Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58533
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and NNF Centre for Basic Metabolic Research, The Panum Institute, University of Copenhagen

Summary

Her presenterer vi en kraftig og fysiologiske modell for å studere molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjon og intestinal absorpsjon, tynntarm isolert perfused rotte.

Abstract

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer appetitten og mat inntak, fordøyelsen, Nærings absorpsjon og distribusjon og etter prandial glukose utflukter. Forstå molekylære mekanismer som regulerer gut hormon sekresjon er grunnleggende for å forstå og oversette gut hormon fysiologi. Tradisjonelt mekanismene bak gut hormon sekresjon er enten studerte i vivo (i forsøksdyr eller mennesker) eller bruke gut hormon-sekresjon primære mucosal celle kulturer eller cellelinjer. Her introduserer vi en isolert perfused rotte tynntarmen som en alternativ metode for å studere gut hormon sekresjonen. Dydene av denne modellen er at den er avhengig av intakt tarmen, noe som betyr at den viser de fleste fysiologisk viktige parametere som ansvarlig for utskillelsen i i vivo studier, inkludert mucosal polarisering, paracrine relasjoner og ruter perfusjon/stimulans eksponering. I tillegg, og i motsetning til i vivo studier, gir tynntarm isolert perfused rotte nesten fullstendig eksperimentelle kontroll og direkte vurdering av sekresjon. I motsetning til in vitro studier er det mulig å studere både omfang og dynamikken av sekresjon og adresse viktig spørsmål, for eksempel hva stimuli forårsake utskillelse av ulike gut hormoner, fra hvilken side av tarmen (luminal eller vaskulær) er utskillelsen stimuleres, og analysere i detalj molekylær sensorer underliggende sekretoriske svaret. I tillegg er utarbeidelse en effektiv modell for studiet av intestinal absorpsjon og detaljer om dynamikken i intestinal absorpsjon inkludert ansvarlig transportører.

Introduction

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer nærings absorpsjon og næringsstoffer disposition, intestinal vekst og modulere appetitt1. Gut hormoner er derfor involvert i mange grunnleggende fysiologiske prosesser, og forstå disse mønstrene av sekresjon og molekylære detaljene som kontrollerer utskillelsen av respektive hormoner er derfor viktig for våre grunnleggende fysiologiske forståelse og adressering translasjonsforskning aspekter av tarmen hormon handlinger; men hvordan kan man studere molekylære sensing mekanismene bak gut hormon sekresjonen? Generelt, hormon sekresjonen kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøksdyr), fra isolert gut forberedelser eller tarmen hormon-sekresjon primært cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vår modell er isolert perfused rotte tynntarm, som er en fysiologisk relevante modell som gjør at utskillelsen av tarmen hormoner bli studert i detalj med optimale tidspunktet oppløsning (sekresjon priser kan fastsettes med helst base til andre), og resultatene er trolig overføres til en i vivo situasjonen7. Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan du utfører denne prosedyren, men først vil vi diskutere andre metoder for å studere gut hormon sekresjon, inkludert fordelene og ulempene av disse modellene sammenlignet tynntarmen isolert perfused rotte.

Hvis man ønsker å etablere om et bestemt stoff regulerer utskillelsen av bestemte gut hormoner, er studier i mennesker det endelige målet. Dermed, hvis en sammensatt viser store effekter på utskillelsen av én eller flere gut hormoner i Red (i vivo eller perfusions) eller fra hormon sekresjon celler (linjer eller primære celler), dette er bare relevant for medisin og menneskelige fysiologi hvis det kan bekreftes hos mennesker. Men det er klare grenser for typen studier som kan utføres i mennesker, og i vivo studier på forsøksdyr er derfor ofte det nest beste alternativet for slike studier. Mus og rotter er de mest brukte forsøksdyr antagelig på grunn av praktisk størrelse, lave kostnader og muligheten til å endre genetisk genene mistenkelige i konkret studiespørsmål (f.eks slå av en bestemt transporter eller reseptor). Generelt, i vivo modellene nytte blir fysiologisk intakt, men har også flere begrensninger. Viktigst, den lille størrelsen på gnagere, spesielt mus, er en begrensende faktor, som de fleste analyser for gut hormon kvantifisering krever minst 20 µL av plasma (og ofte mye mer), noe som betyr at minst 100 µL av blod må trekkes for å lage en kopi kvantifisering. Derfor er det bare mulig å få svært få prøver tilsvarende planlagte prøver og en eller to etter stimulering prøver (total blod volumet i en mus 20 g er ~1.4 mL). Følgelig potensielle sekretoriske svar (f.eks, raskt eller sent forekommende svar) kan derfor bli savnet.

I perfusjonsmåler modell, problemet er overvunnet, som stort utvalg volumer er oppnådd (flyt: 7,5 mL/min) og innsamlingsintervallene kan justeres for å sikre at rask og kortvarig svarene ikke er savnet (vi samle prøver hvert minutt)7 . Et annet problem med i vivo studier i gnagere er at de fleste gut hormoner er enda mer raskt eliminert eller metaboliseres enn i mennesker8,9,10, som kan komplisere påfølgende biokjemiske analysen. For eksempel vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus på enda raskere enn hos mennesker (der T1/2 er 1-2 min11) og, enda viktigere, som spalting av GLP-1 i mus innebærer, i tillegg til N-terminal spalting av dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedverdigende enzymet hos mennesker), videre spalting av enzymet nøytrale endopeptidase 24.1112. Følgelig gjeldende kommersielle analyser for kvantifisering av GLP-1, som enten basert på den intakte isoformen GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløyvde isoformen (9-39amide), vesentlig undervurderer GLP-1 sekresjon i mus og føre villedende resultater 12. i isolerte perfused rotte tynntarm, de fleste av metabolismen av utskilles hormoner eliminert eller markert redusert, siden plasma-mediert fornedrelse unngåes, og lever/nyre/lungekreft utvinning/degradering deaktiveres fordi ( perfusate er samlet som det går tarmen).

Selvfølgelig viktig innsikt kan genereres ved bruk av genmodifiserte dyr, f.eks, natrium-glukose transporter-1 knockout mus13, men en detaljert vurdering av molekylære sensorene involvert i sekresjon ofte krever vurdering av flere molekylær områder, fra molekylær transportører ion kanaler og fra ulike G-protein-kombinert reseptorer intracellulær proteiner. For eksempel målrettet vi aktiviteten av ni ulike molekylær nettsteder når unraveling molekylær sensorene ansvarlig for glukose-stimulert GLP-1 sekresjon7. En lignende undersøkelse ville ikke være mulig i vivo som noen av forbindelsene som brukes har uspesifikke eller skadelig/dødelig effekt. For eksempel når du bruker perfused tarmen, var det mulig å vurdere rollen intra mobilnettet glukose metabolisme for utskillelsen av GLP-1 og neurotensin ved å blokkere ATP formasjon med 2-4-dinitrophenol7,14 , samt rollen spenning-gated kalsium kanaler for Gallesyre stimulert GLP-1, NT og PYY sekresjon3. Faktisk kan svært giftige natrium kanal blokkering tetrodotoxin med hell brukes i perfusjon studiene. Til slutt, i perfusjonsmåler modell det kan direkte vurderes der i tarmen en viss sammensatt stimulerer utskillelsen av en viss hormon, som etterforskeren kan bare velge og forberede ønsket område til perfuse, og det kan undersøkes samtidig om en stimulans forårsaker sekresjon av aktivering av molekylære sensorer fra luminal eller vaskulær side av tarmen3,15,16.

Sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen kan også bli studert ved bruk av tarmen tissue (inkludert menneskelig vev), primære intestinal kulturer (vanligvis fra mus), udødeliggjort hormon sekresjon cellelinjer (av mus eller menneskelige opprinnelse), av tarmen vev montert i Ussing rom eller organoids (begge oftest fra mus)2,3,,4,,5,,6,,17,,18. Sammenlignet med intestinal perfusions, studier av menneskelige tarmen stykker, primært cellekulturer og linjer er teknisk enklere å utføre og er en raskere og billigere måte å generere data, men selvfølgelig studiet av tarmen stykker krever tilgang til friske menneskelige tarmen prøver. Men i disse modellene er normal celle polarisering av tarmen iboende tapt, betyr at disse modellene kan ikke brukes til å vurdere normal aktivering av molekylære sensorer, og absorpsjon prosesser også ikke kan studeres. Videre slike studier bruker vanligvis statisk incubations (for opptil flere h) som er svært ikke-fysiologiske og har ingenting å gjøre med cellene normale sekretoriske dynamikk, fordi secreted produktet ikke er fjernet og dermed kan tilbakemeldinger påvirke den utskillelse av hormoner. I kontrast i perfused tarmen fjernet skilles ut og absorbert molekyler effektivt av slimhinnene mikrosirkulasjonen som de er i vivo, sikre at transmucosal graderingene vedlikeholdes slik at absorpsjon og sekresjon kan oppstå med en normal hastighet. Videre kan cellekulturer ha dedifferentiated fra deres native enteroendocrine celle opprinnelse, og betyr at de er ikke lenger representant for de opprinnelige cellene i peptid innhold og uttrykk for molekylær sensorer, men de kan fortsatt skille ut hormonet i spørsmålet. Dette er for eksempel tilfellet for GLP-1 sekresjon cellen linjer19.

Det er derfor vår mening at primært cellekulturer eller celle linje studier er mest egnet for screening formål og utføre typer eksperimenter som ikke kan utføres i vivo eller i isolerte perfused tarmen. For eksempel, en ekte styrke primært cellekulturer og linje cellekulturer er at intra mobilnettet videregående messengers (f.eks Ca2 +, leiren, NAD(P)H) kan overvåkes i sanntid og elektriske signalene med hormonet sekresjon celler kan undersøkt20,21,22. I tillegg kan siRNA knockdown gjøres, som er spesielt nyttig hvis bestemt hemmere ikke tilgjengelig20,21,22,23,24. Gut vev fra mus montert i Ussing rom har nylig blitt brukt for å studere molekylære mekanismer underliggende Gallesyre stimulert GLP-1 sekresjon, mens intestinal organoids (fra mus) og menneskelige tarmen stykker har også blitt brukt for å studere den molekylær detaljer gut hormon sekresjonen17,25. Mens tidligere fordelene blir polarisert2 omfatter alle disse modellene statiske incubations. Studier på menneskelige tarmen stykker, imidlertid dra fordel av menneskelige, i stedet for gnagere, vev som er viktig siden arter aldersforskjell vev uttrykk for 7TM reseptorer og molekylære transportører kan resultere i ulike molekylær sensing veier mellom arter. Faktisk de fleste dataene i dette feltet har blitt generert av studier på griser, mus eller rotter, og det er fortsatt flyktig om disse funnene kan overføres til mennesker. Det er betryggende at molekylære sensing mekanismer underlie glukose-stimulert GLP-1 sekresjon synes å ligne mellom mus, rotte, mann, og transcriptomic og peptidomic profilering av mus og L-menneskeceller avslørte sterk global likheter mellom de to arter7,18,26,27.

I isolerte perfused rotte tynntarm, men har også noen begrensninger som bør vurderes. Viktigst, er det umulig å avgjøre om en gitt sekretoriske respons resultatene fra direkte aktivering av testen stoffet målrettet hormon-produserende cellene eller snarere er forårsaket av en indirekte mekanisme. For eksempel KCl øker kjapt GLP-1 sekret fra perfused tarmen7, men det er ukjent om dette er en konsekvens av direkte depolarization L-cellen eller resultatene fra depolarization av neurons nær L-cellene eller virkningen av ble paracrine stimulators/hemmere. Oppstår fra studier med perfused tarmen som mål å belyse molekylære mekanismer underliggende sekresjon bør derfor alltid settes i sammenheng med data fra andre mer spesifikke modeller å øke muligheten til å opprette kausalitet. For eksempel, glukose-stimulert GLP-1 sekret fra GLP-1 secreting celle linjen GLUTag28,29 og hovedknappen på musen L-celler, avhenger av aktiviteten til glukose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokkerer disse transportører i tynntarmen perfused rotte også demper sekresjon20, noe som betyr at det er sannsynlig at glukose-stimulert GLP-1 sekresjon er hovedsakelig formidlet av direkte handlinger av glukose L-cellen. En annen viktig begrensning av isolerte perfused tarmen er at noen av lipider er vanskelig å studere på grunn av deres hydrophobicity. Selv om det er mulig å undersøke siste produkter av lipid fordøyelse (fettsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selv om utarbeidelse kunne re forestre lipider intra-cellularly og kanskje pakke dem inn chylomicrons, transport av chylomicrons celler og deres påfølgende opptak av lacteals av villi blir forstyrret, siden lymfe strømmer i isolerte tarmen ikke kan sikres. Mest sannsynlig, derfor lipid absorpsjon er stoppet når absorbert produktene begynner å samle i cellene. I vitro celle systemene er enda mindre egnet for lipid studier fordi polarisering. Selvfølgelig denne begrensningen gjelder bare for lipider som er absorbert og transportert via lacteals, mens de absorberes via intestinal blodårer er sannsynlig å behandles normalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studier ble gjennomført med tillatelse fra dansk dyr eksperimenter Inspectorate (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske komiteen, i henhold til veiledning av danske lovgivning om dyr eksperimentering (1987) og National Institutter for helse (publikasjonsnummer 85-23).

1. forsøksdyr

  1. Få Wistar hannrotter (250 g) og huset 2 per bur, ad lib tilgang til standard chow og vann, og opprettholde i en 12:12 h lys og mørke syklus. Hotellet dyr bruker ikke-behandlet vann og Alrtromin gnager chow (1319 FORTI, Brogaarden, han, Danmark).
    Merk: Tillat dyr minst én uke med Akklimatisering.

2. preoperativ forberedelser

  1. Gjøre perfusjon buffer: Krebs-ringe bikarbonat buffer supplert med 0,1% BSA (brøkdel V), 5% dekstran T-70, 3,5 mmol/L glukose og 5 mmol/L pyruvate, fumarate og glutamat (hvis nødvendig); pH 7.4.
  2. Klargjør en tilstrekkelig mengde perfusjon bufferen ved å filtrere det gjennom en passende størrelse filter og justere pH til ~7.5 ved dropwise tillegg av 5 M HCl.
  3. Legge til 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (hvis nødvendig) direkte bufferen på dagen av studien å en final konsentrasjon av 10 µM.
    Merk: IBMX er en fosfodiesterase inhibitor som øker [cAMP]jeg og dermed gjenoppretter den sensitivitet og respons i tarmen i sekresjon hormoner til en sekretoriske stimulans.
  4. Forberede test løsning. Forberede vaskulær stimuli på en 20 x høyere konsentrasjon enn ønsket endelige konsentrasjonen i filtrert og pH-justert perfusjon buffer. Forberede luminal test stimuli i isotonic saltvann i siste konsentrasjon.
  5. Oppløse ikke lett løselig forbindelser i 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) og fortynne i perfusjon buffer eller isotonic saltvann. For vaskulær stimuli, holde siste DMSO konsentrasjonen på 1% eller nedenfor som konsentrasjoner over dette skader tarmen og kan føre til uspesifikke gut hormon sekresjonen. Måle pH og justere til ~7.5 om nødvendig.

3. driften og perfusjonsmåling

Merk: En illustrasjon av en perfusjonsmåling oppsett tilbys i figur 1.

  1. Bedøve rotter ved bruk av en anesthetic diett som kan opprettholde kirurgisk anestesi og analgesi for 30-40 min ved Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g kroppsvekt, per ml: Hypnorm: 0,08 mg fentanyl, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Methyl Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Propyl Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Danmark)
  2. Sjekke ledelsen reflekser (toe knip), plassere rotta på oppvarmet drifts tabellen og utføre et snitt i huden å utsette tarmen.
  3. Utsette den terminal delen av tykktarmen ved å flytte tynntarmen til side så mye som mulig. Binde for å forsyne blodkar til tykktarmen og skride gradvis fra delen terminal i tykktarmen, beveger seg mot tynntarmen.
    1. Hvis bare en bestemt del av tynntarmen kreves for perfusjon (øvre halvdel), avgiftsdirektoratet ikke nødvendige segmenter etter knytte av leverer blodkar. For å minimere skade på vev, fukte tarmen med isoton saltvann og bruke vattpinner fjerne bindevev.
  4. Sette inn et plastrør (lengde: ~ 15 cm, ytre diameter: ~0.4 cm) i intestinal lumen (i den proksimale delen) og knytte det riktig bruk av suturer. Skyll nøye med isoton saltvann (romtemperatur) å tømme lumen av kymus.
  5. Perfuse lumen med isoton saltkildene ved en flyt på 0,25 mL/min, 10 mL sprøyte er koblet til en sprøytepumpe.
  6. Flytt tarmen til side slik øvre hvem arterien er tilgjengelig og fjerne connective og fett vev for å avsløre arterien.
  7. Plassere to suturer under hvem arterien ved hjelp av fin spiss tang; en av bildet er for løfting arteria å kontrollere blødning når arterien har blitt kuttet, og den andre er for å sikre kateter som skal plasseres i arterien. Være forsiktig ikke for å autoperforering arterien.
  8. Plass to suturer under portalen blodåre for å sikre den metal kateter som skal plasseres i venen for samling av perfusjon avløpsvann.
  9. Før kutte hullet i hvem arterien, kan du kontrollere at kateter som kommer til innsatte i arterien er fylt med perfusjon buffer å forhindre luften embolus formasjon.
  10. Klippe et lite hull i hvem arterien med en kirurgisk saks og sett den plast kateter umiddelbart etter.
  11. Straks kateter er sikret, initiere perfusjon av tarmen ved oppstart av Berg-pumpe (strømningshastighet = 7,5 mL/min).
  12. Bekrefte at blodårer i tarmen blekne innen få sekunder og portalen blodåre blir blek.
  13. Umiddelbart etter riktig perfusjon er etablert, skjære hull i portalen blodåre, sett den metal kateter og fest den med suture.
    Merk: Kateter kan være vanskelig å sted, men løfte venen opp ved å trekke forsiktig mest proksimale Sutur hjelper.
  14. Når katetre er på plass og perfusjon resultatet er tilfredsstillende, kan du drepe rotta av membran perforering, være forsiktig med å rive ut katetre.
  15. Samle perfusjon utgang for 1 min og måle volumet. Start perfusjon press oppkjøpet/opptak ved klikk Utføre eksperimentet i trykk-brenningsprogram.
  16. Dekk tarmen med fuktet vev for å hindre det tørker ut under eksperimentet.
  17. Kontroller at distale tarmen ikke blokkeres slik at luminal avløpsvann kan avslutte, ellers tarmen vil hovne opp, ødem vil utvikle, perfusjon press vil øke og perfusjon utgang reduseres.
  18. La stå utarbeidelsen i ca 30 min før du starter eksperimentet.
    Merk: Sekretoriske resultatene av tarmen hormoner er svært ustø i de første 15 min av perfusjon, så dette balanse trinnet er nødvendig for å få en jevn plan.

4. eksperiment

  1. Etter ca 30 min av perfusjon, start eksperimentet ved å samle det første grunnleggende eksemplet bruker en brøkdel samler. Samle inn eksempler på det ønskede tidsintervallet (hvert minutt, 6.5-7.5 mL samles f.eks vanligvis) og plassere dem på is innen få minutter.
  2. Kontroller boble fellen regelmessig, og hvis tømt, fylle den med perfusjon buffer.
    1. Samle bufferen gjennom treveis kuk-ventilen umiddelbart før den kommer orgel og kateter inn i portalen blodåre (etter at det har vært perfused gjennom orgel) for å bekrefte at orgelet er metabolically aktiv. Samle inn eksempler på starten og slutten av eksperimentet å vurdere levedyktighet hele eksperimentet.
    2. Mål prøver raskt, med en automatisert blod-gass analyzer, som mest plast inneholder/sprøyter ikke er helt lufttette, gir opphav til å utveksle med atmosfærisk luft.
  3. Etter 10-15 min av planlagte samling, stimulere med første test stoffet. Administrere intra arteriell stimulations med en sprøytepumpe gjennom en treveis stopcock (flow = 0.350 mL/min).
  4. Utføre luminal stimulations ved første bolus injeksjon (2.5 mL/min over de første 5 min), for å erstatte isotonic saltkildene som allerede lumen, etterfulgt av administrasjonen av testen løsningen en lavere flow rate (0,5 mL/min).
  5. For å sikre at lumen tømmes raskt av testen når luminal stimulering perioden er over, tømme den intestinal lumen med isoton saltvann ved å bruke samme strømningshastigheter som ovenfor.
  6. Samle planlagte prøver for 15-30 min før neste test stoffet administreres. Avhengig av protokollen, kan 2-3 test stimuli vanligvis tas med per forsøk. Hvis eksperimentelle protokollen inneholder aktivisering/hemming av et molekylær område samtidig med administrering av en gitt secretagogue, alltid pre stimulere med aktivator/inhibitor 10-15 min før administrasjonen av secretagogue til Kontroller at webområdet molekylær hemmes på begynnelsen av secretagogue infusjon.
  7. På slutten av protokollen, administrere (5-10 min) en egnet positiv kontroll for å teste responsen til utarbeidelse og 10-15 min opprinnelige prøver etter stimulering periode.
    Merk: Flere test stoffer kan brukes som positive kontroll, f.eks, stimuli for økende [cAMP]jeg (f.eks foskolin eller IBMX), [Ca2 +]jeg (f.eks bombesin eller neuromedin C), depolarizing agenter (f.eks, 30-50 mM KCl) eller mer fysiologisk relevante stimuli som makronæringsstoffer: glukose, peptones, aminosyrer, etc. Valg av positiv kontroll avhenger imidlertid av eksperimentelle utfallet. Glukose er for eksempel en dårlig cholecystokinin (CCK) secretagogue mens bombesin ikke er en robust secretagogue for glukose-avhengige insulinotropic peptid (GIP) sekresjon30.
  8. Etter slutten av eksperimentet, avgiftsdirektoratet perfused tarmen, veie den og måle lengden. Sette den i paraformaldehyde og lagre den (4 ° C) for potensielle senere histochemical analyse av/vevsskade integritet, for eksempel ved H & E flekker.

5. biokjemiske målinger

  1. Kvantifisere konsentrasjoner av utskilles peptider i venøs avløpsvann ved bruk av en huset eller kommersielt tilgjengelige radioimmunoassays (RIA) eller ELISA-analyser. For studier som undersøker intestinal absorpsjon, kvantifisere molekylet interesse, f.eks, glukose eller aminosyrer, venøs avløpsvann.
    Merk: Perfusate er vanligvis en god basale buffer for de fleste analyser, inkludert analyser som enzymatiske reaksjoner (for eksempel kvantifisering av glukose av metoden glucoseoxidase).

6. dataanalyse

  1. Presentere data på forskjellige måter, for eksempel som en tid-konsentrasjon graf som viser den faktiske sekretoriske avgangen (flyt x konsentrasjon) og kolonnen handlingen viser totalen sekretoriske utgang under grunnlinjen og svar perioder (vanligvis 10-15 tidspunkt).
  2. Tomten faktisk målt konsentrasjonen av respektive hormoner som konsentrasjon. (pmol/L),
    Merk: Det anbefales at du i stedet uttrykke data som utgang (fmol/min) fordi med denne modellen, i motsetning til i vivo studier, innhentet verdiene er den faktiske sekretoriske avgangen (på grunn av konstant samlingen av perfusjon avløpsvann).
  3. Avhengig av antall grupper som skal analyseres statistisk, bruk tosidige koblet t-test (to grupper) eller veis VARIANSANALYSE for gjentatte målinger (mer enn to grupper) etterfulgt av en passende post-hoc test for flere sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muligheten til å bestemme om en bestemt stimulans forårsaker utskillelsen av tarmen hormonet av interesse er avhengig av en jevn planlagte sekret. Videre, hvis ingen svar på stimulans er observert, robust sekretoriske Svar å positiv kontrollen være tydelig å utelukke at mangelen på respons til test stimulans ikke gjenspeiler en generell mangel på respons. Figur 2A og 2B viser et eksempel på god kvalitetsdata. GLP-1 sekret fra tynntarm isolert perfused rotte vises på 1 minutters intervaller (betyr ± SEM). På basale forhold er sekresjon stødig; både før og etter administrasjon av testen stimulans (insulin), og en robust sekretoriske svar på positivt er kontroll (bombesin (BBS)) tydelig. I tillegg gjennomsnitt GLP-1 sekresjon på basale forhold (i respektive planlagte perioder før insulin eller BBS administrasjon) og gjennomsnitt sekresjon i insulin og BBS stimulering er vist som søylediagrammer (betyr ± SEM). Sekresjon ble testet for statistisk betydning veis VARIANSANALYSE for gjentatte målinger. Basert på disse kombinerte data, kan det konkluderes at intra arteriell insulin ikke stimulerer GLP-1 sekret fra tynntarm isolert perfused rotte.

Figur 2C og 2D viser et eksempel på GLP-1 sekret fra tynntarm isolert perfused rotte. I motsetning til figur 2A og 2Ber disse dataene av dårlig kvalitet; utskillelsen er usikre på basale forhold og driver oppover gjennom på en måte som synes å være relatert til å teste stoffet administrasjoner (intra-luminal og intra arteriell fruktose, henholdsvis) og positiv kontrollen, BBS, fører ikke Statistisk betydelig økt GLP-1 sekret. Det er derfor umulig å konkludere om fruktose stimulations gi opphav til GLP-1 sekresjon, f.eks, er økt GLP-1 utskillelsen på slutten av vaskulær fruktose stimulering fruktose-mediert svar eller ikke.

Figure 1
Figur 1: et eksempel på en perfusjonsmåling oppsett. Systemet består av en plexiglass stå, en oppvarmet operasjonsbordet, en varmeveksler med bygge i boble felle, manometer og spindel pumpe for perfusjon trykk justering. Perfusjon systemet er koblet til en termostatstyrt Sirkulator som varmer gasset (95% O2, 5% CO2) perfusjon buffer 37 ° C. I tillegg er perfusjon press registrert kontinuerlig og transduced av opptak trykktransduceren og visualisert og lagret på en PC med egnet programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Data fra tynntarm isolert perfused rotte. (A, B) et eksempel på en godt utført eksperimenter og pålitelige data, (C, D) et eksempel på sub-optimale data der perfusjon presset økt, og perfusjon produksjon redusert dramatisk over gang løpet av studien. (A) GLP-1 (totalt) utgang (fmol/min) vises på basale forhold og svar på intra arteriell insulin administrasjon (200 og 1.000 pM, som angitt). Bombesin (BBS), en velkjent, potente GLP-1 secretagogue, ble tilført intra-arterially på slutten av å kontroll for respons (pos. kontroll). Dataene presenteres som betyr ± SEM, n = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tynntarmen isolert perfused rotten er et kraftig søkeverktøy som lar dynamikk og molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen å bli undersøkt i detalj. Det viktigste trinnet for vellykket produksjon av data med denne modellen er kirurgisk operasjon. Håndtering av tarmen vil uunngåelig føre til noen skade på tarmen og bør holdes til et absolutt minimum. Enda viktigere, er hastigheten på operasjonen nøkkelen, særlig med hensyn til tidspunktet for kateter plassering i hvem arterien. Vår erfaring er at kateter plasseres vellykket, og perfusjonen bør igangsettes innen et par minutter etter kuttet hullet i fartøyet. Plasseringen av katetre er den mest utfordrende delen av operasjonen og kompliseres av den lille størrelsen på hvem arterien og tynn veggen av portalen blodåre, og dette trinnet krever litt øvelse. Rask innsetting av venekateter er imidlertid ikke så viktig som tilfellet for hvem arterien, som tarmen er nå blir perfused og holdt i live. Neste viktige trinn er å utføre eksperimentet. Hvis operasjonen ble utført, perfused tarmen vil vanligvis trives og være mottakelig for opp til 3t, og perfusjon press og utgang vanligvis forblir konstant over hele eksperimentet. Den viktigste faktoren for en vellykket eksperiment på dette stadiet er å unngå bobler å få inn i systemet, siden dette forårsaker luft embolisering som enten umiddelbart reduserer eller eliminerer perfusjon utdataene. Som perfusjon bufferen inneholder BSA og er gasset for å sikre tilstrekkelig oksygen levering til perfused tarmen, er det vanskelig å forhindre dannelsen av bobler helt. Bobler bør imidlertid være fanget i systemene boble fellen, men dette gradvis tømmes over tid (jo mer bobler, den raskere tømmer) og det er derfor viktig å holde nøye øye på boble fellen og fylle den med perfusjon buffer ved behov. Det er også viktig å holde pH perfusate under 7.5-øke pH, kalsiumkarbonat precipitates kan danne, hindrer kapillær flyt og forårsaker en alvorlig økning i perfusjon press.

Perfused tarmen er en ganske robust forberedelse, men det tåler ikke høye konsentrasjoner av vaskemidler som gallesyrer, etanol og DMSO. Derfor bruk av rengjøringsmidler bør helst unngås, men er noen ganger nødvendig å få dårlig løselig forbindelser i løsning. Perfused tarmen generelt tåler vaskemidler administrert intra-luminally bedre enn intra-vascularly. For eksempel ble administrasjon av 1 mM taurodeoxycholic syre (en sekundær, konjugert Gallesyre) tolerert godt når tilført intraluminally men umiddelbart førte til blokkerte perfusjon når levert intra-arterially2. For vaskulær stimulations, holde den endelige DMSO konsentrasjonen under 1% å unngå uspesifikke sekretoriske svar (DMSO stimulerer, for eksempel GLP-1 sekresjon) og til å unngå skade på vev resulterer i økt perfusjon trykk og redusert perfusjon utgang. Eksperimenter bør bli oversett hvis perfusjon produksjonen avtar med mer enn 20% i løpet av studien, hvis perfusjon trykket øker mer enn 20% eller ødem utvikler. Overholdelse av disse makroskopisk suksesskriteriene (inkludert rask innsetting av kateter arteria hvem) resulterer i god kvalitet ~14/15 eksperimenter.

Etter endt eksperimentet, er kritisk fremgangsmåten å velge riktig metode og analysen for kvantifisering av hormone(s) rundt. Høy lakkeringsverksteder assaying av peptidhormonene kan utføres ved hjelp av immunanalyser: radioimmunoassay eller ELISA. I alle fall, er det sterkt anbefalt å validere de respektive analyser før du bruker dem for eksempel kvantifisering, ikke alle kommersielt tilgjengelig analyser utfører tilfredsstillende når det gjelder følsomhet, spesifisitet og nøyaktighet (for eksempel om GLP-131). Med hensyn til spesifisitet er kryssreaktivitet som alltid en bekymring. Uspesifikke forstyrrelser og matrix effekter er generelt mindre uttalt med kunstig perfusates sammenlignet med plasma. Når det gjelder følsomhet, er det ofte mye enklere å få pålitelige data fra perfusions enn fra i vivo studier som peptid konsentrasjoner er ofte høyere fordi perfusjon avløpsvann ikke forsvinner i systemisk sirkulasjonen og fordi eliminasjon prosesser (av lever/lunge/nyre) unngås. Vanligvis planlagte konsentrasjonene i venøs utslipp ligger innen de fleste analyser lavere arbeider (ved GLP-1 (totalt), neurotensin (totalt) og PYY (totalt): 8-15 pmol/L) mens stimulert svar kan nå så høyt som 200-300 pmol/L3.

Sammenligning opprinnelige verdier av samme hormoner i plasma fra friske mennesker, rotte eller mus er vanligvis og 5-10 pmol/L mens svaret er 15-30 pmol/L3,32.

Hvis de forhåndsdefinerte suksesskriteriene følges, genererte perfusjon opplysningene er vanligvis av god kvalitet og den statistiske analysen er så enkelt. Sammenlignet utskillelsen av glukagon, insulin og somatostatin fra isolert perfused rotte eller mus bukspyttkjertelen, basale utskillelsen av tarmen hormoner er jevn og ganske likt mellom eksperimenter angående konsentrasjonene, og utskillelsen er ikke klart pulsatile. Kollektivt, variasjonen i datasettet er derfor minimal og en utvalgsstørrelsen så lite som tre perfusjon eksperimenter er ofte nok til statistisk betydning. Å standardisere og unngå type 2 feil, samt å redusere muligheten for utsikt over mindre godt uttales svar, anbefales imidlertid en utvalgsstørrelsen av seks til åtte.

I sammendraget er tynntarm isolert perfused rotten en viktig, fysiologisk relevant, eksperimentell modell som kan brukes til å undersøke de direkte virkningene av et gitt stoff på gut hormon sekresjonen. Viktig grunnleggende spørsmål, for eksempel hvor i tarmen en secretagogue stimulerer sekresjon, om det stimulerer sekresjon gjennom aktivering av luminally eller basolaterally ligger sensorer, og hvilke molekylær sensorer er aktivert og dermed ansvarlig for utskillelsen kan rettes i detalj med denne modellen. Det bør imidlertid, bli gjenkjent at uncoupling i tarmen fra donor dyr kan for noen studiespørsmål, være relevant. For eksempel tarmen samhandler tett med leveren (gut lever aksen) og hjernen (gut-hjerne aksen), og mekanismer som bruker dette cross-talk derfor ikke bli undersøkt med denne modellen. Kvaliteten på operasjonen er den avgjørende faktoren for kvalitet og de viktigste faktorene for en vellykket operasjon er å holde håndtering av tarmen til et minimum og raskt starte perfusjon av tarmen når arteria hvem har blitt kuttet. Det er vår erfaring at det tar 2-4 måneder av praksis før data av god kvalitet produseres. Men når teknikken har lært, er mulighetene for denne metoden nesten uendelige og bare begrenset av Løseligheten av test stoffer og potensielle skadelige effekter test stoffer kan ha på perfused vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne av dette arbeidet erklære noen mulige interessekonflikter relevant for denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en ubegrenset tilskudd til Prof Jens Juul Holst fra Novo Nordisk Center for grunnleggende metabolske forskning (Novo Nordisk Foundation, Danmark), en separat bevilgning fra Novo Nordisk Foundation for å gjøre gnager perfusjon studier (gi nei. NNF15OC0016574), et stipend til Prof Holst fra europeiske Research Council (Grant no.695069) og theEuropean Union er syvende rammeprogram for forskning, TechnologicalDevelopment og demonstrasjon aktiviteter (Grant nr. 266408) samt postdoc gi til Rune E. Kuhre fra Lundbeck Foundation (R264-2017-3492). Vi takker Jenna E. Hunt og Carolyn F. Deacon for forsiktig korrekturlesing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA) Merck 1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) Merck 102382
Dextran 70 Pharmacosmos 40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) Sigma Aldrich F9642
Glucose (C6H12O6) Merck 108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) Merck 105886
Potasium chloride (KCl) Merck 104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck 104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) Merck 106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck
Sodium chloride (NaCl) Merck 106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) Merck 106445
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system Harvard Bioscience, Inc. 732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels Harvard Bioscience, Inc. 730100
Windkessel Harvard Bioscience, Inc. 732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz Harvard Bioscience, Inc. 730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873 Harvard Bioscience, Inc. 733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm Harvard Bioscience, Inc. 733313

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
  3. Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
  4. Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
  5. Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
  6. Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
  7. Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
  8. Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
  9. Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
  10. Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
  11. Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
  12. Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
  13. Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
  14. Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
  15. Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
  16. Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
  17. Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
  18. Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
  19. Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
  22. Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
  23. Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
  24. Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
  25. Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
  26. Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
  27. Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
  28. Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
  29. Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
  30. Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
  31. Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
  32. Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).

Tags

Medisin problemet 144 bortgjemte perfused rotte tynntarm molekylær sensorer gut hormon sekresjon Nærings absorpsjon intakt mobilnettet polarisering glukagon som pepide-1 metoder for å studere gut hormon sekresjonen.
Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuhre, R. E., Holst, J. J.… More

Kuhre, R. E., Holst, J. J. Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine. J. Vis. Exp. (144), e58533, doi:10.3791/58533 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter