Summary
Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) is een therapeutische techniek voorgesteld voor de behandeling van psychiatrische ziekten. Een dierlijk model is van essentieel belang voor het begrijpen van de specifieke biologische veranderingen die door TDC's opgeroepen. Dit protocol beschrijft een muismodel van TDC's die gebruikmaakt van een chronisch geïmplanteerde elektrode.
Abstract
Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) is een niet-invasieve neuromodulatie Techniek voorgesteld als een alternatieve of aanvullende behandeling voor verschillende neuropsychiatrische ziekten. De biologische effecten van TDC's worden niet volledig begrepen, die ten dele als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van menselijk hersenweefsel wordt uitgelegd. Dit protocol beschrijft een muismodel van TDC's die gebruikmaakt van een chronisch geïmplanteerde elektrode waardoor de studie van de biologische effecten van langdurige van TDC's. In dit experimenteel model, TDC's verandert de corticale genexpressie en biedt een prominente bijdrage aan het begrip van de beweegredenen voor het therapeutische gebruik ervan.
Introduction
Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) is een niet-invasieve, goedkope, therapeutische techniek, die zich op de neuronale modulatie door het gebruik van lage-intensiteit continue stromen1 richt. Er zijn momenteel twee opstellingen (anodal en cathodal) voor TDC's. Terwijl de anodal stimulatie een huidige elektrisch veld te zwak om te activeren van de actie potentieel oefent, hebben elektrofysiologie studies aangetoond dat deze methode veranderingen in synaptische plasticiteit2 produceert. Bijvoorbeeld aangetoond dat TDC's induceert potentiëring (LTP) effecten op lange termijn zoals verhoogde maximale amplitude van de3,excitatory postsynaptisch potentieel4 en modulatie van de corticale prikkelbaarheid5.
Omgekeerd, cathodal stimulatie induceert remming, resulterend in membraan hyperpolarisatie6. Een hypothese voor dit mechanisme is gebaseerd op de fysiologische bevindingen waar TDC's te moduleren actiepotentiaal frequentie en duur in de neuronale lichaam3wordt beschreven. Met name doet dit effect niet rechtstreeks oproepen actie potentieel, hoewel het kan verschuiven van de depolarisatie drempel en vergemakkelijken of bemoeilijken van de neuronale afvuren7. Deze effecten contrasterende zijn eerder aangetoond. Bijvoorbeeld, anodal en cathodal stimulatie geproduceerd tegengestelde effecten in geconditioneerde reacties geregistreerd via elektromyografie activiteit in konijnen8. Maar hebben studies ook aangetoond dat langdurige anodal stimulatie sessies prikkelbaarheid verminderen kunnen, terwijl de verhoging van de cathodal stromingen kan leiden tot prikkelbaarheid, presenteren zichzelf contrasterende effecten3.
Zowel anodal als cathodal prikkels aggregaat het gebruik van de elektrode paren. Bijvoorbeeld, in anodal stimulatie, de "actieve" of "anode" is elektrode geplaatst over de regio van de hersenen te worden gedifferentieerd, overwegende dat de "referentie" of de "kathode" elektrode bevindt zich op een gebied waar het effect van de huidige wordt ervan uitgegaan dat onbeduidend9. In de cathodal stimulatie, is elektrode dispositie omgekeerd. De intensiteit van de stimulatie voor effectieve TDC's hangt af van de huidige intensiteit en afmetingen van de elektrode, die gevolgen hebben voor het elektrische veld anders10. In de meest gepubliceerde studies, bedraagt de gemiddelde stroomsterkte 0.10 naar 2.0 mA en 0,1 mA tot 0.8 mA voor mens en muizen, respectievelijk6,11. Hoewel de grootte van de elektrode van 35 cm2 meestal bij de mens gebruikt wordt, er is geen juiste begrip met betrekking tot de afmetingen van de elektrode voor knaagdieren en een grondiger onderzoek is nodig6.
TDC's is voorgesteld in klinische studies met de poging van het aanbieden van een alternatieve of aanvullende behandeling voor verschillende neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen11 zoals epilepsie12, bipolaire wanorde13, lijn5 , grote depressie14, ziekte van Alzheimer15, multiple sclerose16 en17van de ziekte van Parkinson. Ondanks de groeiende belangstelling voor TDC's en het gebruik ervan in klinische proeven, gedetailleerde cellulaire en moleculaire evoked wijzigingen in hersenweefsel, korte en langdurige gevolgen, evenals gedrags resultaten, nog dieper te onderzocht18, 19. aangezien een rechtstreekse menselijke aanpak van grondig bestuderen TDC's niet haalbaar is, het gebruik van een dierlijk model van TDC's kan bieden waardevolle inzichten in de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen ten grondslag liggen aan de therapeutische mechanismen van TDC's als gevolg van de toegankelijkheid van de dier hersenweefsel.
Beschikbare gegevens is beperkt met betrekking tot de TDC's modellen in muizen. De meeste van de gerapporteerde modellen gebruikt verschillende implanteren van lay-outs, elektrode afmetingen en materialen. Bijvoorbeeld, Winkler et al. (2017) geïmplanteerd de hoofd elektrode (Ag/AgCl, 4 mm diameter) gevuld met zoutoplossing en het aan de schedel vastgemaakt met acryl cement en schroeven20. Verschillende van onze aanpak, hun borst elektrode was geïmplanteerde (platina, 20 x 1,5 mm). Nasehi et al. (2017) gebruikt een procedure vergelijkbaar met onze, hoewel de thoracale elektrode is gemaakt van een zoutoplossing gedrenkte spons (kool gevuld, 9,5 cm2)21. Een andere studie geïmplanteerd beide elektroden in het hoofd van het dier, die tot stand gekomen met behulp van vaste platen en die betrekking hebben op het hoofd van het dier met een hydrogel dirigent22. Hier beschrijven we een muismodel van TDC's die gebruikmaakt van een chronisch geïmplanteerde elektrode via eenvoudige chirurgische procedures en TDC's setup (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Individueel gehuisvest mannelijke volwassene (8-12 weken) C57BL/6 muizen werden gebruikt in dit experiment. Dieren juiste zorg ontvangen vóór, tijdens en na de experimentele procedures met voedsel en water ad libitum. Alle procedures werden goedgekeurd door het Comité dierenethiek van federale universiteit van Minas Gerais (protocol nummer 59/2014).
1. elektrode plaatsing
-
Sederende en fixering van het dier op het stereotaxic apparaat
- Steriliseren alle noodzakelijke chirurgische instrumenten.
Roman Chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd gedurende 3 minuten bij 440 ° C. Katoenen wissers waren gesteriliseerde met autoclaaf op 20 psi (pond per vierkante inch) bij 121 ° C gedurende 20 minuten. - Aanpassen van de controller van de thermische platform tot 37 ° C.
- Weeg het dier en berekenen van de juiste dosering voor inductie van de anesthesie. Gebruik een mengsel van ketamine en xylazine bij een dosis van 100 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine, gegeven intraperitoneally (breinaalden, 31 G). Het dier moet vallen in slaap binnen 2 tot 3 minuten.
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat of een scheermesje te scheren van de chirurgische site.
- Plaats het dier op het stereotaxic apparaat over de voorverwarmde verwarming plaat.
- Houd de hoofd van het dier en de tip oor bars invoegen in elk van de oren van het dier om het te bevestigen aan het stereotaxic platform.
- Controleer of er geen zijdelingse hoofd verschuiven en kleine verticale beweging na door het langzaam verschuiven van het dier hoofd positionering.
- Zachtjes de verdoving masker over de neus van de muis glijden en repareren in plaats door aanscherping van de schroef.
- Stel de Isofluraan naar 1% met 1,0 L/min voor O2.
- Oog zalf toepassen door de ogen van het dier om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies tijdens de operatie.
- Steriliseren alle noodzakelijke chirurgische instrumenten.
-
Het implantaat te koppelen aan het hoofd van het dier
- Gebruik de swabs katoen te bereiden de chirurgische site met drie afwisselende scrubs van Povidon-Jood (of 2% chloorhexidine) en 70% ethanol.
- Met een paar pincet te controleren verdoving diepte door licht van het dier tenen knijpen en controleren van het verlies van dier pedaal terugtrekking (Teen snuifje) reflex.
- Maak een incisie ongeveer 3 mm posterieure aan van het dier oor lijn en stoppen bij de oog-lijn. De site van de incisie moet ongeveer 1 cm in lengte groot genoeg is om te ontvangen van het implantaat.
- Zachtjes Schraap de schedel met een bot schraper cement naleving te verbeteren van de lijm. Doe dit licht eentje met de bedoeling te maken micro krassen.
- Chirurgische haken aan de losse huid te handhaven een open chirurgische veld en vrij van obstakels zoals Pelsbereiderijen en bontwerkerijen plaats.
- Gebruik een steriel katoenen doekje te drogen van het dier hoofdhuid.
- Gebruik een ontleden Microscoop te visualiseren van de bovenkant van de schedel van het dier.
- Een naald hechten aan de houder van de stereotaxic en ga naar de bregma. Plaats de naald direct boven het hoofd van het dier iets aanraken van de bregma.
- Nul uit alle coördinaten op de digital tracer en breng de naald.
- Fix het implantaat TDC's op de stereotaxic houder. Plaats van het implantaat op de kop van het dier en het langzaam lager op de regio van belang met behulp van de juiste stereotaxic coördinaten.
- Via een naald te verspreiden 1 druppel (ongeveer 35 μL) van superlijm op het implantaat van base.
- Langzaam bewegen de houder naar beneden totdat het raakt de schedel. Zorg ervoor dat het implantaat base volledig in contact met het oppervlak is.
- Bereiden de chirurgische cement volgens de instructies van de fabrikant.
- Na nauwkeurige positionering, toepassing 3 dunne, gelijkmatige laag van cement in de schedel en op het onderste gedeelte van het implantaat. Toepassing druppel per druppel met behulp van een penseel van toepassing. Lagen moeten vormen een heuvel-vormige structuur voor verdere structurele ondersteuning van het implantaat.
- Laat het implantaat de schroefdraad schoon van cement een glad, ongehinderd verbinding toestaan.
- Het toestaan van elke laag voor ongeveer 4 minuten drogen.
- Droog, verwijder voorzichtig de houder totdat het volledig los van het implantaat. Gebruik altijd uiterste voorzichtigheid bij het verwerken van het implantaat, omdat het per ongeluk kan worden geëxtraheerd uit de schedel van het dier.
-
Afwerking van de operatie en na chirurgische zorg
- Hydrateren de huid van het dier op de site van de incisie met een zoutoplossing doordrenkte wattenstaafje.
- Jas de huid over de basis van het implantaat TDC's.
- Gebruik een paar pincet samen te brengen het weefsel en sluit de insnijding met een daling van chirurgische weefsel lijm per 0,2 cm van weefsel.
- 1-2% lidocaïne in de incisie site te infiltreren en de onderliggende weefsels.
- De muis met 500 µL van lactaat Ringer's oplossing subcutaan hydrateren.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een voorverwarmde (37 ° C) schoon, single-gehuisvest kooi.
- Zet een kleine schotel met natte voedsel pellets in de kooi voor gemakkelijke toegang tot voedsel in de volgende uren.
- Registreer na chirurgische gewicht van het dier.
- De dierlijke ketoprofen (5 mg/kg) wordt subcutaan geven na de operatie en op de komende 2 dagen.
- Toezicht op het herstel van het dier nauw voor ten minste 1 week. Enig teken van nood, zoals rechtopstaan, gebrek aan verzorging, verminderde motoriek, wond krabben en ontsteking van de chirurgische site beoordelen.
2. TDC's Setup en stimulatie
-
TDC's Setup (Zie Figuur 2)
Opmerking. Zorg ervoor dat de TDC's stimulator volledig is opgeladen.- De anode en kathode kabels hechten aan de TDC's stimulator en deze beschikbaar maken in de buurt van de stimulatie-site. De pin-type elektrode aan de stereotaxic houder koppelen.
- De thermische platform ingesteld op 37 ° C.
- Zet de zuurstof debietmeter op de inademing verdoving systeem aan 1 L/min.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in de anesthesie inductie kamer.
- Zet de vaporizer Isofluraan tot 3%. Laat het dier te ondergaan Isofluraan effecten voor 4 min.
- Terwijl het dier in het zaal inductie is, gebruik een steriele injectiespuit te vullen van de lichaam-elektrode met zoutoplossing 0,9%.
- Verwijder het dier uit de zaal inductie en plaatst zijn borst op het lichaam-elektrode.
- Zachtjes de verdoving masker over de neus van de muis glijden en repareren in plaats. De uitvoer van Isofluraan tot 1,5% lager.
- Vul het implantaat en de pin-type-elektrode met zoutoplossing en zorgvuldig hechten ze.
- Stimulatie tijd en huidige intensiteit aanpassen.
- Controleer of de contact kwaliteit op de TDC's stimulator. Optimaal contact gaat van 7 tot en met 10 op een schaal van 1 tot en met 10.
-
Stimulatie
- Start de stimulatie.
- Observeer de huidige speedramp voor 30 s tot de geselecteerde waarde en onderhouden zelf steady voor de vastgestelde tijd en vervolgens, aan het einde van de sessie speedramp beneden weer.
- Hiermee activeert u de sham-knop voor controle muizen.
- Observeer de huidige speedramp voor 30 s naar de geselecteerde waarde en vervolgens tot 1 voor de rest van de periode van de stimulatie met een laatste helling naar de geselecteerde waarde aan het eind met een opeenvolgende helling naar beneden.
- Zodra de stimulatie-sessie voltooid is, moet u zorgvuldig het dier overbrengen naar een kooi voorverwarmde (37 ° C) gedurende 10 minuten.
Roman Dieren beginnen te ontwaken na 3 min. - De inademing verdoving systeem uitschakelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het chirurgische protocol gepresenteerd langetermijnstabiliteit implantaat voor ten minste één maand, met geen inflammatoire signalen op de gestimuleerd site, noch enig andere ongewenste effect. Alle dieren overleefden de chirurgische procedure en TDC's sessies (n = 8). In dit experiment, werden TDC's implantaten geplaatst over de cortices M1 en M2 op het (+ 1,0 mm anterior-posterior en 0,0 mm lateraal te bregma). Een week later, TDC's (n = 3-4) en sham (n = 3) muizen werden gestimuleerd gedurende vijf opeenvolgende dagen tijdens de 10 min op 0.35 mA. Contact kwaliteit (CQ) waarden werden geregistreerd om te beoordelen van de levensvatbaarheid van het implantaat en geen significante verschillen werden gevonden tussen de groepen tijdens een 5-daagse stimulatie procedure (figuur 3A). Met behulp van deze diermodel, stimulatie succes kan worden bepaald door de evaluatie van gen expressie niveaus voor hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP). Zowel BDNF en GFAP gepresenteerd aanzienlijk hoger mRNA niveaus in het gebied van de cortex onder het implantaat in vergelijking met de sham-groep. De effecten van TDC's op genexpressie lijken te worden beperkt tot specifieke genen aangezien expressie niveaus van de activiteit-gereglementeerde cytoskelet-geassocieerde proteïne (ARC) en synapsin 1 (SYN1) genen niet werden veranderd (figuur 3B).
Figuur 1 . Experimentele stappen gebruikt voor chirurgie en stimulatie van het implantaat. Een schematische stroomdiagram van de stappen via TDC's implantaat plaatsing, TDC's setup en stimulatie procedure. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . TDC's Setup. Het recht superieur beeld komt overeen met aschematic van de TDC's huidige stimulator (B), waarin een display gedurende de huidige intensiteit en stimulatie (B), een CQ display (C) schaal van 1 tot en met 10 en een ware huidige weergave (D). De TDC's stimulator heeft ook knoppen voor het activeren van sham stimulatie (E), om te beginnen met stimulatie (F), en om af te breken het protocol (G). De twee knoppen worden gebruikt voor de aanpassing van de stroomsterkte (H) en de duur van de stimulatie (I). De aan/uit-schakelaar bevindt zich aan de achterkant (J). Twee vrouwelijke inlasbare ingangen worden gebruikt voor de elektrode kabels (K, minpool) (L, pluspool). De juiste inferieur showsthe dierlijke beeldinstelling met de hoofd-elektrode gemaakt van Ag/AgCl (O) en de elektrode lichaam gemaakt van vernikkeld messing (M) verzamelingen en hun respectieve afmetingen. Een auto aangepast thermische platform (N) blijft de temperatuur van het dier en Isofluraan gemengd met 100% zuurstof (P) wordt geleverd door het stereotaxic gas masker (Q). De inzet (R) toont de positionering van de anode ten opzichte van de corticale motor regio's M1 en M2 (S). De TDC's headstage is samengesteld uit een implanteerbare houder (T) gevuld met een zoutoplossing (0,9% NaCl) (U) die wordt afgesloten met een pin-type elektrode (V) aangesloten op een plastic kapje (W). De respectieve afmetingen in millimeter worden afgebeeld (D = diameter, H = hoogte, ID = inwendige diameter). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Neem contact op met kwaliteit en gen expressie veranderingen die door TDC's opgeroepen. (A) geen statistische verschillen werden waargenomen voor contact kwaliteit (CQ) tussen de groepen. Twee richtingen herhaald maatregelen ANOVA, behandeling ten opzichte van de interactie van de dag (F4.30 = 0.552, P = 0.698), behandeling factor (F4.30 = 0.349, P = 0.810), dag factor (F1.30 = 0.157, P = 0.694). (B) kwantitatieve polymerase kettingreactie gen expressie gegevens voor BDNF (hersenen-afgeleide neurotrophic factor)GFAP (gliale fibrillary zuur eiwit)ARC (activiteit-gereglementeerde cytoskelet-geassocieerde eiwit) en SYN1 (synapsin 1). mRNA niveaus van beide BDNF (p = 0.0081) en GFAP (p = 0.0108) werden verhoogd terwijl geen verandering was ontdekt voor ARC (p = 0.0760) en SYN1 (p = 0.508), volgens D'Agostino-Pearson normaliteit test gevolgd door ongepaarde parametrische Student t-test. Vouw wijzigingen werden berekend aan de hand van de 2- ΔΔCQ -methode ten opzichte van de RPL13A gen. In alle grafieken, TDC's groep is magenta en sham groep is groen; n = 3-4/groep. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde en ± S.E.M. foutbalken. n.s. = opgave, p ≤ 0.05*, p ≤ 0.01* *. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren invoeren neurostimulatie technieken klinische praktijk als een veelbelovende procedure voor de behandeling van neuropsychiatrische aandoeningen23. Verklein de beperking opgelegd door het gebrek aan kennis van de mechanismen van neurostimulatie en presenteerden we hier een TDC's muismodel uitvoering van een elektrode die hersengebieden kunt richten. Aangezien de elektrode chronisch implanteerbare is, kunt deze diermodel het onderzoek naar de biologische effecten van langdurige opgeroepen door TDC's (gedurende ten minste 1 maand) in complexe stimulatie patronen. De beschreven TDC's diermodel presenteert hoge implantaat tolerantie en weinig kans op infectie als correct uitgevoerd. Over het geheel genomen zijn de operatie stappen te plaatsen van het implantaat van snelle en eenvoudige uitvoering (30 min/dier). Een bijkomend voordeel van dit model TDC's is dat het mogelijk is om bij te houden van de elektrode contact kwaliteit en de werkelijke waarden voor huidige stimulatie is.
Het belangrijkste nadeel van deze diermodel is de juiste implantaat fixatie op de schedel van de muis. Tijdens chirurgie is het essentieel om te beperken van het dier hoofd op een wijze welke geen zijdelingse hoofd verschuiving niet mogelijk (het hoofd zal alleen verticaal verplaatsen) is. Dit zal verzekeren dat van het dier hoofdhuid is volledig afgestemd op het implantaat van base, waardoor goede fixatie met de tandheelkundige cement, en de hogere precisie bij het moduleren van het beoogde doelgebied. Het is cruciaal voor het maken van de incisie die groot genoeg is om te ontvangen van het implantaat. Een grotere snede kan nodig zijn voor sommige TDC's implantaten. Met behulp van twee tot vier chirurgische haken gemaakt van injectienaalden zal de gecementeerde gebied vergroten. Echter, moet u vermijden de haken te dicht naar de ogen van het dier te verwijderen elke mogelijkheid van laesies. Overwegende dat zachtjes krassen op de hoofdhuid, de hechting van de Super lijm en het cement op de schedel verbetert, kan elke resterende puin te voorkomen dat de naleving van de goede implantaat. Bovendien, bij de toepassing van de tandheelkundige cement, bereiden de eerste laag met een hogere viscositeit, die het cement vermijdt van het rennen van het dier schedel. Elke laag cement mag te drogen voor ten minste 4 min. omdat cement over natte lagen toe te passen de verharding van de onderste lagen vertragen zal en het implantaat te verschuiven of zelfs vallen kan veroorzaken. Vanuit ervaring, moet er niet meer dan 3 lagen van cement rondom het implantaat te vermijden van obstructie van de schroefdraad. Voor zowel de lijm en het cement, moet handhaven hun toepassing beperkt tot het implantaat van base. Te voorkomen waardoor residuen te verspreiden binnen het implantaat, die zal verminderen de oppervlakte geleidbaarheid en de TDC's effecten.
De implanteerbare elektrode gebruikt in deze procedure was niet zelf verzonnen maar verworven van een medisch onderzoek bedrijf gespecialiseerd in het produceren van neuromodulatie apparaten. De implantaten zijn gemaakt van polypropyleen met 9 mm hoogte en een buitenste en binnenste diameter van 5,7 en 3,5 mm, respectievelijk. Een zoute totaalvolume van 80 µL kan bevatten. Het superieure gedeelte van het implantaat is bereid met een schroefdraad te ontvangen van een pin-type elektrode-houder. Van de houder van de pin-type elektrode normalisatieprocedure is ook gemaakt van polypropyleen meten van 4 mm hoog met een buitendiameter van 5,3 mm en een inwendige diameter van 3,75 mm. De elektrode pin bestaat uit Ag/AgCl, een inert materiaal gebruikt als gevolg van haar waterstabiel eigenschappen (Figuur 2). Aangezien de locatie van het implantaat een kritische factor voor effectieve TDC's is, is het essentieel om een goede elektrode grootte volgens de regio van belang te selecteren. Het implantaat gebruikt in deze diermodel beslaat een oppervlakte van 9.61 cm2, het elektrische veld spreiden over een 1,75 mm straal van de coördinaat van de beoogde hersenen wat resulteert in een 36,3967 μA/cm2 stroomdichtheid. De TDC's stimulus uitgevoerd in dit protocol was mogelijk, meestal gericht op de cortices M1 en M2.
Meestal, is de configuratie van de elektrode afhankelijk van de effecten van de beoogde excitatory of remmende stimulatie (anodal versus cathodal). Hoewel stromingen altijd uit de anode in de richting van de kathode vloeien zullen, kan door het plaatsen van de elektrode in omgekeerde terminal posities verschillende electrofysiologie effecten. Bijvoorbeeld, wanneer ionen vloeien uit de kathode in de richting van de anode voort, wordt de procedure meestal gedefinieerd als een cathodal stimulatie24. In dit experiment uitgevoerd we anodal stimulatie waarin de anode was geplaatst over de M1/M2-cortices en de kathode werd geplaatst naar beneden op de borstkas van het dier. Dus, in onze opstelling van TDC's verwacht wordt dat stimulatie excitatory potentieel25 produceert. Het effect van TDC's kan ook worden geregeld door de veranderingen in de huidige intensiteit en duur. De meeste studies bij knaagdieren hebben gebruikt stromingen variërend van 0,2 tot 1,0 mA. TDC's stromingen worden verwacht voor het genereren van geconcentreerde warmte reizen door de elektrode. Het directe contact van de elektrode TDC's aan het hoofd van het dier moet worden vermeden. Het gebruik van het uitvoeren van mediums strekt zich uit van de afstand tussen de elektrode en de schedel en voorkomt dat de schadelijke effecten van lokale chemische reacties op het biologisch weefsel. Het is mogelijk dat een hoge ionische concentraties in vloeibare gedrag media leiden de vorming van gas tot kan en bubbels uit elektrolyse23,24 resulteerde. Echter dit is onwaarschijnlijk om te zijn gebeurd in onze TDC's model sinds isotone zoutoplossing en lage huidige levering kan verminderen de kans op dergelijke complicaties24. Andere geleidende medium kan echter ook worden gebruikt met vergelijkbare rendementen, zoals gelatine-achtige en crème-achtige dirigenten24.
Bij het kiezen van de stimulator TDC's, is het essentieel dat flexibele configuratie mogelijkheden. We hebben voor dit protocol, een stimulator aangedreven door twee 9 V alkaline batterijen, waardoor een verwachte duur 1 uur stimulatie op 0.35 gebruikt mA. Deze stimulator bezit een stroombereik van 0.02 tot 1 mA met een resolutie van 10 µA, ideaal voor knaagdieren stimulatie. Het is essentieel dat de TDC's stimulator is uitgerust met een werkelijke huidige indicator en contact kwaliteit (CQ) feedback-systeem om te controleren of de voorwaarden voor optimale stimulatie. De huidige indicator verzekert wanneer de intensiteit van de geprogrammeerde stimulatie wordt voldaan. In dit model van TDC's is de meest voorkomende factor voor defecte stroom de aanwezigheid van bellen in de zoutoplossing. Dit probleem kan worden aangegeven door het feedbacksysteem CQ, die het contact van beide elektroden door het geleidende medium en lichaam van het dier meet. De TDC's stimulator gebruikt in dit experiment weergegeven CQ (SMARTscan) waarden variërend van 1 tot 10 op een geleide schaal. Deze schaal is gebaseerd op spanningswaarden die volgens de wet van Ohm weerstand kunnen afleiden. LED 1 geeft weinig of atypische lage weerstand, led 2 duidt open stroomkring en led 3 t/m 10 duidt arm om optimale kwaliteit (Figuur 2-post C). De CQ werd dagelijks geregistreerd voor TDC's zowel sham groepen om te controleren of de levensvatbaarheid van de elektrode. Het is opmerkelijk dat de gemiddelde waarde van de CQ tijdens stimulatie sessie hoger dan 7 was, wat betekent dat gewenste stromingen worden geleverd. Over het algemeen werden geen statistische verschillen waargenomen voor CQ onder de groepen of de dag van de stimulatie (figuur 3A). Als u wilt verder valideren ons TDC's model, wij kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) om te onderzoeken of vijf TDC's sessies (10 min, 350 μA) corticale genexpressie wijzigen uitgevoerd. We vonden dat de mRNA niveaus van BDNF en algemeen kaderakkoord voor vrede in de cortex van de M1/M2 van TDC's groepen, ten opzichte van de Sham-muizen (figuur 3B) werden verhoogd. Deze resultaten komen overeen met andere studies19,25.
Neurostimulatie studies bij proefdieren bieden nieuwe inzichten met betrekking tot de mechanismen van de hersenen die relevant zijn voor neuropsychiatrische aandoeningen. Afhankelijk van de configuratie van de experimentele kan de TDC's vergadering in deze diermodel ook worden gecombineerd met een bestaande optogenetic of electrofysiologie headstage voor de productie van een setup voor gelijktijdige opname en stimulatie, naast een veelheid van hersenen monster experimenten. Deze aanpak zou lastig zijn om uit te voeren bij de mens. Daarom biedt de mogelijkheid van het invoegen van flexibele toevoegingen aan de thans gerapporteerde dierlijke TDC's dat een prominente bijdrage voor het begrijpen van de neurale afgetrokken van TDC's en de motivering van het therapeutische gebruik ervan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Wij danken de heer Rodrigo de Souza voor bijstand bij het handhaven van de kolonies van de muis. L.A.V.M is een postdoctoraal CAPES. Dit werk werd gesteund door de subsidie PRONEX (FAPEMIG: APQ-00476-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Ultra-Fine 50U Syringe | BD | 10033430026 | For intraperitonially injection. |
| Shaver (Philips Multigroom) | Philips (Brazil) | QG3340/16 | For surgical site trimming. |
| Surgical Equipment | |||
| Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | KOPF | 940 | For animal surgical restriction and positioning. |
| Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars | KOPF | 922 | For animal surgical restriction and positioning. |
| Cannula Holder | KOPF | 1766-AP | For implant positioning. |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand | WPI | PZMIII-BS | For bregma localization and implant positioning. |
| Temperature Control System Model | KOPF | TCAT-2LV | For animal thermal control. |
| Cold Light Source | WPI | WA-12633 | For focal brightness |
| Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging | VetEquip | 901820 | For isoflurane delivery and safety. |
| VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter | VetEquip | 931401 | Delivery system safety measures. |
| Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | KOPF | 923-B | For animal restriction and O2 and isoflurane delivery. |
| Oxygen regulator, E-cylinder | VetEquip | 901305 | For O2 regulation and delivery. |
| Oxygen hose – green | VetEquip | 931503 | For O2 and isoflurane delivery. |
| Infrared Sterilizer 800 ºC | Marconi | MA1201 | For instrument sterilization. |
| Surgical Instruments | |||
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | For incision. |
| Surgical Hooks | INJEX | 1636 | In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur. |
| Standard Tweezers or Forceps | - | - | For skin grasping. |
| Surgical Consumables | |||
| Vetbond | 3M | SC-361931 | For incision closing. |
| Cement and Catalyzer KIT (Duralay) | Reliance | 2OZ | For implant fixation. |
| Sterile Cotton Swabs (Autoclaved) | JnJ | 75U | For surgical site antisepsis. |
| 24 Well Plate (Tissue Culture Plate) | SARSTEDT | 831,836 | For cement preparation. |
| Application Brush | parkell | S286 | For cement mixing and application. |
| Pharmaceutics | |||
| Xylazin (ANASEDAN 2%) | Ceva Pharmaceutical (Brazil) | P10160 | For anesthesia induction. |
| Ketamine (DOPALEN 10%) | Ceva Pharmaceutical (Brazil) | P30101 | For anesthesia induction. |
| Isoflurane (100%) | Cristália (Brazil) | 100ML | For anesthesia maintenance. |
| Lidocaine (XYLESTESIN 5%) | Cristal Pharma | - | For post-surgical care. |
| Ketoprofen (PROFENID 100 mg) | Sanofi Aventis | 20ML | For post-surgical care. |
| Ringer's Lactate Solution | SANOBIOL LAB | 7898153652145 | For post-surgical care. |
| TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g) | Alcon | 631 | For eye lubrification and protection. |
| Stimulation | |||
| Animal Transcranial Stimulator | Soterix Medical | 2100 | For current generation. |
| Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base) | Soterix Medical | 2100 | Electrode support (Implant). |
| Pin-type electrode (Ag/AgCl) | Soterix Medical | 2100 | For current delivery (electrode). |
| Pin-type electrode cap | Soterix Medical | 2100 | For implant protection. |
| Body Electrode (Ag/AgCl Coated) | Soterix Medical | 2100 | For current delivery (electrode). |
| Saline Solution (0.9%) | FarmaX | 7896902206441 | Conducting medium for current delivery. |
| Standard Tweezers or Forceps | - | - | For tDCS setup. |
| Real Time Polymerase Chain Reaction | |||
| BioRad CFX96 Real Time System | BioRad | C1000 | For qPCR |
| SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL) | BioRad | 1725271 | For qPCR |
| Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96 | BioRad | HSP9601 | For qPCR |
| Microseal "B" seal pct c/ 100 | BioRad | MSB1001 | For qPCR |
References
- Filmer, H. L., Dux, P. E., Mattingley, J. B. Applications of transcranial direct current stimulation for understanding brain function. Trends in Neurosciences. 37 (12), 742-753 (2014).
- Nitsche, M. A., Paulus, W. Sustained excitability elevations induced by transcranial DC motor cortex stimulation in humans. Neurology. 57 (10), 1899-1901 (2001).
- Kronberg, G., Bridi, M., Abel, T., Bikson, M., Parra, L. C. Direct Current Stimulation Modulates LTP and LTD: Activity Dependence and Dendritic Effects. Brain Stimulation. 10 (1), 51-58 (2017).
- Pelletier, S. J., Cicchetti, F. Cellular and Molecular Mechanisms of Action of Transcranial Direct Current Stimulation: Evidence from In Vitro and In Vivo Models. International Journal of Neuropsychopharmacology. 18 (2), pyu047 (2015).
- Chang, M. C., Kim, D. Y., Park, D. H. Enhancement of cortical excitability and lower limb motor function in patients with stroke by transcranial direct current stimulation. Brain Stimulation. 8 (3), 561-566 (2015).
- Lefaucheur, J. P., et al. Evidence-based guidelines on the therapeutic use of transcranial direct current stimulation (tDCS). Clinical Neurophysiology. 128 (1), 56-92 (2017).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Marquez-Ruiz, J., et al. Transcranial direct-current stimulation modulates synaptic mechanisms involved in associative learning in behaving rabbits. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 6710-6715 (2012).
- Jackson, M. P., et al. Animal models of transcranial direct current stimulation: Methods and mechanisms. Clinical Neurophysiology. 127 (11), 3425-3454 (2016).
- Cambiaghi, M., et al. Brain transcranial direct current stimulation modulates motor excitability in mice. The European journal of neuroscience. 31 (4), 704-709 (2010).
- Monte-Silva, K., et al. Induction of late LTP-like plasticity in the human motor cortex by repeated non-invasive brain stimulation. Brain Stimulation. 6 (3), 424-432 (2013).
- San-Juan, D., et al. Transcranial Direct Current Stimulation in Mesial Temporal Lobe Epilepsy and Hippocampal Sclerosis. Brain Stimulation. 10 (1), 28-35 (2017).
- Brunoni, A. R., et al. Transcranial direct current stimulation (tDCS) in unipolar vs. bipolar depressive disorder. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 35 (1), 96-101 (2011).
- Brunoni, A. R., et al. Trial of Electrical Direct-Current Therapy versus Escitalopram for Depression. New England Journal of Medicine. 376 (26), 2523-2533 (2017).
- Boggio, P. S., et al. Prolonged visual memory enhancement after direct current stimulation in Alzheimer's disease. Brain Stimulation. 5 (3), 223-230 (2012).
- Cosentino, G., et al. Anodal tDCS of the swallowing motor cortex for treatment of dysphagia in multiple sclerosis: a pilot open-label study. Neurological Sciences. , 7-9 (2018).
- Kaski, D., Dominguez, R. O., Allum, J. H., Islam, A. F., Bronstein, A. M. Combining physical training with transcranial direct current stimulation to improve gait in Parkinson's disease: A pilot randomized controlled study. Clinical Rehabilitation. 28 (11), 1115-1124 (2014).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).
- Winkler, C., et al. Sensory and Motor Systems Anodal Transcranial Direct Current Stimulation Enhances Survival and Integration of Dopaminergic Cell Transplants in a Rat Parkinson Model. New Research. 4 (5), 17-63 (2017).
- Nasehi, M., Khani-Abyaneh, M., Ebrahimi-Ghiri, M., Zarrindast, M. R. The effect of left frontal transcranial direct-current stimulation on propranolol-induced fear memory acquisition and consolidation deficits. Behavioural Brain Research. 331 (May), 76-83 (2017).
- Souza, A., et al. Neurobiological mechanisms of antiallodynic effect of transcranial direct current stimulation (tDCS) in a mice model of neuropathic pain. Brain Research. 1682 (14-23), (2018).
- Woods, A. J., et al. A technical guide to tDCS, and related non-invasive brain stimulation tools. Clinical Neurophysiology. 127 (2), 1031-1048 (2016).
- Cogan, S. F., et al. Tissue damage thresholds during therapeutic electrical stimulation. Journal of Neural Engineering. 13, 2 (2017).
- Podda, M. V., et al. Anodal transcranial direct current stimulation boosts synaptic plasticity and memory in mice via epigenetic regulation of Bdnf expression. Scientific reports. 6 (October 2015), 22180 (2015).
