Summary
Aquí, presentamos un modelo potente y fisiológico para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal y la absorción intestinal: el intestino aislado de rata perfundidos.
Abstract
El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan el apetito e ingesta de alimentos, digestión, absorción de nutrientes y distribución y excursiones de glucosa post-prandial. Comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la secreción de la hormona intestinal es fundamental para entender y traducir la fisiología de la hormona intestinal. Tradicionalmente, los mecanismos subyacentes a la secreción de hormona intestinal tampoco se estudiaron in vivo (en animales o seres humanos) utilizando o mucosa primaria secretor de hormona de tripa cultivos celulares de células. Aquí, presentamos un intestino aislado de rata perfundidos como un método alternativo para el estudio de secreción de la hormona intestinal. Las virtudes de este modelo son que se basa en el intestino intacto, lo que significa que recoge la mayoría de los parámetros fisiológicamente importantes responsables de la secreción en estudios in vivo, incluyendo mucosa polarización, paracrina relaciones y vías de exposición de perfusión/estímulo. Además y a diferencia de los estudios in vivo, el intestino aislado de rata perfundidos permite casi completo control experimental y evaluación directa de la secreción. En contraste con estudios in vitro, es posible estudiar la magnitud y la dinámica de la secreción y para responder preguntas importantes, como qué estímulos provocan secreción de hormonas intestinales diferentes, de qué lado de la tripa (luminal o vascular) es la secreción de estimulado y analizar en sensores moleculares detalle subyacente de la respuesta secretora. Además, la preparación es un poderoso modelo para el estudio de la absorción intestinal y detalles con respecto a la dinámica de la absorción intestinal, incluyendo los transportadores de la responsables.
Introduction
El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan la absorción de nutrientes y eliminación de nutrientes, crecimiento intestinal y modulan apetito1. Las hormonas del intestino, por lo tanto, participan en muchos procesos fisiológicos fundamentales, y entender estos patrones de secreción y los detalles moleculares que controlan la secreción de las hormonas respectivas así es importante para nuestra básica fisiológica comprensión y para abordar aspectos traslacionales de la acciones de la hormona del intestino; pero, ¿cómo puede uno estudiar los mecanismos de detección moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal? En general, la secreción de la hormona puede estudiarse en organismos intactos (los seres humanos o animales de experimentación), preparaciones de intestino aislado o de culturas de célula primaria secretor de hormona del intestino o inmortalizado células culturas2,3, 4 , 5 , 6. nuestro modelo preferido es el intestino aislado de rata perfundidos, que es un modelo fisiológico relevante que permite la secreción de hormonas del intestino que se estudiarán en detalle con una resolución de tiempo óptimo (secreción de tasas se pueden determinar con cualquier tiempo en la base hasta el segundo), y los resultados son probablemente transferibles a una situación en vivo7. Aquí proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo realizar este procedimiento, pero primero vamos a comentar otros métodos para estudiar la secreción de la hormona intestinal, incluyendo los beneficios y limitaciones de estos modelos en comparación con el intestino aislado de rata perfundidos.
Si se desea establecer si un compuesto específico regula la secreción de ciertas hormonas del intestino, estudios en seres humanos son el objetivo final. Así, si un compuesto muestra grandes efectos sobre la secreción de una o varias hormonas del intestino en roedores (en vivo o perfusiones) o de hormonas secretoras células (líneas celulares o células primarias), este efecto sólo es relevante a la medicina y la fisiología humana puede confirmarse en los seres humanos. Sin embargo, hay límites claros para el tipo de estudios que pueden realizarse en seres humanos, y estudios in vivo en animales experimentales suelen ser, por lo tanto, la segunda mejor opción para este tipo de estudios. Ratones y ratas son los animales experimentales más utilizados presumiblemente debido a su tamaño conveniente, bajo costo y la opción de modificar genéticamente los genes sospechados de participar en las preguntas de estudio específico (por ejemplo, golpear de un transportador de algunos o receptor). En general, modelos en vivo se benefician de ser fisiológicamente intacta, pero también tienen varias limitaciones. Lo más importante, el tamaño pequeño de los roedores, especialmente ratones, es un factor limitante, como la mayoría los análisis para la cuantificación de la hormona intestinal requieren por lo menos 20 μl de plasma (y a menudo mucho más), lo que significa que al menos 100 μl de sangre debe ser retirado para hacer un duplicado cuantificación. Por lo tanto, sólo es posible obtener muy pocas muestras correspondientes a las muestras de línea de base y uno o dos post estimulación (el volumen total de sangre en un ratón de 20 g es de ~1.4 mL). En consecuencia, posibles respuestas secretoras (e.g., rápidamente o tardía de las respuestas) por lo tanto puede ser faltada.
En el modelo de perfusión, es superar este problema, como muestra grandes volúmenes se obtienen (caudal: 7,5 mL/min) y los intervalos de colección pueden ajustarse según sea necesario para asegurar que no falten las respuestas rápidas y corta duración (recoge muestras cada minuto)7 . Otro tema con en vivo los estudios en roedores es que la mayoría de las hormonas intestinales es aún más rápidamente eliminado o metabolizada que en los seres humanos8,9,10, que puede complicar el posterior análisis bioquímico. Por ejemplo, hemos demostrado que el GLP-1 se metaboliza en ratones a un ritmo incluso más rápido que en los seres humanos (donde T1/2 es 1-2 min11) y, más importante, que consiste en la separación de GLP-1 en ratones, además de escote N-terminal por dipeptidil-peptidasa-4 (DPP4) (que es la principal enzima degradante de la GLP-1 en los seres humanos), más escote por la enzima endopeptidasa neutral 24.1112. En consecuencia, actuales ensayos comerciales para la cuantificación de GLP-1, que se basan ya sea en la isoforma intacta de la GLP-1 (7-36amide) o el isoform de la DPP-4 troceados (9-39amide), enormemente subestiman la secreción de GLP-1 en ratones y resultan engañosa resultados 12. en el intestino aislado de rata perfundidos, la mayor parte del metabolismo de las hormonas secretadas es eliminado o reducido marcado, ya que se evita la degradación mediada por el plasma, y se previene la extracción o degradación del hígado, riñón, pulmón porque ( solución es de recogida ya que deja el intestino).
Por supuesto, penetración importante puede ser generada por el uso de animales genéticamente modificados, por ejemplo,, sodio glucosa transportador-1 nocaut ratones13, pero requiere de una evaluación detallada de los sensores moleculares implicados en la secreción de a menudo consideración de múltiples sitios moleculares, que van desde transportadores moleculares en canales del ion y de diversos receptores g-proteína-juntados a las proteínas intracelulares. Por ejemplo, hemos dirigido la actividad de los nueve diferentes sitios moleculares cuando desentrañar los sensores moleculares responsables de la secreción de GLP-1 estimula la glucosa7. Una investigación similar no sería posible en vivo como algunos de los compuestos usados tienen inespecíficas o efectos nocivos/letales. Por ejemplo, cuando se utiliza la perfusión intestinal, fue posible evaluar la función del metabolismo intracelular de la glucosa para la secreción de GLP-1 y neurotensin bloqueando la formación de ATP con 2-4-dinitrofenol7,14 , así como el papel de los canales de calcio voltaje-bloqueado de ácidos biliares estimulan la secreción de GLP-1, NT y PYY3. De hecho, el tetrodotoxin de bloqueador de canal de sodio altamente tóxico puede ser aplicado con éxito en los estudios de perfusión. Por último, en el modelo de perfusión se puede ser directamente evaluada donde en el intestino un cierto compuesto estimula la secreción de ciertas hormonas, como el investigador puede simplemente elegir y preparar la región deseada para perfusión, y al mismo tiempo puede ser investigado Si un estímulo provoca secreción mediante la activación de sensores moleculares del lado luminal o vascular del intestino3,15,16.
Los mecanismos secretores de hormona intestinal subyacente también puede ser estudiado por el uso de piezas de tejido del intestino (incluyendo tejidos humanos), hormona de cultivos intestinales primarios (generalmente de ratones), inmortalizadas secretoras de líneas celulares (de ratón o de origen humano), por tripa tejido montada en usar cámaras u organoides (tanto más a menudo de ratones)2,3,4,5,6,17,18. En comparación con perfusiones intestinales, estudios en cultivos celulares primarios, líneas celulares y pedazos de intestino humano son técnicamente fáciles de realizar y son una forma más rápida y más barata de generación de datos, pero por supuesto el estudio de pedazos de intestino requiere acceso al intestino humano fresco muestras. Sin embargo, en estos modelos la polarización normal de las células de la tripa es inherentemente perdida, lo que significa que estos modelos no se puede utilizar para evaluar la activación normal de los sensores moleculares, y también no pueden estudiarse los procesos de la absorción. Por otra parte, estos estudios generalmente emplean incubaciones estática (de hasta varios h) que es altamente no-fisiológico y nada tiene que ver con dinámicas de secreción normal de las células, ya que no se quita el producto secretado y así puede influir en la regeneración la secreción de hormonas. En cambio, en el perfusión del intestino, secretadas y absorbentes moléculas son eficientemente eliminadas mediante la microcirculación mucosa como son en vivo, asegurando que los gradientes de la vía transmucosa se mantienen para que la absorción y la secreción pueden ocurrir a un ritmo normal. Además, pueden haber dedifferentiated cultivos celulares desde su origen células enteroendocrinas nativo, lo que significa que ya no son representante de las células nativas en cuanto a contenido del péptido y la expresión de sensores moleculares, aunque pueden todavía secretan la hormona en cuestión. Esto es, por ejemplo, el caso de GLP-1 células secretoras líneas19.
Por lo tanto, es nuestra opinión que las culturas de célula primaria o célula línea de estudios son más adecuados para fines de investigación y para realizar experimentos de tipos que no pueden ser realizados en vivo o en el intestino aislado perfundido. Por ejemplo, una verdadera fuerza de las culturas de célula primaria y cultivos de la línea de celulares es eso secundario intracelular mensajeros (por ejemplo Ca2 +, campamento, NAD(P)H) puede ser monitoreado en tiempo real, y eléctrico de señalización de la hormona que secreta las células puede ser investiga20,21,22. Además, caída de siRNA puede hacer, que es especialmente útil si inhibidores específicos no están disponibles20,21,22,23,24. Tejido intestinal de los ratones montados en cámaras de usar recientemente se ha utilizado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes estimulada secreción de GLP-1 ácido de bilis, mientras organitas intestinal (de ratones) y pedazos de intestino humano también han sido utilizados para el estudio de la detalles moleculares de tripa hormona secreción17,25. Mientras que los anteriores beneficios de ser polarizaron2 todos estos modelos implican incubaciones estática. Estudios en piezas del intestino humano, sin embargo, beneficiarán del uso de tejido humano, en lugar de roedores, lo que es importante puesto que la diferencia de especies en la expresión de tejido de receptores 7TM y transportadores moleculares podrán resultar en diferentes vías moleculares de detección entre especies. De hecho, más datos en este campo ha sido generados por estudios en cerdos, ratones o ratas, y sigue siendo difícil de alcanzar si estos resultados pueden ser transferidos a los seres humanos. Sin embargo, es reconfortante que los mecanismos de detección moleculares que subyacen la glucosa estimula la secreción de GLP-1 parecen ser similar entre ratón, rata, hombre, y transcriptómicos y perfiles de peptidomic de ratón y células humanas de L revelaron fuerte global semejanzas entre las dos especies7,18,26,27.
El intestino aislado de rata perfundidos, sin embargo, también tiene algunas limitaciones que deben ser considerados. Lo más importante, es imposible determinar si una determinada respuesta secretora resulta de activación directa por la sustancia de las células productoras de hormonas específicas o, más bien es causada por un mecanismo indirecto. Por ejemplo, KCl al instante aumenta la secreción de GLP-1 de la perfusión del intestino7, pero se desconoce si esto es consecuencia de la despolarización directa de la célula de L o resulta de la despolarización de las neuronas cerca de las células de L o los efectos de simultáneamente lanzó estimuladores/inhibidores de paracrina. Datos derivados de estudios con el perfusión del intestino que pretenden dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la secreción, por lo tanto, siempre se pongan en contexto con datos obtenidos de otros modelos más específicos para aumentar la capacidad de establecer causalidad. Por ejemplo, estimulada por la glucosa la secreción de GLP-1 de la línea celular secreción de GLP-1 GLUTag28,29 y de primario de ratón células de L depende de la actividad de los transportadores de glucosa (SGLT1 y GLUT2). Bloqueo de estos transportadores en el intestino de rata perfundidos también atenúa la secreción20, lo que significa que es probable que glucosa estimula la secreción de GLP-1 es mediada en gran parte por acciones directas de la glucosa en la célula de L. Otra limitación importante del intestino aislado perfundido es que algunos de los lípidos son difíciles de estudiar debido a su hidrofobicidad. Aunque es posible investigar los productos finales de la digestión de lípidos (ácidos grasos, diacil gliceroles, lysophosphatidylglycerols, etc.) y a pesar de la preparación puede ser capaces de volver a esterificar los lípidos intra cellularly y tal vez el paquete en quilomicrones, el transporte de los quilomicrones en las células y su posterior absorción por el quilífero de las vellosidades se interrumpe, ya que el flujo de linfa en el intestino aislado no puede fijarse. Por lo tanto, muy probablemente, absorción de los lípidos se detiene una vez que los productos absorbidos comienzan a acumularse en las células. Los sistemas celulares in vitro son aún menos adecuados para estudios de lípidos debido a su carencia de la polarización. Obviamente, esta limitación sólo es relevante para los lípidos que son absorbidos y transportados vía el quilífero, que los absorben a través de los vasos sanguíneos intestinales suelen ser manejado normalmente.
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Protocol
Todos los estudios se llevaron a cabo con la autorización de la inspección de experimentos animales danés (2013-15-2934-00833) y el Comité de ética local, siguiendo las directrices de la legislación danesa sobre experimentación animal (1987) y el nacional Institutos de salud (número de publicación 85-23).
1. animales
- Obtener las ratas macho Wistar (250 g) y casa 2 por jaula, con acceso ad libitum a chow estándar y agua y mantener en un 12:12 h ciclo de luz-oscuridad. Nuestras instalaciones de animales utiliza agua no tratada y Alrtromin chow roedor (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Dinamarca).
Nota: Deje que los animales al menos una semana de aclimatación.
2. preoperatorios preparados
- Hacer buffer de perfusión: tampón bicarbonato de Krebs-Ringer suplementado con 0,1% BSA (fracción V), fumarato T-70, 3,5 mmol/L glucosa y piruvato de 5 mmol/L, 5% dextran y glutamato (si es necesario); pH 7.4.
- Prepare una cantidad suficiente de tampón de perfusión por filtración a través de un tamaño adecuado del filtro y ajustar el pH a ~7.5 por adición gota a gota de 5 M HCl.
- Añadir 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (si es necesario) directamente en el búfer en el día del estudio a una concentración final de 10 μm.
Nota: IBMX es un inhibidor de la fosfodiesterasa que aumenta la [cAMP] y tal modo restaura la sensibilidad y la capacidad de respuesta de la tripa en cuanto a la secreción de hormonas a un estímulo secretor. - Preparar soluciones de prueba. Preparar estímulos vasculares en un 20 x concentración más alta que la concentración final deseada en buffer filtrado y ajustar a pH de la perfusión. Preparar prueba luminal estímulos en solución salina isotónica en la concentración final.
- Disolver compuestos no fácilmente solubles en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) y diluir en perfusión buffer o solución salina isotónica. Para estímulos vasculares, mantenga la concentración final de DMSO en el 1% o por debajo, como las concentraciones anteriores esto dañar el intestino y puede conducir a la secreción de la hormona intestinal inespecífica. Medir el pH y ajustar a ~7.5 si es necesario.
3. funcionamiento y perfusión
Nota: Una ilustración de una configuración de perfusión se proporciona en la figura 1.
- Anestesiar las ratas por el uso de un régimen anestésico que puede mantener la anestesia quirúrgica y analgesia durante 30-40 min por Hypnorm/Midazolam (0.3 ml/100 g peso y, ml: Hypnorm: fentanilo 0.08 mg, fluanisone 2,5 mg, 0.45 mg de parahidroxibenzoato de metilo, 0.05 mg Parahidroxibenzoato de propilo, Midazolam: 1,25 mg, matriz Pharmaceuticals, Hellerup, Dinamarca)
- Comprobar por falta de reflejos (pellizco del dedo del pie), colocar la rata en la mesa de operaciones climatizada y realizar una incisión de la piel para exponer el intestino.
-
Exponga la parte terminal del colon moviendo el intestino delgado a un lado tanto como sea posible. El lazo de la vasculatura a los dos puntos de abastecimiento y suprimir gradualmente a partir de la parte terminal del colon, hacia el intestino delgado.
- Si sólo una parte del intestino se requiere para perfusión (la mitad superior), impuestos especiales segmentos no necesaria después de atar apagado suministro de vasculatura. Para minimizar el daño a los tejidos, hidratar el intestino con solución salina isotónica y utiliza bastoncillos para eliminar tejido conectivo.
- Insertar un tubo de plástico (longitud: ~ 15 cm, diámetro externo: ~0.4 cm) en el lumen intestinal (en la parte proximal) y atar bien con suturas. Lavar cuidadosamente con solución salina isotónica (temperatura ambiente) para vaciar el lumen del quimo.
- Inundar el lumen con la solución salina isotónica a un flujo de 0.25 mL/min, utilizando una jeringa de 10 mL conectada a una bomba de jeringa.
- Mueva el intestino a un lado para que la arteria mesentérica superior es accesible y remover el tejido conjuntivo y grasa para exponer la arteria.
- Coloque dos suturas debajo de la arteria mesentérica utilizando pinzas de punta fina; una de las suturas es para levantar la arteria para control de sangrado una vez se ha cortado la arteria y el otro es para asegurar el catéter que debe ser colocado en la arteria. Tener cuidado de no perforar la arteria.
- Coloque dos suturas debajo de la vena porta para asegurar el catéter metálico que va a ser colocado en la vena para la recogida de efluentes de la perfusión.
- Antes de cortar el agujero en la arteria mesentérica, asegúrese de que el catéter que se va a insertar en la arteria es llenado con tampón de perfusión para evitar la formación de embolia de aire.
- Corte un pequeño agujero en la arteria mesentérica usando un par de tijeras quirúrgicas e inserte el catéter plástico inmediatamente después.
- Inmediatamente después de que el catéter ha sido asegurado, iniciar la perfusión del intestino a partir de la bomba de rodillos (caudal = 7,5 mL/min).
- Confirman que los vasos sanguíneos en el intestino gire claros en pocos segundos, y la vena porta se vuelve pálida.
- Inmediatamente después de la perfusión adecuada se ha establecido, corte un orificio de la vena porta, inserte el catéter metal y asegúrelo con la sutura.
Nota: El catéter puede ser difícil de lugar pero levantando la vena tirando con cuidado de las ayudas más proximales de la sutura. - Una vez que los catéteres están en lugar y salida de la perfusión es satisfactoria, mata a la rata por la perforación de la membrana, teniendo cuidado de no arrancar los catéteres.
- Recoge la salida de perfusión durante 1 min y medir el volumen. Empezar las adquisición/grabaciones de la presión de perfusión por haga clic en Ejecutar el experimento en el programa de grabación de presión.
- Cubra el intestino con tejido humedecido para evitar que se reseque durante el experimento.
- Asegúrese de que el extremo distal del intestino no está obstruido por lo que el efluente luminal puede salir, de lo contrario el intestino pasarán a engrosar, desarrollará edema, aumentará la presión de perfusión y salida de perfusión caerá.
- Dejar la preparación durante aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el experimento.
Nota: Las salidas secretoras de hormonas de la tripa son muy inestables para los primeros 15 minutos de perfusión, por lo que este paso equilibrado es necesario para obtener una línea base estable.
4. el experimento
- Después de aproximadamente 30 min de la perfusión, empezar el experimento por recoger la primera muestra de línea de base utilizando un colector de fracciones. Recoger las muestras en el intervalo de tiempo deseado (por ejemplo, generalmente se recoge cada min, 6.5-7.5 mL) y coloque en hielo dentro de pocos minutos.
-
Inspeccione periódicamente la trampa de la burbuja y, si vacía, llénelo con tampón de perfusión.
- Recoger el búfer a través de la polla-válvula de tres vías inmediatamente antes de entrar en el órgano y el catéter insertado en la vena porta (después de que ha sido inundada por el órgano) para confirmar que el órgano está metabólicamente activo. Recoger muestras al inicio y al final del experimento para evaluar viabilidad durante todo el experimento.
- Medir las muestras rápidamente, con un analizador de gases en el sangre automatizado, como contiene más plásticas/jeringas no son totalmente herméticas, dando lugar al intercambio con el aire atmosférico.
- Después de 10-15 min de colección de la línea de base, estimular con la sustancia primera. Administrar estímulos intra arteriales con una bomba de jeringa a través de una llave de tres vías (flujo = 0,350 mL/min).
- Realizar estímulos luminales por la inyección de un bolo inicial (2,5 mL/min durante los primeros 5 min) reemplazar la solución salina isotónica que ya está en la luz, seguido por la administración de la solución de prueba de un caudal inferior (0.5 mL/min).
- Para asegurarse de que la luz rápidamente se vacía de sustancia, una vez que el período de estímulo luminal, irrigue el lumen intestinal con solución salina isotónica, aplicando el mismo caudal que el anterior.
- Recoger muestras de línea de base por 15-30 min antes de administra la sustancia siguiente. Dependiendo del Protocolo, 2-3 prueba de estímulos generalmente pueden ser incluidos por experimento. Si el protocolo experimental incluye activación/inhibición de un determinado sitio molecular simultáneamente con la administración de un secretagogo dado, siempre pre-estimular con el activador/inhibidor 10-15 min antes de la administración de secretagogos de Asegúrese de que el sitio molecular es inhibido en el comienzo de la infusión de secretagogue.
- Al final del Protocolo, administrar (5-10 min) un adecuado control positivo para la prueba de capacidad de respuesta de la preparación y recoger muestras de referencia de 10-15 min después del período de estimulación.
Nota: Varios prueba de sustancias pueden ser utilizadas como control positivo, por ejemplo, estímulos para el aumento [cAMP] (p. ej., foskolin o IBMX), [Ca2 +] (p. ej., bombesina y neuromedina C) agentes de despolarización (e.g., 30-50 mM KCl) o más estímulos relevantes fisiológicamente como macronutrientes: glucosa, aminoácidos, peptonas, etcetera. Sin embargo, la elección del control positivo depende de los resultados experimentales. Glucosa por ejemplo es un secretagogo de pobres colecistoquinina (CCK) mientras que bombesina no es un secretagogo robusto para insulinotrópico dependiente de glucosa de la secreción de péptidos (GIP)30. - Tras el final del experimento, suprimir la perfusión intestinal, pesar y medir su longitud. Poner en paraformaldehido y almacene (4 ° C) por posibles más adelante el análisis histoquímico de integridad/daño de tejido, por ejemplo mediante tinción H & E.
5. bioquímicas medidas
- Cuantificar las concentraciones de péptidos secretados en el efluente venoso por medio de un interno o comercialmente disponible radioinmunoensayos (RIA) o análisis de ELISA. Estudios que investigan la absorción intestinal, cuantificar la molécula de interés, por ejemplo,, glucosa o aminoácidos, en el efluente venoso.
Nota: La solución es generalmente un buen almacenador intermediario básico para la mayoría de los análisis, incluyendo los análisis que se basa en reacciones enzimáticas (por ejemplo, cuantificación de glucosa por el método de glucoseoxidase).
6. Análisis de datos
- Presentar datos de diferentes maneras, por ejemplo como un gráfico de tiempo-concentración que muestra la real salida secretoria (flujo x concentración) y como parcela de la columna que representa la salida durante los períodos de referencia y respuesta (generalmente puntos de tiempo de 10-15) secretora total.
- Parcela la concentración medida real de las hormonas respectivas como unidades de concentración. (pmol/L),
Nota: Es preferible en lugar de otro expresar datos como salida (fmol/min) ya que con este modelo, en contraste con estudios in vivo, los valores obtenidos son el producto secretor real (debido a la constante recogida de efluentes de perfusión). - Dependiendo del número de grupos a ser analizados estadísticamente, emparejado de uso dos colas prueba de t (dos grupos) o unidireccional ANOVA para medidas repetidas (más de dos grupos) seguido de una prueba post-hoc apropiado para comparaciones múltiples.
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Representative Results
La capacidad para determinar si un determinado estímulo provoca la secreción de la hormona intestinal de interés se basa en una secreción basal constante. Además, si no hay respuesta al estímulo se observa una respuesta secretora robusta para el control positivo debe ser evidente para excluir que la falta de respuesta al estímulo de prueba no refleja una falta general de capacidad de respuesta. Figura 2A y 2B se muestra un ejemplo de datos de buena calidad; La secreción de GLP-1 del intestino aislado de rata perfundidos se muestran a intervalos de 1 minuto (medios ± SEM). En condiciones basales la secreción es constante; antes y después de la administración del prueba de estímulo (insulina) y una respuesta secretora robusta al positivo control (bombesina (BBS)) es evidente. Además, en promedio en condiciones basales la secreción de GLP-1 (durante los períodos de referencia respectivo delante de insulina o administración de BBS) así como secreción de promedio durante la insulina y estimulación BBS se muestran como gráficos de barras (medios ± SEM). Secreción fue probada para la significación estadística de una vía ANOVA para medidas repetidas. Partiendo de estos datos combinados, puede concluirse que la insulina intraarterial no estimula la secreción de GLP-1 del intestino aislado de rata perfundidos.
Figura 2 y 2D muestra un ejemplo de la secreción de GLP-1 del intestino aislado de rata perfundidos. A diferencia de la figura 2A y 2B, estos datos son de mala calidad; la secreción es inestable en condiciones basales y se desplaza hacia arriba a través de una manera que parece estar relacionado con las administraciones de la sustancia de prueba (intra-luminal e intrarterial fructosa, respectivamente) y el control positivo, BBS, no lleva a estadística significativa aumenta la secreción de GLP-1. Por lo tanto, es imposible concluir si las estimulaciones de fructosa dan lugar a la secreción de GLP-1, por ejemplo,, es la mayor secreción de GLP-1 en la final de la estimulación vascular fructosa una respuesta mediada por la fructosa o no.
Figura 1: ejemplo de una configuración de perfusión. El sistema consta de un soporte de plexiglás, una mesa caliente, un intercambiador de calor con construcción en trampa de burbujas, un manómetro y bomba manual de husillo de ajuste de la presión de perfusión. El sistema de perfusión está conectado a una bomba de circulación termostático que calienta los gaseados (95% O2, 5% CO2) tampón de perfusión a 37 ° C. Además, presión de perfusión es registrada continuamente y transduced por el transductor de grabación de presión visualizada y guarda en un PC con el software adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: datos del intestino aislado de rata perfundidos. (A, B) un ejemplo de un bien realizado experimentos y datos confiables, (C, D) un ejemplo de datos óptimos donde aumentar la presión de perfusión y la salida de perfusión disminuida dramáticamente sobre el curso del tiempo del estudio. (A) salida de GLP-1 (total) (fmol/min) se muestra en condiciones basales y en respuesta a la administración de insulina intraarterial (pM 200 y 1.000, como se indica). Bombesina (BBS), un conocido y potente secretagogo de GLP-1, fue infundido intra arterial al final del experimento para el control de respuesta (control pos.). Los datos se presentan como medios ± SEM, n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El intestino aislado de rata perfundidos es una herramienta potente que permite la dinámica y mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona del intestino que se estudiarán en detalle. El paso más crítico para el éxito de la producción de datos con este modelo es la intervención quirúrgica. Manejo del intestino inevitablemente causará algún daño en el intestino y debe por tanto mantenerse en un absoluto mínimo. Más importante aún, la velocidad de operación es clave, especialmente en el momento de la colocación del catéter en la arteria mesentérica. Nuestra experiencia es que el catéter se debe colocar con éxito, y la perfusión se debe iniciar dentro de un par de minutos después de haber cortado el orificio en el recipiente. La colocación de los catéteres es la parte más difícil de la operación y se complica por el tamaño pequeño de la arteria mesentérica y la delgada pared de la vena porta, y este paso requiere algo de práctica. Rápida inserción del catéter venoso es, sin embargo, no tan urgente como el caso de la arteria mesentérica, la tripa es siendo perfundidos y mantuvo con vida. El próximo paso crítico es para llevar a cabo el experimento. Si la operación fue realizada con éxito, la perfusión intestinal generalmente se prosperar y ser receptivos para hasta 3 h y la presión de perfusión y salida por lo general permanece constante durante todo el experimento. El factor más importante para un exitoso experimento en esta etapa es evitar burbujas de entrar en el sistema, ya que esto produce embolización de aire que al instante reduce o elimina la salida de la perfusión. Como el búfer de perfusión contiene BSA y gaseado para asegurar suficiente suministro de oxígeno a la perfusión intestinal, es difícil de evitar completamente la formación de burbujas. Sin embargo, las burbujas se debería atrapado en la trampa de la burbuja de los sistemas, pero esto desemboca gradualmente en el tiempo (el más burbujas, más rápido vaciado) y por lo tanto es importante mantener una estrecha vigilancia en la trampa de la burbuja y rellenarlo con el almacenador intermediario de la perfusión cuando sea necesario. También es importante mantener el pH de la solución por debajo de 7.5, en aumentar el pH, pueden formar precipitados de carbonato de calcio, obstruyendo el flujo capilar y causando un grave aumento en la presión de perfusión.
El intestino perfundido es una preparación bastante robusta, pero no tolera altas concentraciones de detergentes tales como los ácidos biliares, etanol y DMSO. Por lo tanto, el uso de detergentes que preferiblemente debe evitarse pero a veces es necesario para obtener compuestos poco solubles en la solución. La perfusión intestinal generalmente tolera detergentes administrados intra-luminally mejor que intra vascularly. Por ejemplo, la administración de 1 mM taurodeoxycholic (ácido un secundario, conjugada bilis) fue tolerada bien cuando infunde intraluminally pero resultó instantáneamente bloqueado perfusión intra arterial entrega2de salida. Para estímulos vasculares, mantener la concentración final de DMSO debajo del 1% para evitar las respuestas secretoras inespecíficas (DMSO estimula, por ejemplo, la secreción de GLP-1) y para evitar causar daño a los tejidos dando como resultado la presión creciente de la perfusión y disminución de la perfusión salida. Experimentos deben ser tenida en cuenta si la salida de perfusión disminuye en más del 20% en el transcurso del estudio, si la presión de perfusión aumenta más del 20% o si se desarrolla edema. Cumplimiento de estos criterios de éxito macroscópico (incluyendo la rápida inserción del catéter en la arteria mesentérica) generalmente resulta en buena calidad en los experimentos de ~14/15.
Después de completar el experimento, el procedimiento crítico siguiente es elegir el método adecuado y análisis para la cuantificación de lo acuerdo de interés. Alto rendimiento prueba de hormonas peptídicas puede llevarse a cabo usando inmunoensayos: radioinmunoanálisis o ELISA. En cualquier caso, se recomienda validar los ensayos respectivos antes de usarlas para la cuantificación de la muestra, como no todos los ensayos disponibles en el mercado realizan satisfactoriamente con respecto a la sensibilidad, especificidad y exactitud (por ejemplo con respecto a GLP-131). Con respecto a la especificidad, reactividad cruzada es, como siempre, un motivo de preocupación. Efectos de interferencia y matriz inespecíficos generalmente se pronuncian menos con perfusates artificial en comparación con el plasma. Con respecto a la sensibilidad, es a menudo mucho más fácil obtener datos fiables de perfusiones que de los estudios en vivo como el péptido concentraciones a menudo son más altas porque el efluente de perfusión no se diluye en la circulación sistémica y porque se evitan procesos de eliminación (por el hígado/pulmón/riñón). Por lo general, las concentraciones de línea base en efluentes venosas mienten dentro de la gama más baja del trabajo de la mayoría de los ensayos (en el caso de GLP-1 (total), neurotensin (total) y PYY (total): 8-15 pmol/L) mientras que estimula las respuestas pueden llegar tan alto como 200-300 pmol/L3.
En comparación, los valores basales de las mismas hormonas en plasma de los seres humanos sanos, ratas o ratones suelen ser y 5-10 pmol/L mientras que los valores de respuesta son 15-30 pmol/L3,32.
Si se siguen los criterios de éxito predefinidos, los datos de perfusión generadas suelen ser de buena calidad y el análisis estadístico entonces es sencillo. Secreción de glucagón, insulina y somatostatina en comparación con el aislado de rata perfundido o páncreas de ratón, la secreción basal de hormonas de la tripa es constante y bastante similares entre experimentos sobre concentraciones medidas, y la secreción no es claramente pulsátil. En conjunto, la variación en el conjunto de datos por lo tanto es un mínimo y un tamaño de muestra como tres experimentos de perfusión es a menudo suficiente alcanzar significación estadística. Sin embargo, para estandarizar y evitar errores de tipo 2, así como para reducir la posibilidad de vistas menos respuestas bien pronunciadas, se recomienda un tamaño de muestra de seis a ocho.
En Resumen, el intestino aislado de rata perfundidos es un modelo importante, fisiológicamente relevante, experimental que puede utilizarse para investigar los efectos directos de una sustancia dada en la secreción de la hormona intestinal. Importantes cuestiones fundamentales, tales como donde en el intestino un secretagogo estimula la secreción, si estimula la secreción mediante la activación de luminally o basolaterally situado sensores y que sensores moleculares son activados y por lo tanto responsable de la secreción puede tratarse en detalle con este modelo. Sin embargo, se reconoce que el desacoplar de la tripa del animal donante, para algunas preguntas de estudio, sean de relevancia. Por ejemplo, el intestino interactúa estrechamente con el hígado (el hígado intestino eje) y el cerebro (el eje cerebro intestino), y mecanismos que se basan en esta charla de la Cruz por lo tanto no pueden investigarse con este modelo. La calidad de la operación es el factor crítico para la calidad de los datos y los factores más importantes para un buen funcionamiento son mantener manipulación del intestino al mínimo y rápidamente iniciar la perfusión del intestino una vez que se ha cortado la arteria mesentérica. Es nuestra experiencia que tarda 2-4 meses de práctica antes de que se producen datos de buena calidad. Sin embargo, una vez que se ha aprendido la técnica, las posibilidades de este método son casi infinitas y sólo limitada por la solubilidad de las sustancias de prueba y cualquier potencial perjudiciales efectos de las sustancias de ensayo que tenga de los tejidos perfundidos.
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Disclosures
Los autores de este trabajo no declaran posibles conflictos de interés relevante a este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención sin restricciones de Prof. Jens Juul Holst Novo Nordisk del centro de la investigación metabólica básica (Novo Nordisk Foundation, Dinamarca), una subvención independiente de la Fundación de Novo Nordisk para hacer estudios de roedores de la perfusión (no de la concesión. NNF15OC0016574), una subvención a Prof. Holst desde el Consejo Europeo de investigación (Grant no.695069) y la Unión de la europea del séptimo programa marco de investigación, TechnologicalDevelopment y demostración (Grant no. 266408) así como postdoc conceder a Rune E. Kuhre de la Fundación Lundbeck (R264-2017-3492). Agradecemos a Jenna E. Hunt y Carolyn F. Deacon para la revisión cuidadosa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
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