Mekanismerna bakom Gut hormon sekretion använder den isolerade perfusion råtta tunntarmen
Summary
Här presenterar vi en kraftfull och fysiologiska modell för att studera de molekylära mekanismerna bakom gut hormon sekretion och absorptionen i tarmen — isolerade perfunderade råtta tunntarmen.
Abstract
Tarmen är den största endokrina orgeln i kroppen, producera mer än 15 olika peptidhormoner som reglerar aptit och mat intag, matsmältningen, näringsämne absorption och distribution och postprandiellt glukos utflykter. Förstå de molekylära mekanismer som reglerar tarmen hormon sekretion är grundläggande för att förstå och översätta gut hormon fysiologi. Traditionellt, mekanismerna bakom gut hormon utsöndringen studeras antingen in vivo (i experimentella djur eller människor) eller använder gut hormon utsöndrar primära slemhinnor cell kulturer eller cellinjer. Här introducerar vi en isolerad perfunderade råtta tunntarmen som en alternativ metod för att studera gut hormon sekretion. Fördelarna med denna modell är att det bygger på intakt tarmen, vilket innebär att det recapitulates de flesta av de fysiologiskt viktiga parametrarna som är ansvarig för utsöndringen i in vivo-studier, inklusive slemhinnor polarisering, parakrin relationer och exponeringsvägar perfusion/stimulans exponering. Dessutom, och till skillnad från in vivo-studier, ger isolerade perfunderade råtta tunntarmen nästan fullständig experimentell kontroll och direkt bedömning av sekretion. Till skillnad från in vitro-studier är det möjligt att studera både omfattningen och dynamiken i sekretion och adress viktiga frågor, såsom vilka stimuli orsaka utsöndring av olika gut hormoner, från vilken sida av tarmen (luminala eller vaskulär) är sekretion stimuleras, och att analysera i detalj molekylär sensorer underliggande sekretoriska svaret. Preparatet är dessutom en kraftfull modell för studier av absorptionen i tarmen och detaljer rörande dynamiken i absorptionen i tarmen inklusive ansvarig transportörerna.
Introduction
Tarmen är den största endokrina orgeln i kroppen, producera mer än 15 olika peptidhormoner som reglerar näringsämne absorption och näringsämnen disposition, intestinal tillväxt och modulera aptit1. Gut hormoner, därför medverkar i många grundläggande fysiologiska processer, och förstå dessa mönster av sekretion och molekylära detaljer som styr utsöndringen av respektive hormoner är således viktigt för vår grundläggande fysiologiska förståelse och för att hantera translationella aspekter av gut hormon åtgärder. men hur kan man studera de molekylära fjärranalys mekanismer bakom gut hormon sekretion? I allmänhet hormon kan studeras i hela organismer (människor eller försöksdjur), från isolerade gut preparat eller från tarmen utsöndrar hormon primära cellkulturer eller förevigade cell kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vår Rekommenderad modell är isolerade perfunderade råtta tunntarmen, vilket är ett fysiologiskt relevanta modell som gör att utsöndringen av gut hormoner att studeras i detalj med optimal tidsupplösning (sekretion priser kan bestämmas med helst bas ner till andra), och resultaten är sannolikt överförbar till en i vivo situationen7. Här vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll på hur till utföra den här proceduren, men först kommer vi att diskutera andra metoder för att studera gut hormon sekretion, inklusive fördelar och begränsningar av dessa modeller jämfört med isolerade perfunderade råtta tunntarmen.
Om man vill fastställa om en viss förening reglerar utsöndringen av vissa hormoner, gut, är studier på människa slutmålet. Således, om en förening visar stora effekter på utsöndringen av en eller flera gut hormoner hos gnagare (i vivo eller perfusioner) eller från hormon utsöndrar celler (cellinjer eller primära celler), denna effekt bara är relevant för medicin och människans fysiologi om det kan bekräftas människa. Men det finns tydliga gränser för vilken typ av studier som kan utföras i människor och in vivo-studier på försöksdjur är därför ofta det näst bästa alternativet för sådana studier. Möss och råttor är mest använda försöksdjuren förmodligen på grund av deras bekväm storlek, låg kostnad och möjligheten att genetiskt ändra de gener som misstänks vara inblandade i de specifika instuderingsfrågor (t.ex. slå ur vissa transportör eller receptor). I allmänhet i vivo modeller kan vara fysiologiskt intakt, men har också flera begränsningar. Viktigast av allt, små gnagare, särskilt möss, är en begränsande faktor, eftersom de flesta analyser för gut hormon kvantifiering kräver minst 20 µL plasma (och ofta mycket mer), vilket innebär att minst 100 µL blod har dras till göra en dubblett kvantifiering. Därför är det endast möjligt att få mycket få prover som motsvarar baslinje prover och en eller två efter stimulering prover (den totala blodvolymen i en mus av 20 g är ~1.4 mL). Följaktligen, potentiella sekretoriska svaren (t.ex., snabbt eller sent förekommande Svaren) kan därför missas.
I perfusion modellen, problemet är att övervinna, som stora prov volymer erhålls (flödeshastighet: 7,5 mL/min) och samling intervallen kan justeras efter behov för att säkerställa att snabb och kortvarig svaren inte missat (vi samla prover varje min)7 . En annan fråga med i vivo studier på gnagare är att de flesta gut hormoner är ännu mer snabbt elimineras eller metaboliseras än i människor8,9,10, vilket kan komplicera den efterföljande biokemisk analysen. Exempelvis visade vi att GLP-1 metaboliseras i möss i en ännu snabbare takt än i människor (där T1/2 är 1-2 min11) och, ännu viktigare, som handlar om klyvning av GLP-1 hos möss, förutom N-terminala klyvning av Dipeptidylpeptidas-4 (DPP4) (som är det stora GLP-1 förnedrande enzymet hos människor), ytterligare klyvning av de enzym neutral endopeptidase 24.1112. Följaktligen, nuvarande kommersiella analyser för kvantifiering av GLP-1, som baseras antingen på den intakta isoformen av GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 klyvs isoform (9-39amide), kraftigt underskattar GLP-1 sekretion hos möss och leda till missvisande resultat 12. i isolerade perfunderade råtta tunntarmen, de flesta av metabolismen av utsöndras hormoner är elimineras eller minskas markant, eftersom plasma-medierad nedbrytning undviks, och lever/njure/lung utvinning/nedbrytning förhindras eftersom ( perfusatet samlas som lämnar tarmen).
Naturligtvis viktigt insikt kan skapas genom användning av genetiskt modifierade djur, t.ex., natrium-glukos transporter-1 knockout möss13, men en detaljerad utvärdering av de molekylära sensorerna som är involverade i utsöndringen ofta kräver övervägande av flera molekylära platser, från molekylär transportörer till jonkanaler och från olika G-proteinkopplade receptorer till intracellulära proteiner. Till exempel, riktade vi aktiviteten av nio olika molekylära platser när unraveling molekylär sensorerna ansvarar för glukos-stimulerad GLP-1 sekretion7. En liknande undersökning skulle inte vara möjligt i vivo som några av de föreningar som används har ospecifika eller skadliga/dödliga effekter. Exempelvis när du använder perfunderade tarmen, var det möjligt att bedöma roll inom cellulär glukosmetabolism för utsöndringen av GLP-1 och neurotensin genom att blockera ATP bildas med 2-4-dinitrofenol7,14 samt roll spänningskänsliga kalciumkanaler för gallsyror stimuleras GLP-1, NT och PYY sekretion3. Faktiskt kan den mycket giftiga natrium kanal blockerare tetrodotoxinen tillämpas framgångsrikt i perfusion studierna. Slutligen i perfusion modellen kan det direkt bedömas där i tarmen en viss förening stimulerar utsöndringen av ett visst hormon, som utredaren kan helt enkelt välja och förbereda önskad region att BEGJUTA, och samtidigt det kan undersökas huruvida ett stimulus orsakar utsöndring av aktivering av molekylära sensorer från luminala eller vaskulära sida av tarmen3,15,16.
Sekretoriska mekanismerna underliggande gut hormon sekretion kan också studeras genom användning av gut vävnad bitar (inklusive mänsklig vävnad), primära intestinal kulturer (oftast från möss), förevigade hormon utsöndrar cellinjer (för mus eller mänskligt ursprung), av tarmen vävnaden monterad i Ussing kammare eller av organoids (både oftast från möss)2,3,4,5,6,17,18. Jämfört med intestinal perfusioner, studier på mänskliga tarmen bitar, primära cellkulturer och cellinjer är tekniskt enklare att utföra och är ett snabbare och billigare sätt att generera data, men naturligtvis studiet av gut bitar kräver tillgång till färska mänskliga tarmen exemplaren. I dessa modeller är dock normal cell polariseringen av tarmen inneboende förlorade, vilket innebär att dessa modeller inte kan användas för att bedöma normal aktivering av molekylära sensorer, och även absorption processer inte kan studeras. Dessutom sådana studier vanligtvis anställa statiska inkubationer (för upp till flera h) som är mycket icke-fysiologisk och har ingenting att göra med cellernas normala sekretoriska dynamics, eftersom utsöndrade produkten inte tas bort och därmed påverka feedback den utsöndringen av hormoner. Däremot i perfunderade tarmen avlägsnas molekyler som utsöndras och absorberas effektivt genom slemhinnor mikrocirkulationen som de är i vivo, säkerställa att transmukosalt Övertoningarna upprätthålls så absorption och sekretion kan inträffa i normal takt. Dessutom kan cellkulturer ha dedifferentiated från infödda enteroendokrina celler ursprung, vilket innebär att de inte längre är representativt av infödda cellerna peptid innehållsmässigt och uttryck av molekylär sensorer, även om de fortfarande utsöndra hormonet i fråga. Detta är exempelvis fallet för GLP-1 utsöndrar cell linjer19.
Det är därför vår uppfattning att primära cellkulturer eller cell linje studier är mest lämpade vid screening och för att utföra typer experiment som inte kan utföras i vivo eller i isolerade perfunderade tarmen. Till exempel, en sann styrka av primära cellkulturer och cellkulturer linje är att inom cellulär sekundära budbärare (t.ex. Ca2 +, läger, NAD(P)H) kan övervakas i realtid och elektrisk signalering av hormon utsöndrar celler kan vara undersökt20,21,22. SiRNA knockdown kan dessutom göras, vilket är särskilt användbart om specifika hämmare inte är tillgängliga20,21,22,23,24. Gut vävnad från möss monterad i Ussing chambers har nyligen använts för att studera de molekylära mekanismer bakom gallsyra stimulerad sekretion GLP-1, medan intestinal organoids (från möss) och mänskliga tarmen bitar har också använts för att studera den molekylära Detaljer för gut hormon sekretion17,25. Medan tidigare fördelarna med att vara polariserad2 innebär alla dessa modeller statisk inkubationer. Studier på mänskliga tarmen bitar, dock med fördel använda mänskliga, snarare än gnagare, vävnad som är viktigt eftersom arter skillnaden i vävnad uttryck av 7TM receptorer och molekylär transportörer kan leda till olika molekylära fjärranalys vägar mellan arter. I själva verket de flesta data i fältet har genererats av studier på grisar, möss eller råttor, och det återstår svårfångade huruvida dessa fynd kan överföras till människor. Det är dock uppmuntrande att molekylära fjärranalys mekanismer som ligger bakom glukos-stimulerad GLP-1 utsöndring verkar vara liknande mellan mus, råtta, man, och transcriptomic och peptidomic profilering av mus och mänskliga L-celler visade stark global likheter mellan de två arter7,18,26,27.
Isolerade perfunderade råtta tunntarmen, men har också vissa begränsningar som bör övervägas. Viktigast av allt, är det omöjligt att avgöra om en given sekretoriska svar resulterar från direkt aktivering av testsubstansen riktade hormonproducerande celler eller snarare orsakas av ett indirekt mekanism. Exempelvis KCl ökar direkt GLP-1 sekretion från perfunderade inälvan7, men det är fortfarande okänt om detta är en följd av direkta depolarisation av L-cellen eller resultat från depolarisation av nervceller nära L-celler eller effekterna av samtidigt släppte parakrin stimulatorer/hämmare. Data från studier med perfunderade tarmen som syftar till att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom sekretion bör därför alltid sättas i sammanhang med uppgifter som erhållits från andra mer specifika modeller för att öka förmågan att upprätta kausalitet. Till exempel glukos-stimulerad GLP-1 sekretion från GLP-1 utsöndrar cell fodrar GLUTag28,29 och från primära mouse L-celler beror på aktiviteten av glukostransportörer (SGLT1 och GLUT2). Blockerar dessa transportörer i tunntarmen perfunderade råtta också dämpar sekretion20, vilket innebär att det är troligt att glukos-stimulerad GLP-1 sekretion i stor utsträckning medieras av direkta åtgärder av glukos på L-cellen. En annan viktig begränsning av isolerade perfunderade tarmen är att vissa av lipider är svårt att studera på grund av deras vattenavvisande egenskaper. Även om det är möjligt att undersöka slutprodukterna av lipid matsmältning (fettsyror, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) och även om preparatet kan kunna åter esterify packa lipider inom cellularly och kanske dem i kylomikroner, transport av kylomikroner ur cellerna och deras efterföljande upptag av lacteals av villina avbryts, eftersom lymfan flödet i isolerade tarmen inte kan säkras. Troligtvis därför stoppas lipid absorption när de absorbera produkterna börjar ansamlas i cellerna. De in vitro rapportör cell-system är ännu mindre lämplig för lipid studier på grund av deras bristande polarisering. Självklart, denna begränsning är bara relevant för lipider som absorberas och transporteras via lacteals, medan de absorberas via intestinal blodkärlen sannolikt kommer att hanteras normalt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolerade perfunderade råtta tunntarmen är en kraftfull forskningsverktyg som tillåter dynamik och molekylära mekanismer bakom gut hormon sekretion studeras i detalj. Det mest kritiska steget för framgångsrik produktion av data med denna modell är det kirurgiska ingreppet. Hantering av tarmen oundvikligen kommer att orsaka några skador på tarmen och bör därför hållas till ett absolut minimum. Hastigheten på driften är ännu viktigare, nyckel, särskilt när det gäller tiden för katetern placering i mesen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett fritt bidrag till Prof. Jens Juul Holst från Novo Nordisk Center för grundläggande metabolisk forskning (Novo Nordisk Foundation, Danmark), ett separat anslag från Novo Nordisk Foundation för att göra gnagare perfusion studier (bevilja nr. NNF15OC0016574), ett bidrag till Prof. Holst från European Research Council (Grant no.695069) och Europeiska unionen är sjunde ramprogrammet för forskning, teknisk utveckling och demonstrationsverksamhet (Grant No. 266408) samt en postdoc bevilja Rune E. Kuhre från Lundbeck Foundation (R264-2017-3492). Vi tackar Jenna E. Hunt och Carolyn F. Deacon för noggrann korrekturläsning.
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?. Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
