Summary
在这里, 我们提出了一个强大的生理模型, 研究肠道激素分泌和肠道吸收的分子机制-孤立的灌注大鼠小肠。
Abstract
肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节食欲和食物的摄入、消化、营养的吸收和分配, 以及餐后葡萄糖出游。了解调节肠道激素分泌的分子机制是理解和转化肠道激素生理的基础。传统上, 肠道激素分泌的机制要么在体内研究 (在实验动物或人类), 要么使用肠道激素分泌的初级黏膜细胞培养或细胞系。在这里, 我们介绍了一个孤立的灌注大鼠小肠作为研究肠道激素分泌的替代方法。该模型的优点是, 它依赖于完整的肠道, 这意味着它重述了大多数生理上重要的参数, 负责分泌在体内的研究, 包括粘膜极化, 副父母关系和途径刺激暴露。此外, 与体内研究不同的是, 孤立的灌注大鼠小肠可以进行几乎完整的实验控制和直接评估分泌物。与体外研究不同的是, 有可能研究分泌物的大小和动态, 并解决重要的问题, 比如什么刺激会导致不同肠道激素的分泌, 肠道的哪一侧 (腔或血管) 是分泌物刺激, 并详细分析分泌反应背后的分子传感器。此外, 该制剂是研究肠道吸收的有力模型, 也是包括负责运输者在内的肠道吸收动力学细节的有力模型。
Introduction
肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节营养吸收和营养倾向, 肠道生长和调节食欲1。因此, 肠道激素参与了许多基本的生理过程, 了解这些分泌模式和控制各自激素分泌的分子细节对我们的基本生理很重要了解和解决肠道激素作用的翻译方面;但如何研究肠道激素分泌的分子传感机制呢？一般来说, 激素分泌可以研究完整的生物体 (人或实验动物), 从孤立的肠道制剂或肠道激素分泌的原代细胞培养物或永生细胞培养 2,3,4 个,5,6. 我们喜欢的模型是孤立的灌注大鼠小肠, 这是一个生理上相关的模型, 可以用最佳的时间分辨率详细研究肠道激素的分泌 (分泌率可以随时确定从下面到第二个), 结果很可能是可转移到体内的情况7。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 如何执行这个程序, 但首先, 我们将讨论研究肠道激素分泌的其他方法, 包括这些模型相比, 孤立的灌注大鼠小肠的好处和局限性。
如果你想确定一个特定的化合物是否调节某些肠道激素的分泌, 在人类的研究是最终目标。因此, 如果一种化合物对啮齿类动物 (体内或灌注) 或激素分泌细胞 (细胞系或原生细胞) 中的一种或几种肠道激素的分泌有很大影响, 这种作用只有在能够得到证实的情况下, 才与医学和人体生理有关在人类。然而, 可以在人类身上进行的研究类型有明确的限制, 因此, 对实验动物的体内研究往往是此类研究的第二好选择。老鼠和老鼠是最常用的实验动物, 大概是因为它们体积小、成本低, 而且可以选择从基因上改变被怀疑参与特定研究问题的基因 (例如, 击倒某个传送器或受体)。一般来说, 体内模型受益于生理上的完整, 但也有几个局限性。最重要的是, 啮齿类动物, 特别是老鼠的小尺寸是一个限制因素, 因为大多数肠道激素定量检测需要至少20μl 的血浆 (而且往往更多), 这意味着至少需要提取100μl 的血液才能复制量化。因此, 只能获得与基线样本和一个或两个刺激后样本相对应的极少数样本 (小鼠的总血量为 ~ 1.4 ml)。因此, 可能会漏掉潜在的分泌反应 (例如, 快速或后期发生的反应)。
在灌注模型中, 这个问题被克服了, 因为获得了大量的样品量 (流量: 7.5 mL/min), 并且可以根据需要调整收集间隔, 以确保快速和短期的反应不会被错过 (我们每分钟收集样本)7.啮齿类动物体内研究的另一个问题是, 大多数肠道激素的消除或代谢速度甚至比人类8、9、10 更快, 这可能会使随后的生化分析复杂化。例如, 我们表明, glp-1 在小鼠体内的代谢速度甚至比人类快 (其中 t-----一半是 1-2分钟11), 更重要的是, 在小鼠体内的 glp-1 裂解除了 n 端裂解外, 还包括 n 端裂解。二肽肽酶-4 (dpp4) (是人类主要的 glp-1 降解酶), 进一步裂解酶中性内皮肽酶 24.11 12.因此, 目前对 glp-1 定量的商业检测, 要么是基于 glp-1 (7-36amide 胺) 的完整异形, 要么是基于 dpp-4 切割异形 (9-39 酰胺), 大大低估了小鼠的 glp-1 分泌, 导致了误导的结果12. 在孤立的灌注大鼠小肠中, 分泌激素的大部分代谢被消除或明显减少, 因为可以避免血浆介导的降解, 并防止肝肾肺/肺分泌降解 (因为香水是收集, 因为它离开肠道)。
当然, 使用转基因动物可以产生重要的洞察力, 例如钠葡萄糖转运体- 1 淘汰赛小鼠 13, 但对参与分泌的分子传感器进行详细评估往往需要考虑多个分子位点, 从分子转运到离子通道, 从不同的 g-蛋白质偶联受体到细胞内蛋白质。例如, 当我们分解负责葡萄糖刺激 glp-1 分泌的分子传感器 7时, 我们针对九个不同分子位点的活动.在体内不可能进行类似的调查, 因为所使用的一些化合物具有不具体或有害的致命影响。例如, 当使用灌注肠道时, 可以通过用 2-4-dinitro酚7, 14 阻断 atp 形成来评估细胞内葡萄糖代谢对 glp-1 和神经紧张素分泌的作用, 以及压门控钙通道对胆汁酸刺激 glp-1、nt 和 pyy 分泌物 3。事实上, 剧毒钠通道阻滞剂河豚毒素可以成功地应用于灌注研究。最后, 在灌注模型中, 可以直接评估在肠道中某种化合物刺激某种激素分泌的地方, 因为研究者可以简单地选择和准备所需的区域进行灌注, 同时也可以对其进行调查刺激是否通过激活来自肠道腔侧或血管侧的分子传感器引起分泌 3,15,16。
肠道激素分泌的分泌机制也可以通过肠道组织块 (包括人体组织)、初级肠道培养 (通常来自小鼠)、永生激素分泌细胞系 (老鼠或人类来源)、肠道来研究安装在使用室或由有机体 (最常见的是从小鼠)2,3,4,5, 6,17,18的组织。与肠道灌注相比, 对人体肠道溃疡的研究、原代细胞培养物和细胞系在技术上更容易进行, 是一种更快、更便宜的数据生成方式, 但当然, 对肠道碎片的研究需要获得新鲜的人体肠道标本。然而, 在这些模型中, 肠道的正常细胞极化本质上是丢失的, 这意味着这些模型不能用来评估分子传感器的正常激活, 吸收过程也不能研究。此外, 这类研究通常采用静态孵育 (长达几个 h), 这是高度非生理的, 与细胞的正常分泌动力学无关, 因为分泌的产品没有被去除, 因此可能会反馈影响激素的分泌。相反, 在灌注的肠道中, 分泌和吸收的分子在体内被黏膜微循环有效去除, 从而确保黏膜上的梯度得到维持, 从而以正常的速度进行吸收和分泌。此外, 细胞培养物可能与其本地肠内分泌细胞起源的分化, 这意味着它们在肽含量和分子传感器表达方面不再代表原生细胞, 尽管它们可能仍然存在分泌有问题的激素。例如, glp-1 分泌细胞系19的情况就是如此.
因此, 我们认为, 初级细胞培养物或细胞系研究最适合于筛查目的, 也最适合进行体内或孤立的灌注肠道内无法进行的类型实验。例如, 原代细胞培养物和细胞系培养物的真正强度是, 可以实时监测细胞内的二级信使 (如 ca2 +、camp、nad (p) h), 并可实时监测激素分泌细胞的电信号。调查了 20,21,22。此外, sirna 击倒可以做, 这是特别有用的, 如果没有特定的抑制剂没有20,21,22,23,24。最近, 安装在 ussing 室内的小鼠的肠道组织被用来研究胆汁酸刺激 glp-1 分泌的分子机制, 而肠道有机体 (来自小鼠) 和人类肠道碎片也被用来研究肠道激素分泌的分子细节17,25。而前者的好处是从两极分化2所有这些模型涉及静态孵化。然而, 对人类肠道碎片的研究受益于使用人类而不是啮齿类动物组织, 这一点很重要, 因为7tm 受体和分子转运体在组织表达方面的物种差异可能会导致它们之间的分子传感路径不同物种。事实上, 这一领域的大多数数据都是通过对猪、老鼠或老鼠的研究产生的, 这些发现能否转移到人类身上仍然是难以捉摸的。然而, 令人放心的是, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌的分子传感机制在小鼠、大鼠、人、细胞的转录和肽分析中似乎相似, 显示出强大的全球强这两个物种之间的相似性7,18,26,27。
然而, 孤立的灌注大鼠小肠也有一些局限性, 应该加以考虑。最重要的是, 不可能确定特定分泌反应是由目标激素产生细胞的测试物质直接激活产生的结果, 还是由间接机制引起的。例如, kcl 立即增加 glp-1 分泌从灌注肠 7, 但它仍然是未知的是 l 细胞的直接去极化的结果, 或由靠近 l 细胞的神经元去极化或影响同时释放副分泌物刺激物抑制剂。因此, 利用灌注肠道进行的研究所产生的数据, 其目的是阐明分泌物背后的分子机制, 应始终结合从其他更具体的模型获得的数据, 以提高建立因果 关系。例如, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌细胞系 glutag28、29和原代小鼠 l 细胞的葡萄糖刺激 glp-1 分泌依赖于葡萄糖转运体 (sglt1 和 glut2) 的活性。将这些转运体阻断在灌注大鼠小肠中也会减弱分泌物20, 这意味着葡萄糖刺激的 glp-1 分泌物很可能主要是由葡萄糖对 l 细胞的直接作用介导的。孤立的灌注肠的另一个重要限制是, 由于脂质的疏水性, 一些脂质难以研究。虽然有可能研究脂质消化的最终产物 (脂肪酸、二乙酰甘油、溶血磷脂酰甘油等), 虽然制剂可能能够重新酯化细胞内的脂质, 也许可以将其包装成细胞内的脂质乳胶, 从细胞中运输的子, 以及它们随后被绒毛的乳汁吸收, 都被破坏了, 因为孤立的肠道中的淋巴流动无法得到保障。因此, 一旦被吸收的产物开始在细胞中积累, 脂质吸收很可能会停止。体外细胞系统由于缺乏极化而更不适合进行脂质研究。显然, 这种限制只适用于通过乳牙吸收和运输的脂类, 而通过肠道血管吸收的脂质很可能得到正常处理。
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Protocol
所有研究都是在丹麦动物实验监察局 (2013-15-2934-00833) 和地方道德委员会的许可下, 根据丹麦动物实验立法准则 (1987年) 和国家动物实验立法的准则进行的。卫生研究院 (出版物编号 85-23)。
1. 实验动物
- 获得雄性 wistar 大鼠 (250 克) 和每个笼子的房子 2, 与广告的脂肪访问标准的食物和水, 并保持在12:12 小时的光暗周期。我们的动物设施使用未经处理的水和 alrtromin 啮齿类动物 (1319 forti, brogaarden, lynge, 丹麦)。
注意: 允许动物至少一周的适应。
2. 术前准备
- 进行灌注缓冲: 克瑞格-林格碳酸氢酯缓冲液, 辅以 0.1% bsa (v 部分)、5% 糊精 t-70、3.5 mmol 葡萄糖和 5 mmoll 丙酮酸、富马酸盐和谷氨酸 (如有需要);ph 值7.4。
- 通过适当的过滤器尺寸过滤, 准备足够数量的灌注缓冲液, 并通过滴加 5m hcl 将 ph 值调整到 ~ 7.5。
- 在研究当天, 将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (ibmx) (如有需要) 直接添加到缓冲液中, 最终浓度为10μm。
请注意:ibmx 是一种磷酸二酯酶抑制剂, 它能增加 [camp ] i, 从而恢复肠道在分泌激素对分泌刺激的敏感性和反应能力方面。 - 准备测试解决方案。在过滤和 ph 调整的灌注缓冲液中, 以20x 高于所需的最终浓度的速度准备血管刺激。在最后浓度的同位素盐水中准备腔内测试刺激。
- 在100% 二甲基亚硫酸 (dmso) 中溶解不容易溶解的化合物, 并在灌注缓冲液或同位素盐水中进一步稀释。对于血管刺激, 保持最终 dmso 浓度在1% 或以下, 因为高于此水平的浓度会损害肠道, 并可能导致不特异性的肠道激素分泌。测量 ph 值, 并在需要时调整到 ~ 7.5。
3. 操作和灌注
请注意:图 1提供了灌注设置的示意图。
- 用数十名咪唑安定 (0.3 ml·100克体重) 麻醉大鼠, 该麻醉剂可维持手术麻醉和镇痛 30-40, 每毫升: 低范数: 0.08 毫克芬太尼, 2.5 毫克氟沙酮, 0.08 毫克对羟基苯甲酸甲酯, 0.05 毫克对羟基苯甲酸丙酯, 咪唑安定: 1.25 毫克, 基质制药, hellerup, 丹麦)
- 检查缺乏反射 (脚趾捏), 把老鼠放在加热的手术台上, 并执行皮肤切口, 以暴露肠道。
-
通过尽可能地将小肠移到一边, 暴露结肠的末端部分。为结肠提供血管的领带, 并逐渐将其从结肠的末端开始, 向小肠移动。
- 如果只有小肠的某一部分是需要灌注 (上半部分), 在捆绑供应血管后, 切除非必需的段。为了最大限度地减少组织损伤, 用同位素盐水滋润肠道, 并使用棉签去除结缔组织。
- 将塑料管 (长度: ~ 15 厘米, 外径: ~ 0.4 厘米) 插入肠腔 (近端部分), 并使用缝合线将其正确系好。用同位素盐水 (室温) 小心冲洗, 清空的腔。
- 使用连接到注射器泵的10毫升注射器, 在 0.25 mlmin 的流量下, 用同位素盐水完美地使用管腔。
- 将肠道移到一边, 使肠系膜上动脉可进入, 并切除结缔组织和脂肪组织, 以暴露动脉。
- 用细点钳将两个缝线放置在肠系膜动脉下;其中一个缝合线是在动脉被切断后抬起动脉控制出血, 另一个缝合线是用来固定要放置在动脉中的导管。小心不要射孔动脉。
- 将两个缝线放置在门静脉下, 以固定将放置在静脉中的金属导管, 以收集灌注废水。
- 在切断肠系膜动脉的孔之前, 请确保要插入动脉的导管充满灌注缓冲液, 以防止空气血栓形成。
- 用一把手术剪刀在肠系膜动脉上切开一个小孔, 然后立即插入塑料导管。
- 导管固定后, 立即启动滚子泵 (流量 = 7.5 mL/min), 启动肠道灌注。
- 确认肠道内的血管变白, 门静脉变白。
- 在建立适当的灌注后, 立即在门静脉上切开一个洞, 插入金属导管, 用缝合线固定。
请注意:导尿管可能很难放置, 但通过谨慎地拉动最近端缝合线将静脉抬起来有帮助。 - 一旦导管就位, 灌注输出令人满意, 用隔膜穿孔杀死大鼠, 注意不要撕开导管。
- 收集灌注输出 1分钟, 测量体积。通过单击压力记录程序中的执行实验, 开始灌注压力和记录。
- 用湿润的组织覆盖肠道, 防止其在实验过程中干涸。
- 确保肠远端不被阻塞, 使腔内的排泄物可以排出, 否则肠会膨胀, 水肿会发展, 灌注压力会增加, 灌注输出会下降。
- 在开始实验之前, 请将准备工作留约30分钟。
请注意:在灌注的前 15分钟, 肠道激素的分泌输出非常不稳定, 因此需要这一平衡步骤才能得到稳定的基线。
4. 实验
- 经过大约30分钟的灌注, 开始实验, 通过收集第一个基线样本使用分数收集器。在所需的时间间隔收集样品 (例如, 通常每分钟收集6.5-7.5 毫升), 并在几分钟内将其放置在冰上。
-
定期检查气泡疏水阀, 如果清空, 请使用灌注缓冲液填充气泡。
- 在进入器官之前, 通过三向旋静脉阀收集缓冲液, 并从插入门静脉的导管 (在通过器官灌注后) 收集缓冲液, 以确认器官在代谢上是活跃的。在实验开始和结束时收集样本, 以评估整个实验的可行性。
- 使用自动血气分析仪快速测量样品, 因为大多数塑料容器/注射器并不完全密封, 从而导致与大气中的空气交换。
- 在10-15 的基线收集后, 用第一检测物质刺激。使用注射器泵通过三通塞子 (流量 = 0.350 mL/min) 进行动脉内刺激。
- 通过最初的小球注射 (2.5 ml%, 在前 5分钟) 进行腔内刺激, 以取代已经在流明中的同位素盐水, 然后给出较低的流量 (0.5 mlmin) 的测试溶液。
- 为确保在腔刺激期结束后, 将肠腔迅速排空, 用与上述相同的流量冲洗肠道腔。
- 在施用下一项试验物质之前, 收集15-30 的基线样本。根据协议的不同, 通常每个实验可包含2-3 次测试刺激。如果实验协议包括在给某一特定分泌者同时进行对某一特定分子位点的激活抑制, 则在给出分泌物之前, 总是用活性抑制剂进行前刺激10-15。确保在分泌物输注一开始就抑制分子位点。
- 在协议结束时, 管理 (5-10) 适当的阳性控制, 以测试制剂的反应能力, 并在刺激期之后收集10-15 基线样本。
请注意:一些测试物质可用作阳性对照, 例如, 用于增加 [camp]i (例如, foskolin 或 ibmx)、 [ca 2 +] i (例如, 炸弹素或神经素 c)、去极化剂 (例如, 30-50 mm kcl) 或更多生理上相关的刺激, 如宏量营养素: 葡萄糖、肽、氨基酸等。然而, 阳性控制的选择取决于实验结果。例如 , 葡萄糖是一个糟糕的胆囊素 ( cck ) 分泌剂 , 而炸弹不是一个强大的分泌剂葡萄糖依赖性胰岛素促性腺激素肽 ( ) 分泌 30 . - 实验结束后, 对灌注的肠道进行切除, 称重, 并测量其长度。将其放入甲醛中, 并将其存储 (4°c), 以便对组织完整性/损伤进行潜在的后期组织化学分析, 例如 h & e 染色。
5. 生化测量
- 使用内部或市售的放射免疫检测 (ria) 或 elisa-faset"测定, 定量静脉污水中分泌肽的浓度。对于研究肠道吸收的研究, 量化静脉出水中感兴趣的分子,例如葡萄糖或氨基酸。
请注意:在大多数分析中, 通常是一个很好的基础缓冲液, 包括依赖酶反应的检测 (例如通过葡萄糖氧化酶法定量葡萄糖)。
6. 数据分析
- 以不同的方式提供数据, 例如作为显示实际分泌输出 (流动 x 浓度) 的时间集中图, 以及作为描述基线和响应期间 (通常为10-15 个时间点) 的总分泌输出的柱图。
- 绘制各自激素的实际被测量的集中作为集中单位。(pmol/L),
请注意:最好将数据表示为输出 (fmolsmin), 因为使用此模型, 与体内研究不同的是, 获得的值是实际的分泌输出 (因为不断收集灌注废水)。 - 根据要进行统计分析的组数, 使用双尾配对 t 检验 (两组) 或单向方差分析进行重复测量 (两个组以上), 然后进行适当的后临时测试以进行多次比较。
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Representative Results
确定某一刺激是否会导致感兴趣的肠道激素分泌的能力依赖于稳定的基线分泌。此外, 如果没有观察到对刺激的反应, 对积极控制的强有力的分泌反应必须明显排除对刺激措施缺乏反应并不反映普遍缺乏反应。图 2 a 和2A显示了高质量数据的一个示例;glp-1 分泌从孤立的灌注大鼠小肠显示在1分钟的间隔 (手段±sem)。在基础条件下, 分泌物是稳定的;在给药之前和之后, 对阳性控制 (炸弹素 (bbs) 的反应是显而易见的。此外, 在基础条件下 (在胰岛素或 bbs 给药之前的相应基线期间) 的平均 glp-1 分泌, 以及胰岛素和 bbs 刺激期间的平均分泌物显示为条形图 (手段±sem)。用单向方差分析对重复测量的分泌进行了统计意义测试。根据这些综合数据, 可以得出结论, 动脉内胰岛素不会刺激 glp-1 分泌从孤立的灌注大鼠小肠。
图 2c和2d显示了一个从孤立的灌注大鼠小肠中分泌 glp-1 的例子。与图 2 a和2A 不同, 这些数据质量较差;分泌物在基部条件下不稳定, 并以似乎与测试物质管理 (分别为腔内和动脉内果糖) 无关的方式向上漂移, 而阳性对照 bbs 不会导致统计学显著增加 glp-1 分泌。因此, 不可能断定果糖刺激是否会产生 glp-1 分泌物, 例如,在维氧果糖刺激的末端增加 glp-1 分泌物是否为果糖介导的反应。
图 1: 灌注设置的示例.该系统由有机玻璃支架、加热工作台、带气泡疏水阀的热交换器、压力表和用于灌注压力调节的主轴泵组成。灌注系统连接到恒温循环器, 将气体 (95% o2, 5% co2) 灌注缓冲液加热到37°c。此外, 灌注压力连续记录, 由压力记录传感器进行转换, 可视化, 并将其保存在 pc 上, 并使用合适的软件进行保存。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 孤立灌注大鼠小肠的数据.(a, b) 一个表现良好的实验和可靠数据的例子, (c, d) 一个例子, 在灌注压力增加, 灌注输出在研究的过程中大幅下降的次优数据。(a) glp-1 (总) 输出 (fmol/min) 显示在基础条件下, 并响应动脉内胰岛素给药 (如所示, 200 和 1, 000 pm)。bombesin (bbs) 是一种著名的、强大的 glp-1 秘书, 在实验结束时被注入动脉内, 以控制反应性 (pos. 控制)。数据以±sem、 n = 4 的方式表示。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
孤立的灌注大鼠小肠是一个强大的研究工具, 使动态和分子机制下的肠道激素分泌的细节研究。使用此模型成功生成数据的最关键步骤是手术。肠道的处理将不可避免地对肠道造成一些损害, 因此应保持在绝对的最低限度。更重要的是, 手术速度是关键, 特别是在肠系膜动脉中放置导管的时间方面。我们的经验是, 导尿管应该成功放置, 在切断血管上的洞之后, 应该在几分钟内启动灌注。导管的放置是手术中最具挑战性的部分, 由于肠系膜动脉体积小和门静脉壁薄, 使导管的放置变得复杂, 这一步需要一些实践。快速插入静脉导管, 但是, 并不像肠系膜动脉的情况下, 肠道现在是灌注和保持活着的情况下。下一个关键步骤是执行实验。如果手术成功, 灌注的肠道通常会茁壮成长, 反应长达 3小时, 灌注压力和输出通常在整个实验中保持不变。在这一阶段成功的实验最重要的因素是避免气泡进入系统, 因为这会导致空气栓塞, 从而立即减少或消除灌注输出。由于灌注缓冲液含有 bsa, 并被气化, 以确保足够的氧气输送到灌注的肠道, 很难完全防止气泡的形成。然而, 气泡应该被困在系统的气泡陷阱中, 但随着时间的推移, 气泡会逐渐清空 (气泡越多, 排空速度越快), 因此, 密切监视气泡陷阱并在需要时将其填充回灌时非常重要。同样重要的是, 在 ph 值增加的情况下, 可能会形成碳酸钙沉淀物, 阻碍毛细血管流动, 并导致灌注压力的严重上升。
灌注肠是一种相当坚固的制剂, 但它不能耐受高浓度的洗涤剂, 如胆汁酸, 乙醇和 dmso。因此, 最好避免使用洗涤剂, 但有时需要将难溶性化合物转化为溶液。灌注的肠道一般耐受洗涤剂在发光环境下比血管内更好地施用。例如, 在铝内注入时, 给予 1 mm tauro脱氧胆酸 (继发性共轭胆汁酸) 耐受性良好, 但在动脉内给予2时, 会立即导致灌注输出受阻。对于血管刺激, 将最终的 dmso 浓度保持在1% 以下, 以避免不特异性的分泌反应 (dmso 刺激, 例如 glp-1 分泌), 并避免造成组织损伤, 导致灌注压力增加和灌注减少输出。如果在研究过程中灌注输出减少20% 以上, 如果灌注压力增加超过20% 或如果水肿发生, 实验应不予理会。坚持这些宏观成功标准 (包括在肠系膜动脉中快速插入导管) 通常会在 ~ 14/15 项实验中获得良好的质量。
实验完成后, 下一个关键的过程是选择适当的方法和方法来定量感兴趣的激素。通过放射免疫测定: 放射免疫法或 elisa 法, 可以对肽激素进行高通量测定。无论如何, 强烈建议在使用相应的检测进行样品定量之前对其进行验证, 因为并非所有商业上可用的检测在灵敏度、特异性和准确性方面都能令人满意 (有关示例glp-131)。关于特殊叉反应一如既往地是一个令人关切的问题。与等离子体相比, 人工灌注剂的异常干扰和基质效应一般不那么明显。关于敏感性, 从灌注中获得可靠数据往往比从体内研究中获得可靠数据要容易得多, 因为多肽浓度往往更高, 因为灌注废水没有稀释到全身循环中, 而且避免消除过程 (由 liver/lung/肾脏)。通常情况下, 静脉污水中的基线浓度位于大多数检测的较低工作范围内 (在 glp-1 (总计)、神经紧张素 (总数) 和 pyy (总数) 的情况下), 而受刺激的反应可达到 200-300 pmol/L.
相比之下, 健康人类、大鼠或小鼠血浆中相同激素的基线值通常为 5-10 pmol/L, 而反应值为 15-30 pmol/L,32。
如果遵守预定的成功标准, 生成的灌注数据通常质量良好, 然后统计分析很简单。与孤立的灌注大鼠或小鼠胰腺分泌的胰高血糖素、胰岛素和生长抑素相比, 肠道激素的基础分泌是稳定的, 在测量浓度的实验中相当相似, 而不存在分泌明显的脉动。因此, 总体而言, 数据集的变化是最小的, 样本大小低至三个灌注实验往往足以达到统计意义。但是, 为了标准化和避免类型2错误, 以及减少忽略不太明显的响应的可能性, 建议采用6到8的样本大小。
总之, 孤立的灌注大鼠小肠是一个重要的, 生理上相关的实验模型, 可用于研究给定物质对肠道激素分泌的直接影响。重要的根本问题, 例如哪里在肠道中的分泌物刺激分泌物, 它是否刺激分泌物通过激活发光或水平侧定位的传感器, 并且哪些分子传感器被激活, 因而负责该模型可详细讨论分泌物。然而, 应该认识到, 对于一些研究问题来说, 肠道与捐赠动物的分离可能是相关的。例如, 肠道与肝脏 (肠胃-肝轴) 和大脑 (肠脑轴) 紧密互动, 因此无法用这种模型来研究依赖这种交叉对话的机制。手术质量是数据质量的关键因素, 手术成功的最重要因素是将肠道处理控制在最低限度, 并在肠系膜动脉被切断后迅速开始排成肠道。我们的经验是, 需要2-4 的练习才能产生高质量的数据。然而, 一旦了解到这一技术, 这种方法的可能性几乎是无穷无尽的, 只受到测试物质的溶解度和任何潜在的破坏性影响可能对灌注组织的限制。
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Disclosures
这项工作的作者声明没有与本文有关的潜在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了诺和诺德基本代谢研究中心 (丹麦诺沃诺德基金会) 的 jens juul holst 教授不受限制的资助, 这是诺和诺德基金会为进行鼠患灌注研究而提供的一笔单独赠款 (赠款编号)。nnf15oc0016574), 欧洲研究理事会 (第66969号赠款) 和欧洲联盟第七个研究、技术发展和示范活动框架方案 (266408 赠款) 的霍尔斯特教授赠款以及博士后伦德贝克基金会向 rune e. kuhre 提供的赠款 (R264-2017-3492)。我们感谢詹娜·亨特和卡洛琳·迪肯仔细校对。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
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