Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen

Summary

Her presenterer vi en kraftig og fysiologiske modell for å studere molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjon og intestinal absorpsjon, tynntarm isolert perfused rotte.

Abstract

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer appetitten og mat inntak, fordøyelsen, Nærings absorpsjon og distribusjon og etter prandial glukose utflukter. Forstå molekylære mekanismer som regulerer gut hormon sekresjon er grunnleggende for å forstå og oversette gut hormon fysiologi. Tradisjonelt mekanismene bak gut hormon sekresjon er enten studerte i vivo (i forsøksdyr eller mennesker) eller bruke gut hormon-sekresjon primære mucosal celle kulturer eller cellelinjer. Her introduserer vi en isolert perfused rotte tynntarmen som en alternativ metode for å studere gut hormon sekresjonen. Dydene av denne modellen er at den er avhengig av intakt tarmen, noe som betyr at den viser de fleste fysiologisk viktige parametere som ansvarlig for utskillelsen i i vivo studier, inkludert mucosal polarisering, paracrine relasjoner og ruter perfusjon/stimulans eksponering. I tillegg, og i motsetning til i vivo studier, gir tynntarm isolert perfused rotte nesten fullstendig eksperimentelle kontroll og direkte vurdering av sekresjon. I motsetning til in vitro studier er det mulig å studere både omfang og dynamikken av sekresjon og adresse viktig spørsmål, for eksempel hva stimuli forårsake utskillelse av ulike gut hormoner, fra hvilken side av tarmen (luminal eller vaskulær) er utskillelsen stimuleres, og analysere i detalj molekylær sensorer underliggende sekretoriske svaret. I tillegg er utarbeidelse en effektiv modell for studiet av intestinal absorpsjon og detaljer om dynamikken i intestinal absorpsjon inkludert ansvarlig transportører.

Introduction

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer nærings absorpsjon og næringsstoffer disposition, intestinal vekst og modulere appetitt¹. Gut hormoner er derfor involvert i mange grunnleggende fysiologiske prosesser, og forstå disse mønstrene av sekresjon og molekylære detaljene som kontrollerer utskillelsen av respektive hormoner er derfor viktig for våre grunnleggende fysiologiske forståelse og adressering translasjonsforskning aspekter av tarmen hormon handlinger; men hvordan kan man studere molekylære sensing mekanismene bak gut hormon sekresjonen? Generelt, hormon sekresjonen kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøksdyr), fra isolert gut forberedelser eller tarmen hormon-sekresjon primært cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer^{2,3, 4 , 5 , 6}. vår modell er isolert perfused rotte tynntarm, som er en fysiologisk relevante modell som gjør at utskillelsen av tarmen hormoner bli studert i detalj med optimale tidspunktet oppløsning (sekresjon priser kan fastsettes med helst base til andre), og resultatene er trolig overføres til en i vivo situasjonen⁷. Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan du utfører denne prosedyren, men først vil vi diskutere andre metoder for å studere gut hormon sekresjon, inkludert fordelene og ulempene av disse modellene sammenlignet tynntarmen isolert perfused rotte.

Hvis man ønsker å etablere om et bestemt stoff regulerer utskillelsen av bestemte gut hormoner, er studier i mennesker det endelige målet. Dermed, hvis en sammensatt viser store effekter på utskillelsen av én eller flere gut hormoner i Red (i vivo eller perfusions) eller fra hormon sekresjon celler (linjer eller primære celler), dette er bare relevant for medisin og menneskelige fysiologi hvis det kan bekreftes hos mennesker. Men det er klare grenser for typen studier som kan utføres i mennesker, og i vivo studier på forsøksdyr er derfor ofte det nest beste alternativet for slike studier. Mus og rotter er de mest brukte forsøksdyr antagelig på grunn av praktisk størrelse, lave kostnader og muligheten til å endre genetisk genene mistenkelige i konkret studiespørsmål (f.eks slå av en bestemt transporter eller reseptor). Generelt, i vivo modellene nytte blir fysiologisk intakt, men har også flere begrensninger. Viktigst, den lille størrelsen på gnagere, spesielt mus, er en begrensende faktor, som de fleste analyser for gut hormon kvantifisering krever minst 20 µL av plasma (og ofte mye mer), noe som betyr at minst 100 µL av blod må trekkes for å lage en kopi kvantifisering. Derfor er det bare mulig å få svært få prøver tilsvarende planlagte prøver og en eller to etter stimulering prøver (total blod volumet i en mus 20 g er ~1.4 mL). Følgelig potensielle sekretoriske svar (f.eks, raskt eller sent forekommende svar) kan derfor bli savnet.

I perfusjonsmåler modell, problemet er overvunnet, som stort utvalg volumer er oppnådd (flyt: 7,5 mL/min) og innsamlingsintervallene kan justeres for å sikre at rask og kortvarig svarene ikke er savnet (vi samle prøver hvert minutt)⁷ . Et annet problem med i vivo studier i gnagere er at de fleste gut hormoner er enda mer raskt eliminert eller metaboliseres enn i mennesker^8,9,10, som kan komplisere påfølgende biokjemiske analysen. For eksempel vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus på enda raskere enn hos mennesker (der T_1/2 er 1-2 min¹¹) og, enda viktigere, som spalting av GLP-1 i mus innebærer, i tillegg til N-terminal spalting av dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedverdigende enzymet hos mennesker), videre spalting av enzymet nøytrale endopeptidase 24.11¹². Følgelig gjeldende kommersielle analyser for kvantifisering av GLP-1, som enten basert på den intakte isoformen GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløyvde isoformen (9-39amide), vesentlig undervurderer GLP-1 sekresjon i mus og føre villedende resultater ¹². i isolerte perfused rotte tynntarm, de fleste av metabolismen av utskilles hormoner eliminert eller markert redusert, siden plasma-mediert fornedrelse unngåes, og lever/nyre/lungekreft utvinning/degradering deaktiveres fordi ( perfusate er samlet som det går tarmen).

Selvfølgelig viktig innsikt kan genereres ved bruk av genmodifiserte dyr, f.eks, natrium-glukose transporter-1 knockout mus¹³, men en detaljert vurdering av molekylære sensorene involvert i sekresjon ofte krever vurdering av flere molekylær områder, fra molekylær transportører ion kanaler og fra ulike G-protein-kombinert reseptorer intracellulær proteiner. For eksempel målrettet vi aktiviteten av ni ulike molekylær nettsteder når unraveling molekylær sensorene ansvarlig for glukose-stimulert GLP-1 sekresjon⁷. En lignende undersøkelse ville ikke være mulig i vivo som noen av forbindelsene som brukes har uspesifikke eller skadelig/dødelig effekt. For eksempel når du bruker perfused tarmen, var det mulig å vurdere rollen intra mobilnettet glukose metabolisme for utskillelsen av GLP-1 og neurotensin ved å blokkere ATP formasjon med 2-4-dinitrophenol^7,14 , samt rollen spenning-gated kalsium kanaler for Gallesyre stimulert GLP-1, NT og PYY sekresjon³. Faktisk kan svært giftige natrium kanal blokkering tetrodotoxin med hell brukes i perfusjon studiene. Til slutt, i perfusjonsmåler modell det kan direkte vurderes der i tarmen en viss sammensatt stimulerer utskillelsen av en viss hormon, som etterforskeren kan bare velge og forberede ønsket område til perfuse, og det kan undersøkes samtidig om en stimulans forårsaker sekresjon av aktivering av molekylære sensorer fra luminal eller vaskulær side av tarmen^3,15,16.

Sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen kan også bli studert ved bruk av tarmen tissue (inkludert menneskelig vev), primære intestinal kulturer (vanligvis fra mus), udødeliggjort hormon sekresjon cellelinjer (av mus eller menneskelige opprinnelse), av tarmen vev montert i Ussing rom eller organoids (begge oftest fra mus)^2,3,,^4,,^5,,^6,,^17,,¹⁸. Sammenlignet med intestinal perfusions, studier av menneskelige tarmen stykker, primært cellekulturer og linjer er teknisk enklere å utføre og er en raskere og billigere måte å generere data, men selvfølgelig studiet av tarmen stykker krever tilgang til friske menneskelige tarmen prøver. Men i disse modellene er normal celle polarisering av tarmen iboende tapt, betyr at disse modellene kan ikke brukes til å vurdere normal aktivering av molekylære sensorer, og absorpsjon prosesser også ikke kan studeres. Videre slike studier bruker vanligvis statisk incubations (for opptil flere h) som er svært ikke-fysiologiske og har ingenting å gjøre med cellene normale sekretoriske dynamikk, fordi secreted produktet ikke er fjernet og dermed kan tilbakemeldinger påvirke den utskillelse av hormoner. I kontrast i perfused tarmen fjernet skilles ut og absorbert molekyler effektivt av slimhinnene mikrosirkulasjonen som de er i vivo, sikre at transmucosal graderingene vedlikeholdes slik at absorpsjon og sekresjon kan oppstå med en normal hastighet. Videre kan cellekulturer ha dedifferentiated fra deres native enteroendocrine celle opprinnelse, og betyr at de er ikke lenger representant for de opprinnelige cellene i peptid innhold og uttrykk for molekylær sensorer, men de kan fortsatt skille ut hormonet i spørsmålet. Dette er for eksempel tilfellet for GLP-1 sekresjon cellen linjer¹⁹.

Det er derfor vår mening at primært cellekulturer eller celle linje studier er mest egnet for screening formål og utføre typer eksperimenter som ikke kan utføres i vivo eller i isolerte perfused tarmen. For eksempel, en ekte styrke primært cellekulturer og linje cellekulturer er at intra mobilnettet videregående messengers (f.eks Ca^{2 +}, leiren, NAD(P)H) kan overvåkes i sanntid og elektriske signalene med hormonet sekresjon celler kan undersøkt^20,21,22. I tillegg kan siRNA knockdown gjøres, som er spesielt nyttig hvis bestemt hemmere ikke tilgjengelig^{20,21,22,23,24}. Gut vev fra mus montert i Ussing rom har nylig blitt brukt for å studere molekylære mekanismer underliggende Gallesyre stimulert GLP-1 sekresjon, mens intestinal organoids (fra mus) og menneskelige tarmen stykker har også blitt brukt for å studere den molekylær detaljer gut hormon sekresjonen^17,25. Mens tidligere fordelene blir polarisert² omfatter alle disse modellene statiske incubations. Studier på menneskelige tarmen stykker, imidlertid dra fordel av menneskelige, i stedet for gnagere, vev som er viktig siden arter aldersforskjell vev uttrykk for 7TM reseptorer og molekylære transportører kan resultere i ulike molekylær sensing veier mellom arter. Faktisk de fleste dataene i dette feltet har blitt generert av studier på griser, mus eller rotter, og det er fortsatt flyktig om disse funnene kan overføres til mennesker. Det er betryggende at molekylære sensing mekanismer underlie glukose-stimulert GLP-1 sekresjon synes å ligne mellom mus, rotte, mann, og transcriptomic og peptidomic profilering av mus og L-menneskeceller avslørte sterk global likheter mellom de to arter^7,18,26,27.

I isolerte perfused rotte tynntarm, men har også noen begrensninger som bør vurderes. Viktigst, er det umulig å avgjøre om en gitt sekretoriske respons resultatene fra direkte aktivering av testen stoffet målrettet hormon-produserende cellene eller snarere er forårsaket av en indirekte mekanisme. For eksempel KCl øker kjapt GLP-1 sekret fra perfused tarmen⁷, men det er ukjent om dette er en konsekvens av direkte depolarization L-cellen eller resultatene fra depolarization av neurons nær L-cellene eller virkningen av ble paracrine stimulators/hemmere. Oppstår fra studier med perfused tarmen som mål å belyse molekylære mekanismer underliggende sekresjon bør derfor alltid settes i sammenheng med data fra andre mer spesifikke modeller å øke muligheten til å opprette kausalitet. For eksempel, glukose-stimulert GLP-1 sekret fra GLP-1 secreting celle linjen GLUTag^28,29 og hovedknappen på musen L-celler, avhenger av aktiviteten til glukose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokkerer disse transportører i tynntarmen perfused rotte også demper sekresjon²⁰, noe som betyr at det er sannsynlig at glukose-stimulert GLP-1 sekresjon er hovedsakelig formidlet av direkte handlinger av glukose L-cellen. En annen viktig begrensning av isolerte perfused tarmen er at noen av lipider er vanskelig å studere på grunn av deres hydrophobicity. Selv om det er mulig å undersøke siste produkter av lipid fordøyelse (fettsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selv om utarbeidelse kunne re forestre lipider intra-cellularly og kanskje pakke dem inn chylomicrons, transport av chylomicrons celler og deres påfølgende opptak av lacteals av villi blir forstyrret, siden lymfe strømmer i isolerte tarmen ikke kan sikres. Mest sannsynlig, derfor lipid absorpsjon er stoppet når absorbert produktene begynner å samle i cellene. I vitro celle systemene er enda mindre egnet for lipid studier fordi polarisering. Selvfølgelig denne begrensningen gjelder bare for lipider som er absorbert og transportert via lacteals, mens de absorberes via intestinal blodårer er sannsynlig å behandles normalt.

Protocol

Alle studier ble gjennomført med tillatelse fra dansk dyr eksperimenter Inspectorate (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske komiteen, i henhold til veiledning av danske lovgivning om dyr eksperimentering (1987) og National Institutter for helse (publikasjonsnummer 85-23). 1. forsøksdyr Få Wistar hannrotter (250 g) og huset 2 per bur, ad lib tilgang til standard chow og vann, og opprettholde i en 12:12 h lys og mørke syklus. Hotellet dyr bruker ikke-behandlet vann og Alrtromin…

Representative Results

Muligheten til å bestemme om en bestemt stimulans forårsaker utskillelsen av tarmen hormonet av interesse er avhengig av en jevn planlagte sekret. Videre, hvis ingen svar på stimulans er observert, robust sekretoriske Svar å positiv kontrollen være tydelig å utelukke at mangelen på respons til test stimulans ikke gjenspeiler en generell mangel på respons. Figur 2A og 2B viser et eksempel på god kvalitetsdata. GLP-1 sekret fra tynntar…

Discussion

Tynntarmen isolert perfused rotten er et kraftig søkeverktøy som lar dynamikk og molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen å bli undersøkt i detalj. Det viktigste trinnet for vellykket produksjon av data med denne modellen er kirurgisk operasjon. Håndtering av tarmen vil uunngåelig føre til noen skade på tarmen og bør holdes til et absolutt minimum. Enda viktigere, er hastigheten på operasjonen nøkkelen, særlig med hensyn til tidspunktet for kateter plassering i hvem arterien. Vår erfaring …

Materials

Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)	Merck	1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)	Merck	102382
Dextran 70	Pharmacosmos	40014
Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)	Sigma Aldrich	F9642
Glucose (C6H12O6)	Merck	108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)	Merck	105886
Potasium chloride (KCl)	Merck	104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck	104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)	Merck	106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck
Sodium chloride (NaCl)	Merck	106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)	Merck	106445
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system	Harvard Bioscience, Inc.	732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834	Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz	Harvard Bioscience, Inc.	730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm	Harvard Bioscience, Inc.	733313