overføres til en-20 ° C fryser og opbevares i mindst 24 timer.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her og på Megabrain kan opbevares i frossen stand indtil cryosectioning finder sted.

3. forberedelse af Megabrain til skæring på kryostater

1. Indstil kabinet temperaturen af kryostaterne til-19 ° C. Kontroller, at denne temperatur er nået før du fortsætter. Hele skæring, sikre at den tavletemperatur ◦c forbliver mellem 18 ° C og -20 ° C.
2. Tage Megabrain fra-20 ° C fryser og læg det i kryostaterne. Også, placere en chuck af passende størrelsesdimensioner og to tynde tippes pensler i kryostaterne. Forlade både Megabrain og chuck i kryostaten i mindst 15 min. at komme til temperaturen af kryostaterne.
3. Passende etiket dias med Megabrain id-nummer og diasnummeret. Læg disse dias på et dias varmere (35-45 ° C).
4. Udpakning Megabrain fra aluminiumsfolie. Bruge et barberblad til lodret skære hjørner af mold til nem fjernelse af blok i OLT fra mold (figur 4A).
5. Undvære et tyndt lag (ca 3 mm tyk) i OLT på chuck.
6. Hurtigt, med minimal kontakt mellem fingrene og OLT, placere Megabrain på chuck, i retningen ønskes. Store pincet kan også bruges til dette skridt til at minimere optøning. Før du begynder at afdeling, forlader Megabrain monteret chuck i kryostaten for 15-20 min at tillade OLT at fryse helt.
7. Når basislaget i OLT har frosset, anvende en 2 mm tykt lag OCT omkring sider af Megabrain og tillade dette at køre fra siderne på chuck. Dette hjælper med at sikre Megabrain til chuck. Igen, før du fortsætter, forlade Megabrain monteret chuck i kryostaten for 15-20 min at tillade OLT til at fryse.
8. Bruge et barberblad til at fjerne eventuelle overskydende OCT sider og bunden af chuck (figur 4B).

4. Cryosectioning Megabrain

1. Før du starter, sikre, at et bæger, der indeholder mindst 20 mL 1 x PBS er tilgængelige.
2. Placer chuck, monteret med Megabrain, ind i chuck hovedet på kryostater (figur 4B).
3. Indstille kryostaterne til at skære på den ønskede tykkelse. Den nuværende metode er blevet optimeret til 10 µm til 50 µm sektioner.
4. Trim OLT og væv som nødvendig for at nå den ønskede hjernen regionen for væv samling (figur 4 c).
5. Når du er klar til at indsamle væv, sænke den snitstrækkerpladen indtil det hviler på scenen og drej kryostaten håndtaget for at tage et enkelt afsnit. Langsomt løfte snitstrækkerpladen, være omhyggelig med at de sektioneret Megabrain ikke er knyttet til den snitstrækkerpladen og falder ikke ned fra scenen figur 4D).
6. Forsigtigt brug af pensler for at oprulle afsnittet Megabrain, indtil det liggende fladt på kryostater scenen (figur 5A). (Hvis det er nødvendigt, holde OLT flad ved hjælp af pensler til at forhindre rullende).
7. Fjern dias fra dias varmere og hover dias, labelsiden ned, over afsnittet Megabrain på scenen giver afsnittet for at holde sig til diaset.
8. Hurtigt anvende en dråbe af 1 x PBS til hver væv sektion på diaset og ikke tillader disse tørre, indtil de er blevet fejet flade (Se trin 4.9).
9. Brug en fin tippes pensel dyppet i 1 x PBS at børste ud nogen bobler i vævet og udfolde væv, så det ligger fladt på diaset (figur 5B). Passe på ikke at ændre placeringen af hjernen sektioner og dermed miste den relative position til afsnittene andre væv. Manipulere væv med forsigtighed for at undgå tårer. Holde hjernen sektioner væk fra kanterne af diaset, som perifere plads er påkrævet for en coverslip og PAP pen anvendelse i nogle farvningsprotokoller.
10. Placer slide tilbage i diaset, varmere og tør i 45 min. dækning som nødvendig for at forhindre støv fra afregning på væv. Når tør, skal du gemme diasene i ved-80 ° C indtil videre anvendelse.

Representative Results

Et positivt slutresultat til denne procedure er væv, der ligger fladt på diaset, med ingen bobler eller tårer, i den retning, som de var frosset. Væv sektioner er jævnt fordelt fra hinanden og let kan identificeres på grund af god placering af hjernen i OLT og god notation som vist i figur 1. Antages det, at hjernevævet blev indsamlet fra dyr af en lignende alder, og at vævet var korrekt justeret i OLT, skal sektioner indsamlet på et dias repræsentere et lignende koronale fly, tillader sammenligning af hjerneregioner mellem dyr. Forudsat at vævet er frosset godt, med minimal fryse artefakt, kan H & E pletten udføres for at vurdere cryoprotection kvalitet⁹. Immunhistokemi kan udføres som vist med farvning vist i figur 6.

Figur 1: repræsentative diagram af en foreslået Megabrain layout. Dette viser holdning notationen af væv fra 9 forskellige dyr. Antal system er designet som påvist; enhver nummereringssystem maa, dog anvendes. 'X' er repræsentant for den tomme plads, der skal klart vise retningen hvor vævet var frosset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: forkert og korrekt placeret hjerner i mug. (A) hjernen halvkugle dårligt justeret i OLT fra top og side. (B) godt justeret hjernen halvkugle i OLT fra top og side. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: faser af hjernen frysning. (A) Megabrain før at være neddykket i-45 ° C isopentane. (B) Megabrain når nedsænket i isopentane. (C) Megabrain neddykket fuldt i isopentane. (D) Megabrain bliver sænket til isopentane, viser, at hjerner bør holde sig oprejst og samme afstand fra hinanden under denne proces. (E) A frosne Megabrain i en indlejring skimmel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Key stadier i skære en Megabrain. (A) Megabrain bliver fjernet fra indlejring mug i kryostaten. (B) Chuck monteret med Megabrain. (C) klippede Megabrain. (D) Megabrain afdeling på kryostater scenen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: før og efter monteret Megabrain afsnit. (A) frosne Megabrain sektion (40 µm) på kryostater scenen. (B) glas dias monteret med Megabrain væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Immunhistokemi i et Megabrain dias farves med Iba1. (A) væv taget fra et Megbrain viser ensartet farvning mellem forskellige hjerner i en undersøgelse. (B) 20 x mikroskopiske billeder taget fra regionen somatosensoriske tønde felt (S1BF) cortex af hver monteret hjerne, viser konsekvent ioniseret calcium-bindende adapter molekyle 1 (Iba1) farvning af mikroglia mellem hjerner. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Det bør overvejes under denne procedure, at temperaturen i Megabrain og dens omgivelser skal overvåges konstant for at undgå optøning og re nedfrysning af væv. Hjernen kan kun fjernes fra-20 ° C fryser op til 3 gange som hver gang det er rørt og venstre i kryostaten, med en varmere svingende temperatur, vævet smelter og frigives, forårsager en gelé som tekstur og unormale væv integritet¹⁰. Derfor er det optimale til at skære af Megabrain alle på én gang.

Væv fiksering og cryoprotection er vigtige dele af denne protokol til at minimere is krystal formation, reducere eksterne mikrobiel vækst og stoppe enzymatiske reaktioner, dermed bevare væv integritet¹⁰. Hvis hjerner ikke er cryoprotected med saccharose, kan derefter vand inden for væv danne iskrystaller under frysning processen, som makulere væv og forårsage huller til form. Mens vi foreslå serielle fortyndinger af saccharose i TBS, kan hjerner placeres direkte i 30% saccharose i en længere periode (48-72 timer) at opnå lignende cryoprotection. Det anbefales dog stærkt at saccharose løsninger er lavet med TBS. variationer såsom anvendelse af PBS eller vand vil resultere i dårlig cryoprotection af Megabrain og dårlig væv kvalitet. Haematoxylin og Eosin (H & E) pletten kan bruges til at vurdere kvaliteten af cryoprotection og deraf følgende fryse artefakt¹¹. God vævet kvalitet (med minimal huller) er afgørende i histologiske undersøgelser som hullerne kan forstyrre bindingen af antistoffer samt reducere væv integriteten af celler med fine processer, som kan påvirke analysen af nogle pletter. Undgå symmetrisk placering af hjerner, da dette kan skabe forvirring, når de forsøger at identificere de dyr, som hver hjerne blev fremstillet.

Den nuværende teknik er blevet optimeret til koronale sektioner; Det kan dog nemt tilpasses skær sagittal og tværgående sektioner. Disse skæring ændringer vil kræve passende variation af hjernen placering i trin 2.5 gennem 2.7. Det skal bemærkes, at disse tilpasninger kan reducere antallet af hjernen, der kan passe ind i en indlejring skimmel.

En afgørende ændring af denne teknik er den tomme plads på positionsnummer 1 (som vist i figur 1). Denne plads er designet til at give nem identifikation af Megabrain orientering, og derfor identificere dyret tilknyttet hver hjerne.

Denne teknik er blevet ændret for at tillade væv fra et større antal dyr at være frosset og skar samtidigt i Megabrain. Størrelsen af den gnaver hjernen er afhængig af køn, alder og art derfor; antallet af hjerner, der passer i formen kan variere. Det tilrådes ikke at adskille forskellige aldre, køn eller behandlingsgrupper i separate Megabrains. Selv om dette kan sikre størrelse ensartethed, kan det også øge bias og subjektivitet i billedbehandling og analyse. Derudover er der uundgåelige afvigelsen mellem dias under Immunhistokemi i en protokol, som kunne føre til farvning uoverensstemmelse mellem grupper af alder/køn.

En rektangulær, større chuck blev brugt, i stedet for en cirkulær, som ydes øget støtte bag Megabrain.

Som formen og indholdet af en større volumen end en ental hjerne i en OCT skimmel, var mere tid forpligtet til at fryse hjernen i isopentane. Gennem trial and error, blev der fastsat en lang tid givet godt fryse kvalitet (3,5 minutter). Megabrain kan stå i isopentane i længere tid; men temperaturen skal bo i området-45 ° c til-50 ° C for at undgå revner OLT.

Da der er mange forskellige stykker af væv på Megabrain dias, er det muligt at væv kan tørre ud og derfor bliver mere skørt under de tandbørstning trin. For at bekæmpe dette problem, sættes en dråbe af PBS på hver enkelte hjernen sektion til at holde det fugtigt, indtil det er børstet ud.

Teknikken med hemisecting i hjernen, for en undersøgelse, hvor dette er påkrævet, er afgørende for at opnå gode resultater. Når hemisecting hjernen, det er vigtigt, at denne gennemskæring sker netop for at sikre, at alle områder af hjernen er intakt med den rigtige halvkugle. Hvis lillehjernen eller olfaktoriske pære ikke er relevante for undersøgelsen, kan de fjernes. At fjerne denne "overskydende" væv reducerer mængden af væv, der bliver nødt til at være trimmet når cryosectioning. Fjernelse af lillehjernen tillader hjerner til at stå mere let i OLT inden frysning.

Mens bliver børstet ud, holde afsnittene væv væk fra kanten af diaset. Dette giver plads til en linje af PAP pen, en hydrofobe barriere, at omgive det væv, som er et krav i nogle Immunhistokemi protokoller. Derudover er plads nødvendig for coverslip.

Hvis halvkugle/hjernen falder eller vipper under Megabrain frysning, vil så afsnittene ikke være co høvl. Et lignende resultat kan medføre, hvis en hjerne er større end de andre i en enkelt Megabrain. For at overvinde dette, kan flere dias vælges til at pletten, hvor de pågældende brain(s) er på det relevante område af interesse.

En begrænsning af denne teknik er, at alle væv er frosset i en blok af OLT; Hvis der er tekniske fejl, som en dårlig fryse på grund af en forkert temperatur, så væv fra flere dyr vil blive berørt (5-9 dyrenes hjerner i stedet for bare 1). Dette er mere et problem når du bruger fuld hjernen og ikke hemisected sektioner, fordi de resterende halvkugle kan frosne og sectioned enkeltvis for at opnå de ønskede sektioner.

En anden begrænsning til denne metode er, at når du justerer kryostaten for at skære i Megabrain, en passer bedst tilgang skal tages. Dette skyldes alle hjerner er på lidt forskellige vinkler med hinanden, mens dette ikke er et problem ved skæring i en ualmindeligt frosne hjerne. Virkningerne af dette kan minimeres under frysning ved at sikre hjerner er oprejst og af samme størrelse.

En af de største fordele ved hjælp af denne teknik over frysning hjerner ualmindeligt er, at det forkorter det samlede tidsforbrug frysning og skære hjerner med op til 90%, hvis 9 reduceres i samme tempo som 1 hjerne. Den andre afgørende fordel af denne teknik er, at det giver et mindre antal dias, der indeholder væv fra de krævede dyr til at være plettet. Dette øger pålideligheden og ensartethed af immunhistokemisk farvning, da alle dias farves i den samme runde. Der kan være uoverensstemmelse mellem dias farves på samme tid, men en Megabrain kan tillade flere undersøgelse hjerner til at være repræsenteret på et enkelt dias, således at reducere variation og øge validiteten af analysen. Har konsekvent farvning er en afgørende fordel i enhver histologisk undersøgelse og en stor betydning for at bruge denne teknik. Endelig, færre dias også pådrage lavere leveringsomkostninger.

Denne teknik kan let modificeret til opskæring sagittal sektioner af en gnaver hjerne. Det kunne også være tilpasset til brug i cryosectioning væv fra forskellige dyremodeller og forskellige typer af væv, såsom muskel eller leveren prøver. Tilpasninger til protokollen vil skulle gøres, herunder optimering af mængden af løsninger anvendes, størrelse af kryostaterne blade/fase, og mængden af formen indlejring.

Denne teknik kunne også være tilpasset til frit svævende teknikker, hvor protokollen ville forblive den samme indtil trin 4.6. På dette trin skal hjerner være adskilt og løftede i separat plade brønde til farves. Ekstra pleje skal tages for ikke at forvirre hjernen skiver i sorterings processen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065