Samtidiga kryosnitt av flera gnagare hjärnor

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att frysa och avsnitt hjärnvävnad från flera djur som en tidsbesparande alternativ till bearbetning enda hjärnor. Detta minskar färgning variabilitet under immunohistokemi och minskar tid kryosnitt och imaging.

Abstract

Histologi och immunohistokemi är rutinmässiga analysmetoder för att visualisera mikroskopisk anatomi och lokalisera proteiner inom biologisk vävnad. I neurovetenskap, samt en uppsjö av andra vetenskapliga områden används dessa tekniker. Immunohistokemi kan göras på bilden monterad vävnad eller friflytande sektioner. Förbereda bilden monterade prover är en dags intensiv process. Följande protokoll för en teknik, som kallas Megabrain, minskas den tid som upp till 90% till cryosection och montera hjärnvävnad genom att kombinera flera hjärnor i ett enda frysta block. Denna teknik minskar dessutom variabilitet sett mellan färgning rundor, i en stor histochemical studie. Den nuvarande tekniken har optimerats för att använda gnagare hjärnvävnad i nedströms immunhistokemiska analyser; dock kan det tillämpas olika vetenskapliga fält som använder kryosnitt.

Introduction

Här presenterar vi protokollet för en ny metod, som vi kallar Megabrain, framkallade till cryosection flera gnagare brains samtidigt för nedströms immunhistokemisk förfaranden. En Megabrain möjliggör produktion av enstaka bilder som innehåller vävnad från flera djur. Denna teknik har optimerats för att skära koronalt avsnitt från 9 vuxen råtta halvklot, eller 5 vuxna full hjärnor, samtidigt. Tekniken är därför mest tillämplig i stora immunhistokemiska studier eller andra analyser som gjort på bilden monterad hjärnvävnad från en stor kohort av djur.

Immunohistokemi innebär användning av specifika antikroppar riktade mot proteiner av intresse att förstå och karakterisera deras uttryck och cellförändringar i vävnad^1,2,3. Användning av immunhistokemi är utbredd inom neurovetenskap, bland andra vetenskapliga discipliner, medhjälp i cellulär och molekylär förståelse av hjärnan⁴. Storskaliga studier med många djur och hjärnan sektioner kan vara både resurser och tid intensivt. Som sådan, det är en mångfacetterad logiken bakom utvecklingen av Megabrain: att minska tid tillbringade kryosnitt, montering och färgning vävnad, medan följaktligen använder mindre reagenser. Dessutom möjligheten att effektivisera processen och fläcken flera hjärnor i samma runda hjälper till att lindra en del av variabiliteten mellan färgning partier, en begränsning av immunhistokemi³. Dessutom snittning en Megabrain är ett tidsbesparande alternativ till snittning enskilda frusna gnagare hjärnor och möjliggör snabb jämförelse av vävnaden mellan djur eller ens behandlingsgrupperna genom mikroskopi tekniker.

Protocol

Megabrain tekniken har optimerats med hela och hemisected hjärnor från manliga vuxna C57Bl6 möss⁵, juvenil Sprague-Dawley-råttor och vuxna Sprague-Dawley-råttor som var transcardially perfusion med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% PARAFORMALDEHYD⁶. Liknande resultat kan uppnås i andra stammar av mus och råtta, hos båda könen och i olika åldrar. Studien att generera data för detta manuskript används juvenil Sprague-Dawley-råttor och godkändes av University of Arizona institutionella djurens vård och användning kommittén, och experimentella djur var omhändertagna enligt Guide för the hand och användning av laboratorium Djur⁷.

1. Cryoprotection av perfunderade hjärnor

1. Följande framgångsrika transcardial perfusion⁶, samla in den fullständiga hjärna^6,8 från djur och efter fixa genom att placera en 25 mL injektionsflaska med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS för 24 h.
   Varning: PARAFORMALDEHYD är ett giftigt vävnad fixativ; hantera med försiktighet. Överför PARAFORMALDEHYD till en specifikt märkt avfallsbehållare som identifierar dess koncentration och volym inuti kemiska spiskåpa och sedan store i kemiska avfallet skåp tills omhändertas av kemikaliesäkerhet eller ordentligt utbildad personal.
2. När 24 h har förflutit i ett dragskåp, ta bort hjärnor från 4% PARAFORMALDEHYD med hjälp av en spatel. Överföra hjärnan en injektionsflaska med cirka 20 mL 15% sackaroslösning i 1 x Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) tills hjärnan sjunker till botten av flaskan (ca 24 h).
3. Efter detta överför hjärnan till en injektionsflaska med cirka 20 mL 30% sackaroslösning i 1 x TBS, tills hjärnan sjunker till botten av injektionsflaskan (cirka 24 – 48 timmar).

2. hjärnan frysning

1. Placera en 500 mL-glasbägare på en bädd av torr-is i en ishink. Häll 300 – 400 mL isopentan (2 metyl-butan) i en glasbägare.
2. Låt temperaturen på den isopentan att nå mellan-45 ° C och -50 ° C. Noga övervaka och behålla denna temperatur med en termometer, hålla den konstant under hela förfarandet. Se till att temperaturen avläses från mitten av lösningen och inte samtidigt som du rör undersidan eller på sidan av bägaren.
3. Fyll en disponibel inbäddning mögel på bänkmonterade, (se lista) ca 1/2 full av Optimal skärtemperatur (OCT; se Tabell för material) förening. Se till att det inte finns några luftbubblor i ULT. Om det finns bort eventuella luftbubblor dem med en spatel eller nål.
4. Ta bort första hjärnan från injektionsflaskan med 30% sackaros med en spatel. Vid denna punkt, frysa antingen hjärnor hela eller hemisect, beroende på studiedesign.
   1. För hemisected hjärnor, använda ett nytt rakblad för att göra ett rent snitt genom vävnaden att separera halvkloten. Om inte krävs för studien, bort lillhjärnan och luktsinnet lökar i detta skede. Om lillhjärnan är nödvändig för studien, föreslås det för att skära ett platt område på bakre ände hjärnan att hjälpa hjärnan att stå rak i formen. Om studien kräver endast vävnad från en lokaliserad region, kan en gnagare hjärnan matris användas för att blockera hjärnan baserat på kända koordinater.
5. Ge hjärnan en numerisk naming system. Rita ett diagram som visas i figur 1. Skriv antalet första hjärnan ska placeras i Megabrain mögel i position 2, lämnar position 1 som ett tomt utrymme till stöd i snabb identifiering av orientering där hjärnor frystes.
6. Med trubbig pincett eller pincett, plocka upp hjärnan att placeras i läge 1. Orient hjärnan med sidan som ska klippas första uppåt. Lägre hjärnan i ULT i lämplig plats, med pincetten för att justera dess position tills det står självständigt.
7. Upprepa steg 2,3 – 2.5 för de återstående hjärnor/hjärnhalvorna skall frysas i positionerna 3 – 10. Undvik att placera hjärnor/halvklot i en symmetrisk layout.
8. Granska alla 9 hjärnor i Megabrain mögel. När hjärnan står självständigt, upprätt, och korrekt orienterade i ULT (som visas i figur 2B), lägga till mer OCT till mögel (tills toppen av hjärnor omfattas). Igen, se till att det finns inga synliga luftbubblor i ULT.
9. Använd tången för att håll i hörnet av mögel, säkerställa tången inte blivit delvis nedsänkt i ULT (figur 3A). Var noga med att hålla mögel nivå, sänka mögel i isopentan (-45 ° C till-50 ° C) så att botten tredje av mögel är nedsänkt. Håll det här så att eventuella bubblor i ULT att stiga till ytan och bort från vävnaden (figur 3B).
10. Efter 30 s, lägre hela formen in i isopentan och release från tången, lämnar Megabrain nedsänkt under minst 3 min (figur 3 c). Se till att mögel hålls nivå, så hjärnan förblir upprätt och ekvidistant (figur 3D).
11. Efter 3 min inbäddade Använd tången att ta bort mögel som innehåller de frusna, OCT hjärnor (figur 3E) från isopentan.
12. Omedelbart, wrap mögel och dess innehåll i aluminiumfolie och etiketten med antalet djur eller Megabrain identifiering. Tryck den frysta Megabrain så sparsamt som möjligt för att undvika upptining vävnaden.
13. Denna Megabrain kan nu överföras till frys-20 ° C och lagras i minst 24 h.
    Obs: Protokoll kan pausas här och Megabrain kan förvaras frysta tills kryosnitt äger rum.

3. förberedelse av Megabrain för snittning på kryostaten

1. Ställa in kryostaten kabinett temperatur-19 ° c. Kontrollera denna temperatur nås innan du fortsätter. Hela snittning, se till att skåpet temperaturen förblir mellan-18 ° C och -20 ° C.
2. Ta Megabrain från-20 ° C frysen och placera det i kryostaten. Också, placera en chuck av lämplig storlek mått, och två tunna spets penslar i kryostaten. Lämna både Megabrain och chucken i kryostaten för minst 15 min att komma till temperaturen i kryostaten.
3. På lämpligt sätt märka bilder med Megabrain nummer och bildnumret. Lägg dessa diabilder på en bild varmare (35 – 45 ° C).
4. Packa upp Megabrain från aluminiumfolie. Använd ett rakblad för att skära vertikalt hörnen av mögel att tillåta enkel borttagning av block av OCT från mögel (figur 4A).
5. Fördela ett tunt lager (ca 3 mm tjock) OCT på chucken.
6. Snabbt, med minimal kontakt mellan fingrar och ULT, placera Megabrain på chucken, i den riktning som önskas. Stor pincett kan också användas för detta steg för att minimera upptining. Innan du börjar avsnitt, lämna Megabrain monterad chuck i kryostaten för 15 – 20 min till tillåta ULT att frysa helt.
7. När baslager av OCT har fryst, tillämpa ett 2 mm tjockt lager OCT runt sidorna av Megabrain och tillåter detta att köra ner från sidorna på chucken. Detta hjälper till att säkerställa Megabrain att chucken. Igen, innan du fortsätter, lämna Megabrain monterad chucken i kryostaten för 15 – 20 min till tillåta ULT att frysa.
8. Använd ett rakblad för att ta bort någon överflödig OCT från sidorna eller i bottnen av chucken (figur 4B).

4. kryosnitt av Megabrain

1. Innan du börjar, kontrollera att det är en bägare som innehåller minst 20 mL 1 x PBS.
2. Placera chucken, monterad med Megabrain, in i chuck huvudet på kryostaten (figur 4B).
3. Ställ in kryostaten att skära på önskad tjocklek. Den nuvarande metoden har optimerats för 10 µm 50 µm avsnitt.
4. Trimma ULT och vävnad som behövs för att nå önskad hjärnregionen för vävnad samling (figur 4 c).
5. När du är redo att samla vävnad, lägre antirullningsplattan tills det vilar på scenen och vrid kryostaten handtaget för att ta ett enda avsnitt. Långsamt lyfta antirullningsplattan, vara noga med att den sektionerad Megabrain inte är kopplad till antirullningsplattan och faller inte utanför scenen figur 4 d).
6. Försiktigt använda penslar för att rulla avsnittet Megabrain tills det liggande på kryostaten scenen (figur 5A). (Om det behövs, håll ULT platta med hjälp av penslar för att förhindra rullande).
7. Ta bort bilden från bilden varmare och muspekaren i bilden etikettsidan nedåt, över avsnittet Megabrain på scenen så att avsnittet att hålla sig till bilden.
8. Snabbt Applicera en droppe 1 x PBS till varje vävnad avsnitt i bilden och inte tillåter dessa att torka ut tills de har blivit borstad platta (se steg 4,9).
9. Använd en fin lutad pensel doppad i 1 x PBS att borsta ut eventuella bubblor i vävnaden och veckla upp vävnaden så det liggande på bilden (figur 5B). Se till att inte ändra placeringen av avsnitten hjärnan och därmed förlorar den relativa positionen till de andra vävnadssnitt. Manipulera vävnaden med omsorg för att undvika tårar. Håll hjärnan sektioner från kanterna av bilden, som perifera utrymme krävs för ett täckglas och PAP pen tillämpning i några olika färgprotokollen.
10. Placera bilden tillbaka in i bilden varmare och torr för 45 min. locket som behövs för att förhindra damm från att landa på vävnaden. När torr, lagra bilder i vid-80 ° C tills vidare användning.

Representative Results

Ett positivt slutresultat för denna procedur är vävnad som ligger platt på bilden, utan bubblor eller tårar, i orientering där de frystes. Vävnadssnitt är jämnt fördelade apart och lätt identifierbara på grund av bra placering av hjärnan i ULT och bra notation vilket visas i figur 1. Förutsatt att hjärnvävnaden samlades från djur i samma ålder, och som vävnaden var korrekt justerad i ULT, ska sektioner samlas in på en bild representera ett liknande koronalt plan, skulle möjliggöra jämförelse mellan regioner i hjärnan mellan djur. Förutsatt att vävnaden har fryst väl, med minimal frysa artefakt, kan H & E fläcken bäras ut för att bedöma cryoprotection kvalitet⁹. Immunohistokemi kan utföras som visat med färgningen visas i figur 6.

Figur 1: representativa diagram över layouten föreslagna Megabrain. Detta visar position beteckningssystemet av vävnad från 9 olika djur. Talsystemet är utformad som visat; men kan någon numreringssystem användas. 'X' är representativt för det tomma utrymmet för att tydligt visa orientering där vävnaden var frusen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: felaktigt och korrekt placerade hjärnor i mögel. (A) hjärnans hemisfärer dåligt justerad i okt från överkant och sida. (B) väl överens hjärnhalvorna i okt från överkant och sida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: stadier av hjärnan frysning. (A) Megabrain innan att vara nedsänkt i-45 ° C isopentan. (B) Megabrain när nedsänkt i isopentan. (C) Megabrain nedsänkt helt i isopentan. (D) Megabrain sänks till isopentan, visar att hjärnor ska stanna upprätt och lika långt från varandra under denna process. (E) A frysta Megabrain i en inbäddning mögel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: viktiga stadier i skära en Megabrain. (A) Megabrain tas bort från inbäddning mögel i kryostaten. (B) Chuck monterad med Megabrain. (C) trimmas Megabrain. (D) Megabrain avsnitt på kryostaten scenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: före och efter monterade Megabrain avsnitt. (A) frysta Megabrain avsnitt (40 µm) på kryostaten scenen. (B) glasskiva monterad med Megabrain vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: immunohistokemi på en Megabrain bild färgas med Iba1. (A) vävnad tas från en Megbrain visar enhetliga färgning mellan olika hjärnor i en studie. (B) 20 x mikroskopiska bilder tagna från regionen somatosensoriska fat fält (S1BF) cortex i varje monterade hjärna, visar konsekvent Joniserat kalcium bindande adapter molekylen 1 (Iba1) färgning av mikroglia mellan hjärnor. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Det bör övervägas under detta förfarande att Megabrain och dess omgivningar temperatur ständigt måste övervakas för att förhindra upptining och åter frysning av vävnad. Hjärnan kan bara tas bort från-20 ° C frysen upp till 3 gånger som varje gång det är rörd och vänster i kryostaten, med varmare fluktuerande feber, vävnaden tinar och fryser, orsakar en gelé som textur och onormal vävnad integritet¹⁰. Därför är det optimalt att klippa Megabrain alla på en gång.

Vävnaden fixering och cryoprotection är viktiga delar av detta protokoll att minimera ice crystal bildandet, minska yttre mikrobiell tillväxt och stoppa enzymatiska reaktioner, därigenom bevara vävnad integritet¹⁰. Om hjärnan inte är cryoprotected med sackaros, kan sedan vatten inom vävnaden bilda iskristaller under frysprocessen, som strimla vävnad och orsaka hål till form. Medan vi föreslår seriespädningar av sackaros i TBS, kan hjärnor placeras direkt i 30% sackaros för en längre period (48-72 timmar) att uppnå liknande cryoprotection. Det rekommenderas dock starkt att sackaros lösningarna görs med TBS. variationer såsom användning av PBS eller vatten kommer att resultera i dålig cryoprotection av Megabrain och dålig vävnad kvalitet. Hematoxylin och Eosin (H & E) fläcken kan användas för att bedöma kvaliteten på cryoprotection och åtföljande frysa artefakt¹¹. Bra vävnad kvalitet (med minimala hål) är viktigt i histologiska studier eftersom hålen kan störa bindningen av antikroppar samt minska vävnad integriteten av celler med fina processer, vilket kan påverka analysen av några fläckar. Undvika symmetrisk placering av hjärnor, eftersom detta kan orsaka förvirring när du försöker identifiera djuret som varje hjärna erhölls.

Den nuvarande tekniken har optimerats för koronalt avsnitt; dock kan den enkelt anpassas till skära sagittala och transversella sektioner. Dessa skär ändringar kräver lämplig variant av hjärnan placering i steg 2.5 genom 2,7. Det bör noteras att dessa anpassningar kan minska antalet hjärnor som kan passa in i en inbäddning mögel.

En viktig ändring av denna teknik är det tomma utrymmet på positionsnummer 1 (som visas i figur 1). Detta utrymme är utformad för att tillåta enkel identifiering av Megabrain orientering, och därför identifiera djuret är associerad med varje hjärna.

Denna teknik har ändrats för att tillåta vävnad från ett större antal djur vara fryst och skär samtidigt i Megabrain. Storleken på gnagare hjärnan är beroende av kön, ålder och arter därför; antal hjärnor som passar i formen kan variera. Det är inte klokt att avskilja olika åldrar, könen eller behandlingsgrupperna i separata Megabrains. Även om detta kan säkerställa storlek enhetlighet, kan det också öka bias och subjektivitet under bildhantering och analys. Dessutom finns det oundvikliga variansen mellan bilderna under immunohistokemi i protokoll, vilket kan leda till färgning inkonsekvens mellan ålder/kön grupper.

En rektangulär, större chuck användes, i stället för en cirkulär, vilket gav ökat stöd bakom Megabrain.

Som mögel och dess innehåll var av en större volym än en singular hjärna i en OCT-mögel, krävdes mer tid att frysa hjärnan i isopentan. Genom trial and error fastställdes en tidslängd som gett bra frysa kvalitet (3,5 minuter). Megabrain kan vara kvar i isopentan längre; dock temperaturen måste bo i intervallet-45 ° c till-50 ° C för att undvika sprickbildning ULT.

I området i närheten finns det många separata bitar av vävnad i Megabrain bilden, är det möjligt att vävnad kan torka ut och därmed bli sprödare under borstning stegen. För att bekämpa problemet, bör en droppe PBS läggas på varje enskild hjärna avsnitt att hålla den fuktig tills det borstas ut.

Tekniken med hemisecting i hjärnan, en studie där detta krävs, är avgörande för att uppnå bra resultat. När hemisecting hjärnan, det är viktigt att denna bisection görs just för att säkerställa alla regioner i hjärnan är intakta med den rätta halvklotet. Om lillhjärnan eller luktsinnet lökar inte är relevanta för studien, kan de tas bort. Ta bort detta ”överskott” vävnad minskar mängden vävnad som behöver trimmas när kryosnitt. Ta bort lillhjärnan tillåter hjärnan att stå upp lättare i ULT före frysning.

När att borstas ur, håll vävnadssnitt från kanten av bilden. Detta ger utrymme för en rad PAP pen, en hydrofoba barriär, att omge vävnad, vilket är ett krav för vissa immunohistokemi protokoll. Dessutom behövs utrymme för täckglaset.

Om halvklotet/hjärnan faller eller lutar under den Megabrain frysning, kommer sedan avsnitten inte att samtidig hyvel. Ett liknande resultat kan uppstå om en hjärna är större än de andra i en enda Megabrain. För att övervinna detta, kan fler bilder väljas att färga där brain(s) i fråga är på lämpligt område av intresse.

En begränsning med denna teknik är att eftersom alla av vävnad är fryst i ett block av ULT. om det finns tekniska fel, som en dålig frysa på grund av en felaktig temperatur, då vävnaden från flera djur kommer att påverkas (5-9 djurs hjärnor istället för bara 1). Detta är mer av ett problem när du använder full hjärnan och inte hemisected sektioner, eftersom den återstående halvklotet kan frysas och sektioneras ensamma för att erhålla den önska avsnitten.

En annan begränsning med denna metod är att när du justerar kryostaten för att klippa Megabrain, en bäst anpassade strategi måste tas. Detta är på grund av alla hjärnor är i lite olika vinklar mot varandra, medan detta inte är ett problem när snittningen en singularly frusna hjärna. Effekterna av detta kan minimeras under frysning genom att säkerställa hjärnor är upprätt och med en liknande storlek.

En av de största fördelarna med denna teknik över frysning hjärnor ovanligt är att det förkortar den totala tid frysning och skärande hjärnor med upp till 90%, om 9 skärs i samma takt som 1 hjärnan. Den andra viktiga fördelen med denna teknik är att det tillåter ett mindre antal bilder som innehåller vävnad från krävs djuren att färgas. Detta ökar tillförlitligheten och likformighet av immunhistokemisk färgning, eftersom alla bilder är målat i samma omgång. Det kan finnas inkonsekvens mellan diabilder målat samtidigt, men en Megabrain kan tillåta flera studie hjärnor att representeras i en enda bild, vilket minskar variabilitet och öka giltigheten av analysen. Att ha konsekvent färgning är en viktig fördel i någon histologisk studie och en större betydelse med denna teknik. Slutligen uppstår färre bilder också lägre leverans kostnader.

Denna teknik kan enkelt modifieras för styckning sagittal sektioner av en gnagare hjärnan. Det skulle också kunna anpassas för användning i kryosnitt vävnaden från olika djurmodeller och olika typer av vävnad, såsom muskel- eller lever prover. Anpassningar till protokollet skulle behöva göras, inklusive optimering av mängden lösningar används, storleken på kryostaten blade/scenen och volymen av inbäddning mögel.

Denna teknik skulle också kunna anpassas för friflytande tekniker, där protokollet skulle förbli densamma tills steg 4,6. I detta steg, skulle hjärnor behöva avskiljas och lyfte i separat plåt brunnar att färgas. Extra omsorg skulle behöva vidtas för att inte förvirra hjärnan skivor i processen sortering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065