Summary
Här presenterar vi en kraftfull och fysiologiska modell för att studera de molekylära mekanismerna bakom gut hormon sekretion och absorptionen i tarmen — isolerade perfunderade råtta tunntarmen.
Abstract
Tarmen är den största endokrina orgeln i kroppen, producera mer än 15 olika peptidhormoner som reglerar aptit och mat intag, matsmältningen, näringsämne absorption och distribution och postprandiellt glukos utflykter. Förstå de molekylära mekanismer som reglerar tarmen hormon sekretion är grundläggande för att förstå och översätta gut hormon fysiologi. Traditionellt, mekanismerna bakom gut hormon utsöndringen studeras antingen in vivo (i experimentella djur eller människor) eller använder gut hormon utsöndrar primära slemhinnor cell kulturer eller cellinjer. Här introducerar vi en isolerad perfunderade råtta tunntarmen som en alternativ metod för att studera gut hormon sekretion. Fördelarna med denna modell är att det bygger på intakt tarmen, vilket innebär att det recapitulates de flesta av de fysiologiskt viktiga parametrarna som är ansvarig för utsöndringen i in vivo-studier, inklusive slemhinnor polarisering, parakrin relationer och exponeringsvägar perfusion/stimulans exponering. Dessutom, och till skillnad från in vivo-studier, ger isolerade perfunderade råtta tunntarmen nästan fullständig experimentell kontroll och direkt bedömning av sekretion. Till skillnad från in vitro-studier är det möjligt att studera både omfattningen och dynamiken i sekretion och adress viktiga frågor, såsom vilka stimuli orsaka utsöndring av olika gut hormoner, från vilken sida av tarmen (luminala eller vaskulär) är sekretion stimuleras, och att analysera i detalj molekylär sensorer underliggande sekretoriska svaret. Preparatet är dessutom en kraftfull modell för studier av absorptionen i tarmen och detaljer rörande dynamiken i absorptionen i tarmen inklusive ansvarig transportörerna.
Introduction
Tarmen är den största endokrina orgeln i kroppen, producera mer än 15 olika peptidhormoner som reglerar näringsämne absorption och näringsämnen disposition, intestinal tillväxt och modulera aptit1. Gut hormoner, därför medverkar i många grundläggande fysiologiska processer, och förstå dessa mönster av sekretion och molekylära detaljer som styr utsöndringen av respektive hormoner är således viktigt för vår grundläggande fysiologiska förståelse och för att hantera translationella aspekter av gut hormon åtgärder. men hur kan man studera de molekylära fjärranalys mekanismer bakom gut hormon sekretion? I allmänhet hormon kan studeras i hela organismer (människor eller försöksdjur), från isolerade gut preparat eller från tarmen utsöndrar hormon primära cellkulturer eller förevigade cell kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vår Rekommenderad modell är isolerade perfunderade råtta tunntarmen, vilket är ett fysiologiskt relevanta modell som gör att utsöndringen av gut hormoner att studeras i detalj med optimal tidsupplösning (sekretion priser kan bestämmas med helst bas ner till andra), och resultaten är sannolikt överförbar till en i vivo situationen7. Här vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll på hur till utföra den här proceduren, men först kommer vi att diskutera andra metoder för att studera gut hormon sekretion, inklusive fördelar och begränsningar av dessa modeller jämfört med isolerade perfunderade råtta tunntarmen.
Om man vill fastställa om en viss förening reglerar utsöndringen av vissa hormoner, gut, är studier på människa slutmålet. Således, om en förening visar stora effekter på utsöndringen av en eller flera gut hormoner hos gnagare (i vivo eller perfusioner) eller från hormon utsöndrar celler (cellinjer eller primära celler), denna effekt bara är relevant för medicin och människans fysiologi om det kan bekräftas människa. Men det finns tydliga gränser för vilken typ av studier som kan utföras i människor och in vivo-studier på försöksdjur är därför ofta det näst bästa alternativet för sådana studier. Möss och råttor är mest använda försöksdjuren förmodligen på grund av deras bekväm storlek, låg kostnad och möjligheten att genetiskt ändra de gener som misstänks vara inblandade i de specifika instuderingsfrågor (t.ex. slå ur vissa transportör eller receptor). I allmänhet i vivo modeller kan vara fysiologiskt intakt, men har också flera begränsningar. Viktigast av allt, små gnagare, särskilt möss, är en begränsande faktor, eftersom de flesta analyser för gut hormon kvantifiering kräver minst 20 µL plasma (och ofta mycket mer), vilket innebär att minst 100 µL blod har dras till göra en dubblett kvantifiering. Därför är det endast möjligt att få mycket få prover som motsvarar baslinje prover och en eller två efter stimulering prover (den totala blodvolymen i en mus av 20 g är ~1.4 mL). Följaktligen, potentiella sekretoriska svaren (t.ex., snabbt eller sent förekommande Svaren) kan därför missas.
I perfusion modellen, problemet är att övervinna, som stora prov volymer erhålls (flödeshastighet: 7,5 mL/min) och samling intervallen kan justeras efter behov för att säkerställa att snabb och kortvarig svaren inte missat (vi samla prover varje min)7 . En annan fråga med i vivo studier på gnagare är att de flesta gut hormoner är ännu mer snabbt elimineras eller metaboliseras än i människor8,9,10, vilket kan komplicera den efterföljande biokemisk analysen. Exempelvis visade vi att GLP-1 metaboliseras i möss i en ännu snabbare takt än i människor (där T1/2 är 1-2 min11) och, ännu viktigare, som handlar om klyvning av GLP-1 hos möss, förutom N-terminala klyvning av Dipeptidylpeptidas-4 (DPP4) (som är det stora GLP-1 förnedrande enzymet hos människor), ytterligare klyvning av de enzym neutral endopeptidase 24.1112. Följaktligen, nuvarande kommersiella analyser för kvantifiering av GLP-1, som baseras antingen på den intakta isoformen av GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 klyvs isoform (9-39amide), kraftigt underskattar GLP-1 sekretion hos möss och leda till missvisande resultat 12. i isolerade perfunderade råtta tunntarmen, de flesta av metabolismen av utsöndras hormoner är elimineras eller minskas markant, eftersom plasma-medierad nedbrytning undviks, och lever/njure/lung utvinning/nedbrytning förhindras eftersom ( perfusatet samlas som lämnar tarmen).
Naturligtvis viktigt insikt kan skapas genom användning av genetiskt modifierade djur, t.ex., natrium-glukos transporter-1 knockout möss13, men en detaljerad utvärdering av de molekylära sensorerna som är involverade i utsöndringen ofta kräver övervägande av flera molekylära platser, från molekylär transportörer till jonkanaler och från olika G-proteinkopplade receptorer till intracellulära proteiner. Till exempel, riktade vi aktiviteten av nio olika molekylära platser när unraveling molekylär sensorerna ansvarar för glukos-stimulerad GLP-1 sekretion7. En liknande undersökning skulle inte vara möjligt i vivo som några av de föreningar som används har ospecifika eller skadliga/dödliga effekter. Exempelvis när du använder perfunderade tarmen, var det möjligt att bedöma roll inom cellulär glukosmetabolism för utsöndringen av GLP-1 och neurotensin genom att blockera ATP bildas med 2-4-dinitrofenol7,14 samt roll spänningskänsliga kalciumkanaler för gallsyror stimuleras GLP-1, NT och PYY sekretion3. Faktiskt kan den mycket giftiga natrium kanal blockerare tetrodotoxinen tillämpas framgångsrikt i perfusion studierna. Slutligen i perfusion modellen kan det direkt bedömas där i tarmen en viss förening stimulerar utsöndringen av ett visst hormon, som utredaren kan helt enkelt välja och förbereda önskad region att BEGJUTA, och samtidigt det kan undersökas huruvida ett stimulus orsakar utsöndring av aktivering av molekylära sensorer från luminala eller vaskulära sida av tarmen3,15,16.
Sekretoriska mekanismerna underliggande gut hormon sekretion kan också studeras genom användning av gut vävnad bitar (inklusive mänsklig vävnad), primära intestinal kulturer (oftast från möss), förevigade hormon utsöndrar cellinjer (för mus eller mänskligt ursprung), av tarmen vävnaden monterad i Ussing kammare eller av organoids (både oftast från möss)2,3,4,5,6,17,18. Jämfört med intestinal perfusioner, studier på mänskliga tarmen bitar, primära cellkulturer och cellinjer är tekniskt enklare att utföra och är ett snabbare och billigare sätt att generera data, men naturligtvis studiet av gut bitar kräver tillgång till färska mänskliga tarmen exemplaren. I dessa modeller är dock normal cell polariseringen av tarmen inneboende förlorade, vilket innebär att dessa modeller inte kan användas för att bedöma normal aktivering av molekylära sensorer, och även absorption processer inte kan studeras. Dessutom sådana studier vanligtvis anställa statiska inkubationer (för upp till flera h) som är mycket icke-fysiologisk och har ingenting att göra med cellernas normala sekretoriska dynamics, eftersom utsöndrade produkten inte tas bort och därmed påverka feedback den utsöndringen av hormoner. Däremot i perfunderade tarmen avlägsnas molekyler som utsöndras och absorberas effektivt genom slemhinnor mikrocirkulationen som de är i vivo, säkerställa att transmukosalt Övertoningarna upprätthålls så absorption och sekretion kan inträffa i normal takt. Dessutom kan cellkulturer ha dedifferentiated från infödda enteroendokrina celler ursprung, vilket innebär att de inte längre är representativt av infödda cellerna peptid innehållsmässigt och uttryck av molekylär sensorer, även om de fortfarande utsöndra hormonet i fråga. Detta är exempelvis fallet för GLP-1 utsöndrar cell linjer19.
Det är därför vår uppfattning att primära cellkulturer eller cell linje studier är mest lämpade vid screening och för att utföra typer experiment som inte kan utföras i vivo eller i isolerade perfunderade tarmen. Till exempel, en sann styrka av primära cellkulturer och cellkulturer linje är att inom cellulär sekundära budbärare (t.ex. Ca2 +, läger, NAD(P)H) kan övervakas i realtid och elektrisk signalering av hormon utsöndrar celler kan vara undersökt20,21,22. SiRNA knockdown kan dessutom göras, vilket är särskilt användbart om specifika hämmare inte är tillgängliga20,21,22,23,24. Gut vävnad från möss monterad i Ussing chambers har nyligen använts för att studera de molekylära mekanismer bakom gallsyra stimulerad sekretion GLP-1, medan intestinal organoids (från möss) och mänskliga tarmen bitar har också använts för att studera den molekylära Detaljer för gut hormon sekretion17,25. Medan tidigare fördelarna med att vara polariserad2 innebär alla dessa modeller statisk inkubationer. Studier på mänskliga tarmen bitar, dock med fördel använda mänskliga, snarare än gnagare, vävnad som är viktigt eftersom arter skillnaden i vävnad uttryck av 7TM receptorer och molekylär transportörer kan leda till olika molekylära fjärranalys vägar mellan arter. I själva verket de flesta data i fältet har genererats av studier på grisar, möss eller råttor, och det återstår svårfångade huruvida dessa fynd kan överföras till människor. Det är dock uppmuntrande att molekylära fjärranalys mekanismer som ligger bakom glukos-stimulerad GLP-1 utsöndring verkar vara liknande mellan mus, råtta, man, och transcriptomic och peptidomic profilering av mus och mänskliga L-celler visade stark global likheter mellan de två arter7,18,26,27.
Isolerade perfunderade råtta tunntarmen, men har också vissa begränsningar som bör övervägas. Viktigast av allt, är det omöjligt att avgöra om en given sekretoriska svar resulterar från direkt aktivering av testsubstansen riktade hormonproducerande celler eller snarare orsakas av ett indirekt mekanism. Exempelvis KCl ökar direkt GLP-1 sekretion från perfunderade inälvan7, men det är fortfarande okänt om detta är en följd av direkta depolarisation av L-cellen eller resultat från depolarisation av nervceller nära L-celler eller effekterna av samtidigt släppte parakrin stimulatorer/hämmare. Data från studier med perfunderade tarmen som syftar till att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom sekretion bör därför alltid sättas i sammanhang med uppgifter som erhållits från andra mer specifika modeller för att öka förmågan att upprätta kausalitet. Till exempel glukos-stimulerad GLP-1 sekretion från GLP-1 utsöndrar cell fodrar GLUTag28,29 och från primära mouse L-celler beror på aktiviteten av glukostransportörer (SGLT1 och GLUT2). Blockerar dessa transportörer i tunntarmen perfunderade råtta också dämpar sekretion20, vilket innebär att det är troligt att glukos-stimulerad GLP-1 sekretion i stor utsträckning medieras av direkta åtgärder av glukos på L-cellen. En annan viktig begränsning av isolerade perfunderade tarmen är att vissa av lipider är svårt att studera på grund av deras vattenavvisande egenskaper. Även om det är möjligt att undersöka slutprodukterna av lipid matsmältning (fettsyror, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) och även om preparatet kan kunna åter esterify packa lipider inom cellularly och kanske dem i kylomikroner, transport av kylomikroner ur cellerna och deras efterföljande upptag av lacteals av villina avbryts, eftersom lymfan flödet i isolerade tarmen inte kan säkras. Troligtvis därför stoppas lipid absorption när de absorbera produkterna börjar ansamlas i cellerna. De in vitro rapportör cell-system är ännu mindre lämplig för lipid studier på grund av deras bristande polarisering. Självklart, denna begränsning är bara relevant för lipider som absorberas och transporteras via lacteals, medan de absorberas via intestinal blodkärlen sannolikt kommer att hanteras normalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier genomfördes med tillåtelse från det danska djur experiment inspektionsorganet (2013-15-2934-00833) och den lokala etiska kommittén, i enlighet med riktlinjerna i dansk lagstiftning om djurförsök (1987) och nationella Institut för hälsa (Publikationsnummer 85-23).
1. försöksdjur
- Få manliga Wistar råttor (250 g) och hus 2 per bur, med ad libitum tillgång till standard chow och vatten, och bibehålla i en 12:12 h ljus-mörker cykel. Våra djur anläggningar använder icke behandlat vatten och Alrtromin gnagare chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danmark).
Obs: Tillåt djur minst en vecka av acklimatisering.
2. preoperativa förberedelser
- Gör perfusion buffert: Krebs-ringsignalen bikarbonatbuffert kompletteras med 0,1% BSA (fraktion V), 5% dextran T-70, 3,5 mmol/L glukos och 5 mmol/L Pyruvat, tenofovirdisoproxilfumarat och glutamat (vid behov); pH 7,4.
- Förbereda en tillräcklig mängd perfusion buffert genom att filtrera det genom en lämplig storlek på filtret och justera pH till ~7.5 genom droppvis tillsätta 5 M HCl.
- Lägga till 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (vid behov) direkt bufferten på dagen för undersökningen till en slutlig koncentration på 10 µM.
Obs: IBMX är en fosfodiesteras hämmare som ökar [cAMP]jag och därmed återställer känslighet och lyhördhet i tarmen när det gäller utsöndra hormoner till en sekretoriska stimulans. - Förbereda test lösningar. Förbereda vaskulär stimuli på en 20 x högre koncentration än önskad slutliga koncentration i filtrerad och pH-justerade perfusion buffert. Förbereda luminala test stimuli i isotonisk saltlösning i slutliga koncentration.
- Lös inte lättlösliga föreningar i 100% dimetyl sulfoxid (DMSO) och späd ytterligare i perfusion buffert eller isoton koksaltlösning. För vaskulär stimuli, hålla slutliga DMSO koncentration på 1% eller nedan, som koncentrationer ovan detta skada tarmen och kan leda till ospecifika gut hormon sekretion. Mät pH och justera till ~7.5 om det behövs.
3. drift och Perfusion
Obs: En illustration av en perfusion setup ges i figur 1.
- Söva råttorna genom användning av en narkos regim som kan upprätthålla kirurgisk anestesi och analgesi för 30-40 min med Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g kroppsvikt, per ml: Hypnorm: 0,08 mg fentanyl, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Metylparahydroxibensoat, 0,05 mg Propylparahydroxibensoat, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Danmark)
- Kontrollera brist på reflexer (tå nypa), placera råtta på uppvärmd operationsbordet och utför ett snitt i huden för att utsätta tarmen.
-
Utsätta den terminala delen av tjocktarmen genom att flytta den små inälvan undan så mycket som möjligt. Slips för att leverera kärlsystemet till tjocktarmen och punktskatt det gradvis med början från den terminala delen av tjocktarmen, riktning mot tunntarmen.
- Om endast en viss del av tunntarmen krävs för perfusion (den övre halvan), punktskatt icke-krävs segment efter knyta off levererar kärlsystemet. För att minimera vävnadsskada, återfukta tarmen med isotonisk saltlösning och använda kompresser att ta bort bindväv.
- Infoga ett plaströr (längd: ~ 15 cm, Ytterdiameter: ~0.4 cm) in i intestinala lumen (i den proximala delen) och slips det ordentligt med suturer. Spola noggrant med isoton koksaltlösning (rumstemperatur) att tömma lumen av chymus.
- BEGJUTA lumen med den isotonisk saltlösning vid ett flöde av 0,25 mL/min, med en 10 mL spruta ansluten till en sprutpump.
- Åt tarmen så den övre mesenterica artären är tillgänglig och ta bort bindväv och fett vävnad för att exponera artären.
- Placera två suturer under mesenteriala artären med hjälp av fin punkt tången; en av suturerna är för att lyfta artären att kontrollera blödning när artären har skurits och den andra är för att säkra den kateter som placeras i artären. Var försiktig att inte perforera artär.
- Placera två suturer under portalen ven för att säkra metall katetern som kommer att placeras i venen för insamling av perfusion utflödet.
- Innan du skär hålet i den mesenterica artären, säkerställa att katetern som kommer till insatt in i artären fylls med perfusion buffert för att förhindra luft embolus bildning.
- Klipp ett litet hål i mesenteriala artären med hjälp av ett par kirurgisk sax och infoga plast katetern omedelbart efter.
- Omedelbart efter att katetern har säkrats, initiera Perfusionen i tarmen genom att starta den rulle pumpen (flöde = 7,5 mL/min).
- Bekräfta att blodkärlen i tarmen blekna inom några sekunder, och portalen ven blir blek.
- Omedelbart efter ordentlig perfusion har fastställts, skär ett hål i portalen ven, infoga metall katetern och fäst det med suturen.
Obs: Katetern kan vara svårt att plats men lyfta venen upp genom att försiktigt dra den mest proximala suturen hjälpen. - När katetrar är på plats och perfusion utdata är tillfredsställande, döda råttan genom membran perforering, vara noga med att inte slita ut katetrar.
- Samla perfusion utgång för 1 min och mäta volymen. Starta perfusion trycket förvärv/inspelningarna av klick Utföra Experiment i programmet tryck inspelning.
- Täcka tarmen med fuktade vävnad för att hindra den från att torka ut under experimentet.
- Se till att den distala änden av tarmen inte blockeras så att luminala utflödet kan avsluta, annars tarmen kommer att svälla, ödem utvecklas, perfusionstrycket kommer att öka och perfusion utdata kommer att sjunka.
- Låt beredningen för ca 30 min innan experimentet.
Obs: Sekretoriska utgångarna av gut hormoner är mycket ostadiga för de första 15 min av perfusion, så detta Jämviktstiden steg behövs för att få en stadig originalplan.
4. experiment
- Efter ca 30 min av perfusion, starta experimentet genom att samla den första baslinje provet med en bråkdel samlare. Samla in prover på önskat tidsintervall (t.ex. varje min, 6,5-7,5 mL brukar samlas) och placera dem på isen inom några min.
-
Inspektera bubbelfällan regelbundet och om tömt, fylla den med perfusion buffert.
- Samla in bufferten genom trevägs kuk-ventilen omedelbart innan det träder orgeln och från katetern insatt i portalen ven (efter att det har varit perfusion genom organ) för att bekräfta att orgeln är metaboliskt aktiva. Samla in prover på början och slutet av experimentet att bedöma lönsamheten i hela experimentet.
- Mäta prover snabbt, med en automatiserad blod-gas analyzer, som mest plast innehåller/sprutor inte är helt lufttäta, ger upphov till utbyte med atmosfärisk luft.
- Efter 10-15 min av baslinjen samling, stimulera med första testsubstansen. Administrera intraarteriell stimuli med en sprutpump genom en tre-vägs Avstängningskranen (flöde = 0.350 mL/min).
- Utföra luminala stimuli genom en inledande bolusinjektion (2,5 mL/min under de första 5 min), för att ersätta den isotonisk saltlösning som redan är i lumen, följt av administrering av provlösningen ett lägre flöde (0,5 mL/min).
- För att säkerställa att lumen töms snabbt av testämnet när luminala stimulering perioden är över, spola den intestinala lumenen med isotonisk saltlösning genom att tillämpa samma flöden som ovan.
- Samla baslinje prover för 15-30 min innan nästa testsubstansen administreras. Beroende på protokollet, kan 2-3 prov stimuli vanligtvis inkluderas per experiment. Om det experimentellt protokollet inkluderar aktivering/hämning av en viss molekylär webbplats samtidigt med administrering av en given insulinsekretagog, alltid stimulera pre med aktivator/hämmaren 10-15 min före administrering av insulinsekretagog till se till att webbplatsen molekylär hämmas i början av insulinsekretagog infusion.
- I slutet av protokollet, administrera (5-10 min) en lämplig positiv kontroll för att testa för lyhördhet av preparatet och samla 10-15 min baslinje prover efter stimulering.
Obs: Flera test ämnen kan användas som positiv kontroll, t.ex., stimuli för ökar [cAMP]jag (t.ex. foskolin eller IBMX), [Ca2 +]jag (t.ex. bombesin eller neuromedin C), depolariserande medel (t.ex., 30-50 mM KCl) eller mer fysiologiskt relevanta stimuli såsom makronäringsämnen: Peptoner, aminosyror, glukos, etc. Valet av positiv kontroll beror emellertid på den experimentella resultaten. Glukos är till exempel en dålig cholecystokinin (CCK) insulinsekretagog bombesin är inte en robust insulinsekretagog för glukosberoende insulinotropisk peptid (GIP) sekretion30. - Efter slutet av experimentet, punktskatter perfunderade tarmen, tynga och mäta dess längd. Lägg den i paraformaldehyd och lagra den (4 ° C) för potentiella senare histochemical analys av/vävnadsskada integritet, till exempel genom H & E färgning.
5. biokemiska mätningar
- Kvantifiera koncentrationer av utsöndrade peptider i venös utflödet genom användning av en in-house eller kommersiellt tillgängliga radioimmunoassays (RIA) eller ELISA-analyser. För studier som undersöker absorptionen i tarmen, kvantifiera molekyl av intresse, t.ex., glukos eller aminosyror, i venös utflödet.
Obs: Perfusatet är vanligtvis en bra basal buffert för de flesta analyser, inklusive analyser som bygger på enzymatiska reaktioner (t.ex. kvantifiering av glukos av metoden glucoseoxidase).
6. dataanalys
- Presentera data på olika sätt, exempelvis som ett tid-koncentration-diagram som visar den faktiska sekretoriska utdata (flöde x koncentration) och som kolumn tomt som skildrar den totala sekretoriska utgång under baslinjen och svar perioder (vanligtvis 10-15 tidpunkter).
- Rita den faktiska uppmätta koncentrationen av respektive hormoner som koncentration enheter. (pmol/L),
Obs: Det är bättre att istället uttrycka data som utdata (fmol/min) eftersom med denna modell, till skillnad från in vivo-studier, erhållna värdena är faktiska sekretoriska utdata (på grund av ständig insamling av perfusion utflödet). - Beroende på antalet grupper som skall analyseras statistiskt, Använd tvåsidiga parat t-test (två grupper) eller one-way ANOVA för upprepade mätningar (fler än två grupper) följt av en lämplig post hoc-test för multipla jämförelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan att avgöra huruvida ett givet stimulus orsakar utsöndring av gut hormonet av intresse är beroende av en stabil baslinje utsöndring. Dessutom om inga svar på stimulans observeras, måste en robust sekretoriska svar till den positiva kontrollen framgå att utesluta att bristen på svar på testet stimulus inte återspeglar en allmän brist på lyhördhet. Figur 2A och 2B visar ett exempel på god kvalitetsdata; GLP-1 sekretion från isolerade perfunderade råtta tunntarmen visas 1-min mellanrum (medel ± SEM). Under basala förhållanden är sekretion stadig; både före och efter administrering av testet stimulans (insulin), och en robust sekretoriska svar till positivt är kontrollen (bombesin (BBS)) uppenbart. I tillägg, i genomsnitt GLP-1 utsöndring under basala förhållanden (under respektive baslinjen perioder före insulin eller BBS administration) samt i genomsnitt utsöndring under insulin och BBS stimulering visas som grafer bar (medel ± SEM). Sekretion testades för statistisk signifikans av envägs ANOVA för upprepade mätningar. Baserat på dessa kombinerade data, kan slutsatsen dras att intraarteriell insulin inte stimulera GLP-1 sekretion från isolerade perfunderade råtta tunntarmen.
Figur 2 c och 2D visar ett exempel på GLP-1 sekretion från isolerade perfunderade råtta tunntarmen. Till skillnad från figur 2A och 2Bär dessa uppgifter av dålig kvalitet; utsöndringen är ostadiga på basala villkoren och driver uppåt hela på ett sätt som verkar vara icke-närstående att testa substansen förvaltningar (intra-luminala och intraarteriell fruktos, respektive) och den positiva kontrollen, BBS, resulterar inte i statistisk signifikant ökade GLP-1 sekretion. Det är därför omöjligt att dra slutsatsen om fruktos stimuli ger upphov till GLP-1 sekretion,, e.g. är ökade GLP-1 utsöndringen i slutet av vaskulär fruktos stimulering en fruktos-medierad reaktion eller inte.
Figur 1: exempel på en perfusion setup. Systemet består av en plexiglas monter, en uppvärmd operationsbordet, en värmeväxlare med bygga i bubbelfällan, manometer och en spindel pump för perfusion tryck justering. Perfusion systemet är anslutet till en termostatisk cirkulationspumpen som värmer den gashalt (95% O2, 5% CO2) perfusion buffert till 37 ° C. Dessutom perfusionstrycket registreras kontinuerligt och sensorik av inspelning tryckgivaren och visualiseras och sparad på en PC med lämplig programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Data från isolerade perfunderade råtta tunntarmen. (A, B) ett exempel på ett väl utfört experiment och tillförlitliga uppgifter, (C, D) ett exempel på suboptimala data där perfusionstrycket ökade, och perfusion produktionen minskade dramatiskt under tiden studien. (A) GLP-1 (totalt) output (fmol/min) visas under basala förhållanden och som svar på intraarteriell insulin administration (200 och 1000 pM, som anges). Bombesin (BBS), en välkänd, potent GLP-1 insulinsekretagog, var infunderas inom arterially i slutet av experimentet till kontrollen för lyhördhet (pos. kontroll). Data presenteras som betyder ± SEM, n = 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolerade perfunderade råtta tunntarmen är en kraftfull forskningsverktyg som tillåter dynamik och molekylära mekanismer bakom gut hormon sekretion studeras i detalj. Det mest kritiska steget för framgångsrik produktion av data med denna modell är det kirurgiska ingreppet. Hantering av tarmen oundvikligen kommer att orsaka några skador på tarmen och bör därför hållas till ett absolut minimum. Hastigheten på driften är ännu viktigare, nyckel, särskilt när det gäller tiden för katetern placering i mesenteriala artären. Vår erfarenhet är att katetern bör placeras på ett framgångsrikt och Perfusionen bör initieras inom ett par minuter efter att ha klippa hålet i fartyget. Placeringen av katetrar är den mest utmanande delen av operationen och kompliceras av det litet storleksanpassar av den mesenterica artären och den tunna väggen av portalen ven, och detta steg kräver lite övning. Snabb insättning av venkateter är dock inte lika brådskande som för den mesenterica artären, som tarmen är nu perfusion och hålls vid liv. Nästa viktiga steg är att utföra experimentet. Om åtgärden utfördes framgångsrikt, perfunderade tarmen kommer vanligtvis trivs och vara lyhörd för upp till 3 h och perfusionstrycket och utdata vanligtvis förblir konstant över hela experimentet. Den viktigaste faktorn för ett framgångsrikt experiment i detta skede är att undvika bubblor att få in i systemet, eftersom detta orsakar luft embolisering som antingen direkt minskar eller eliminerar perfusion utdata. Som perfusion bufferten innehåller BSA och är gasade för att säkerställa tillräcklig syre leverans till perfunderade tarmen, är det svårt att helt förhindra bildandet av bubblor. Bubblorna bör dock vara instängd i systemens bubbelfälla, men detta tömmer gradvis över tid (ju mer bubblor, den snabbare tömning) och det är därför viktigt att hålla ett vakande öga på bubbelfällan och fylla den med perfusion buffert när det behövs. Det är också viktigt att hålla den perfusatet pH under 7,5 — öka pH, kalciumkarbonat fällningar kan bilda, hindrar kapillära flödet och orsaka en allvarlig ökning av perfusionstrycket.
Perfunderade tarmen är en ganska robust förberedelse, men det tål inte höga koncentrationer i rengöringsmedel såsom gallsyror, etanol och DMSO. Därför, användningen av rengöringsmedel bör helst undvikas men behövs ibland att få svårlösliga föreningar i lösning. Perfunderade tarmen generellt tål tvättmedel administreras intra-luminally bättre än inom vascularly. Till exempel, tolererades administrering av 1 mM taurodeoxycholic syra (en sekundär, konjugerade gallsyra) väl när infunderas intraluminally men omedelbart resulterade i blockerade perfusion utgång när levereras inom arterially2. För vaskulär stimuli, hålla slutliga DMSO koncentration under 1% att undvika ospecifikt sekretoriska svaren (DMSO stimulerar, exempelvis GLP-1 sekretion) och att undvika att orsaka vävnadsskada vilket resulterar i ökad perfusionstrycket och minskad perfusion utgång. Experiment bör beaktas om perfusion produktionen minskar med mer än 20% under loppet av studien, om perfusionstrycket ökar mer än 20% eller om ödem utvecklas. Följsamhet till dessa makroskopiska framgångskriterierna (inklusive snabb insättning av katetern i mesenteriala artären) resulterar vanligen i bra kvalitet i ~14/15 experiment.
Efter avslutad experimentet, är nästa kritiska förfarandet att välja lämplig metod och analys för kvantifiering av hormone(s) av intresse. Hög genom-satte testmetoder av peptidhormoner kan utföras med immunanalyser: radioimmunoassay eller ELISA. Hur som helst, det rekommenderas starkt att validera de respektiva analyserna innan du använder dem för provet kvantifiering, eftersom inte alla kommersiellt tillgängliga analyser utföra tillfredsställande när det gäller känslighet, specificitet och noggrannhet (för exempel angående GLP-131). När det gäller specificitet är korsreaktivitet, som alltid, en oro. Ospecifikt störningar och matrix effekter är generellt mindre uttalad med konstgjorda perfusates jämfört med plasma. När det gäller känslighet, det är ofta mycket lättare att få tillförlitliga data från perfusioner än från in-vivo studier som peptiden ofta är högre eftersom perfusion utflödet inte är utspädd till systemcirkulationen och eftersom eliminering processer (av de lung/njuren-) undviks. Typiskt, baslinjen koncentrationer i venös spillvatten ligga inom det lägre arbetsområdet på de flesta analyser (vid GLP-1 (totalt), neurotensin (totalt) och PYY (totalt): 8-15 pmol/L) medan stimuleras Svaren kan nå så hög som 200-300 pmol/L3.
I jämförelse, utgångsvärden för samma hormoner i plasma från friska människor, råttor eller möss är vanligtvis 5-10 pmol/l svarsvärdena är 15-30 pmol/L3,32.
Om fördefinierade framgångskriterierna uppfylls, genererade perfusion data är oftast av bra kvalitet och den statistiska analysen är därefter uppriktig. Jämfört med utsöndring av glukagon, insulin och somatostatin från isolerade perfunderade råtta eller mus bukspottkörteln, basala sekretionen av gut hormoner är stabil, och ganska lika mellan experiment angående uppmätta koncentrationer, och utsöndringen är inte tydligt pulserande. Kollektivt, variationen i datauppsättningen är därför minimal och en urvalsstorlek som är så låg som tre perfusion experiment är ofta tillräckligt för att nå statistisk signifikans. Att standardisera och undvika typ-2-fel, samt att minska risken för utsikt över mindre väl uttalad svaren, rekommenderas dock en stickprovsstorlek på sex till åtta.
Sammanfattningsvis är isolerade perfunderade råtta tunntarmen en viktig, fysiologiskt relevanta, experimentell modell som kan användas för att undersöka den direkta effekten av ett visst ämne på gut hormon sekretion. Viktiga grundläggande frågor, såsom där i tarmen stimulerar en insulinsekretagog secretionen, huruvida det stimulerar utsöndringen genom aktivering av luminally eller basolaterally ligger sensorer och vilka molekylära sensorerna är aktiverade och därmed ansvarig för utsöndringen kan behandlas i detalj med denna modell. Det bör dock, erkännas att losskopplingen av tarmen från donatordjuret kan, för vissa instuderingsfrågor, vara av betydelse. Till exempel tarmen samverkar nära med levern (gut-levern axeln) och hjärnan (gut-brain-axis) och mekanismer som förlitar sig på denna överhörning därför undersökas inte med denna modell. Kvaliteten på operationen är den kritiska faktorn för uppgifternas kvalitet och de viktigaste faktorerna för en framgångsrik verksamhet är att hålla hantering av tarmen till ett minimum och snabbt börja Perfusionen i tarmen när den mesenterica artären har skurits. Det är vår erfarenhet att det tar 2-4 månader av praxis innan data av god kvalitet produceras. Men när tekniken har lärt, är möjligheterna med denna metod nästan oändliga och bara begränsas av lösligheten hos testsubstanser och eventuella skadliga effekter testsubstanser kan ha på perfunderade vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna till detta arbete förklarar inga potentiella intressekonflikter relevanta till denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett fritt bidrag till Prof. Jens Juul Holst från Novo Nordisk Center för grundläggande metabolisk forskning (Novo Nordisk Foundation, Danmark), ett separat anslag från Novo Nordisk Foundation för att göra gnagare perfusion studier (bevilja nr. NNF15OC0016574), ett bidrag till Prof. Holst från European Research Council (Grant no.695069) och Europeiska unionen är sjunde ramprogrammet för forskning, teknisk utveckling och demonstrationsverksamhet (Grant No. 266408) samt en postdoc bevilja Rune E. Kuhre från Lundbeck Foundation (R264-2017-3492). Vi tackar Jenna E. Hunt och Carolyn F. Deacon för noggrann korrekturläsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M.
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M.
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
