Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.
Abstract
Este artigo descreve o método não-invasivo de blastocisto morfometria baseada em microfotografia lapso de tempo para o controlo rigoroso do volume de um blastocisto mudando durante as fases individuais antes e após a vitrificação. O método pode ser útil na busca para o sincronismo mais ideal de exposição de blastocisto a diferentes concentrações de crioprotectores observando o encolhimento de blastocisto e re-expansão em diferentes pré- e pós-vitrificação fases. Com esta metodologia, o protocolo de vitrificação de blastocistos pode ser otimizado. Para uma melhor demonstração da utilidade deste método morfométrico, dois protocolos de preparação diferente blastocisto para vitrificação são comparados; com o uso de um blastocoel artificial em colapso e sem esta intervenção antes de vitrificação. Ambas as variações de volume dos blastocistos são seguidas por lapso de tempo microfotografia e medidas por ferramentas de software de edição de fotos. As medidas são feitas em 20 segundos em fases de previtrification e a cada 5 minutos no período pós-aquecimento. As alterações das dimensões blastocisto por unidade de tempo são apresentadas graficamente em diagramas de linha. Os resultados mostram uma fase de previtrification longo de equilibração, no qual o blastocisto intacto encolhe-se primeiro e então lentamente recargas a blastocoel, entrando em vitrificação com um blastocoel cheio de líquido. O blastocisto artificialmente recolhido permanece na sua fase encolhido pela fase de equilibração inteira. Durante a fase de vitrificação, ele também não altera seu volume. Desde que o blastocisto morfometria mostra um volume constante dos blastocistos artificialmente recolhidos durante a etapa de previtrification, parece que esta etapa pode ser mais curta. O protocolo descrito fornece muitos parâmetros comparativos adicionais de comportamento de blastocisto durante e após a criopreservação em função da velocidade e intensidade das variações do volume, o número de contrações blastocoel parcial ou total blastocisto colapsos e o tempo para um total de blastocoel re-expansão ou o tempo de incubação.
Introduction
Criopreservação de embriões humanos de pré-implantação do in vitro fertilização programa (FIV) hoje em dia é uma prática de rotina na maioria dos laboratórios de fertilização in vitro. O embrião lento congelando o método começou a ser utilizado clinicamente em 1985, com a introdução de crioprotectores específicos e congeladores controlado por computador, que permitiram o resfriamento controlado de embriões até-7 ° C, quando a nucleação de gelo (semeadura) foi induzida na circundante cryoprotective médio1. Por resfriamento contínuo, iria crescer cristais de gelo, causando a hiperosmolaridade da fração líquida restante e, consequentemente, a desidratação e contração das células embrionárias. A-30 ° C ou -80 ° C, os embriões que mergulhou o nitrogênio líquido para conservação mais longa. O que estava acontecendo com os embriões e oócitos durante o resfriamento podia ser observada apenas por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ajudou a melhorar os protocolos de criopreservação2. O congelamento de blastocistos, um volume maior e mais fluido contido fase embrionária, deu resultados clínicos menos promissores naqueles dias3.
O grande avanço na criopreservação do blastocisto foi a introdução do método de vitrificação, em que a desidratação das células ocorreu antes de refrigeração usando altas concentrações de crioprotectores4. A remoção do fluido do blastocoel antes de vitrificação também pode ser conseguida fazendo uma abertura mecânica entre dois trofectoderma células5. Embora a taxa de sobrevivência de blastocisto imediata após a vitrificação e aquecimento está acima de 90% e os seguintes resultados clínicos a transferência de blastocisto vitrificados/aquecido na cavidade uterina é quase comparável aos resultados após a transferência do fresco embriões, esse método de criopreservação ainda não foi padronizada6,7. Protocolos de vitrificação variam de acordo com o tipo e a concentração dos crioprotectores, (b) o número de passos previtrification, (c) a duração das etapas individuais, (d) o uso de um blastocoel artificial em colapso antes de vitrificação, ou não, (e). colapso (g) a temperatura de equilíbrio/vitrificação, fase (f) a expansão de blastocisto e métodos em que os embriões devem ser vitrificados8. Desde crioprotectores podem ser tóxicos para as células, o tempo de exposição do blastocisto para essas soluções tem que ser bem definidos. No entanto, alguns fabricantes de mídia de criopreservação permitam protocolos muito flexíveis.
O interesse dos cientistas é geralmente focado em estudar a capacidade de re-expansão do blastocisto com o objectivo de encontrar novos biomarcadores com uma melhor previsão de implantação6,9,10. Como humanos blastocistos desidrata-se em diferentes etapas de adição de crioprotectores antes de vitrificação e o que acontece com blastocistos após a vitrificação e aquecimento, quando os crioprotectores têm ser retiradas as células, e como os blastocistos hidratar e re-expandir após o aquecimento, é não bem descrito nem compreendido. O desenvolvimento de uma metodologia para o objectivo e quantificados monitoramento do comportamento de blastocisto durante etapas diferentes de criopreservação é, portanto, lógica.
Com microscópios de lapso de tempo de vários fabricantes, agora é possível acompanhar o comportamento do blastocisto no pré e pós-vitrificação fases. Incluindo ferramentas de computador adicional, medições de seu tamanho (morfometria) também podem ser realizadas. Por medição a diminuição ou aumento no tamanho do embrião em um determinado momento, é possível objetivar a avaliação da morfodinâmica de embriões durante a desidratação e reidratação.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Nacional de ética médica em 19 de abril de 2016 (n º 0120-204/2016 – 2).
1. instalação do sistema de gravação de microscópio
- Desliga a placa de aquecimento do microscópio.
- Antes de qualquer tratamento, tirar um instantâneo de um blastocisto sob um microscópio invertido câmera equipada. Lembre-se de observar a ampliação na qual foi gravado o blastocisto.
2. seleção e Prepreparation de blastocistos para vitrificação
- Selecione somente blastocistos dia 5 ou 6-dia totalmente expandidos para Criopreservação com pelo menos algumas células de (ICM) massa celular interna e trofectoderma coesa.
- Para blastocistos laser-tratado com um blastocoel recolhido, assunto um blastocisto para um pulso de laser curto (0,4 - 0,7 ms) com um diâmetro de furo, variando de 4,3 a 9,4 µm, dirigido tangencialmente a zona pelúcida e uma junção de duas células adjacentes trophectodermal. Permitir que o blastocisto para totalmente ou parcialmente em colapso por 5 min.
- Para blastocistos não tratados com um blastocoel intacto, não realizar nenhum tratamento específico antes de vitrificação.
Nota: Esses blastocistos são considerados intactos.
3. preparação do crioprotetor e uma placa de Petri para a fase de equilíbrio
- Pipeta de pithe uso de desnudamento do oócito (µm de diâmetro 135) preencher assepticamente mídia equilibração (média de tampão HEPES M-199 com 7,5% DMSO, glicol de etileno de 7,5%, 20% DSS) nos furos da área microdroplet de um prato de Petri 9-bem projetado especialmente para microscopia de lapso de tempo e gravação.
Nota: Desnudamento do oócito é um processo de remoção de células do cumulus rodeiam o oócito. A utilização de uma pipeta de desnudamento do ovócito vai ajudar a evitar a criação de bolhas de ar. - Sobreposição de área de microdroplet com 30 µ l de mídia de equilibração.
4. transferência do blastocisto na solução de equilíbrio
- Mergulhe um blastocisto tratada com laser ou intacto o equilibrio medium para o fundo da área de microdroplet do prato microdroplet por 10 min à temperatura ambiente (fase de equilibração).
- Começa uma contagem regressiva 10-min, assim que o blastocisto é transferido para o equilibrio medium.
5. gravação do blastocisto na fase de equilíbrio
- Transferi a cápsula de microdroplet com o blastocisto para um microscópio câmera equipada. Use a mesma ampliação como anteriormente para obter um instantâneo do blastocisto mesmo. Posição do microdroplet do prato para que o blastocisto é posicionado aproximadamente no centro da gravação.
- Inicie a gravação com o microscópio software de gravação. Observe o tempo de contagem regressiva, em que a gravação é iniciada.
Nota: Ver resultados representativos de gravações de uma intacta (Figura 1, Video 1) e um blastocisto recolhido (Figura 2, vídeo 2) durante a exposição de 10 min para uma solução de equilíbrio.
6. vitrificação de blastocisto
- Assepticamente dispense uma gota de 50 µ l da solução de vitrificação (M-199 tampão HEPES médio com 15% DMSO, glicol de etileno de 15%, 20% DSS, 0,5 M de sacarose) em uma placa de Petri 2min antes da contagem regressiva acabar.
- Parar a gravação quando a contagem regressiva 10-min termina e transferir rapidamente o blastocisto para solução de vitrificação por 30 s, à temperatura ambiente.
- Pipetar suavemente o blastocisto pelo menos 1 x dentro da solução de vitrificação.
- Use uma palha de vitrificação para carregar o blastocisto. Carregar, selar e mergulhar a vitrificação palha em nitrogênio líquido (LN) dentro de 80 s, não superior a 110 s após a exposição inicial para a solução de vitrificação.
7. a edição de vídeo do blastocisto gravado durante a fase de equilíbrio
- Importe um arquivo de vídeo gravado em software de edição de vídeo.
- Mova o controle deslizante cronograma para 20 nota s. o número de quadro neste momento.
Nota: Este número será usado para dizimar os quadros de vídeo desnecessários. Só quadros cada 20 s será usado. - Clique na guia vídeo , então a taxa de quadros.... Em conversão de taxa de quadros, verificar o campo de dizimar por e insira o número do quadro observado anteriormente. Confirme clicando Okey. Clique em arquivo → Exportar → sequência de imagens.
- Escolha JPEG como formato de saída, defina o diretório para armazenar a salva sequência de imagens e clique Okey.
Nota: Isto criará um diretório com até 30 imagens do blastocisto gravado em sequência durante a fase de equilibrio da vitrificação.
8. medições de área de seção transversal do blastocisto de imagens criadas durante a fase de equilíbrio
- Abra o software de análise de vídeo. Clique na guia da janela e selecione a linha do tempo.
- No painel Timeline, clique no sinal de tira de filme e escolha Adicionar mídia... para adicionar uma imagem do blastocisto antes da fase de equilibrio de vitrificação — e antes da intervenção do laser, se houvesse qualquer.
Nota: Esta imagem mostrará o blastocisto no seu estado mais expandido e sua área de seção transversal servirá como uma referência. - Adicione a sequência de imagem do blastocisto correspondente gerado anteriormente com software de edição de vídeo (da fase de equilibrio de vitrificação).
- Ir para imagem análise → → → Selecionar pontos de dados personalizado para abrir a janela selecionar pontos de dados .
- Cancele a seleção de todos os pontos de dados, em seguida, selecione apenas a área e confirme clicando Okey.
- Mova o controle deslizante cronograma na janela do cronograma para a primeira imagem.
- Clique na guia da janela e escolha ferramentas.
Nota: Isto irá ativar o painel de ferramentas do lado esquerdo. - Escolha a ferramenta Seleção rápida.
- Posição do marcador de ferramenta dentro do blastocisto para tocar a borda do blastocisto. Delinear o blastocisto, colocando o marcador da ferramenta na borda externa do blastocisto, clicando e segurando o botão esquerdo do mouse e arrastar o marcador da ferramenta ao longo da borda externa do blastocisto até a área de seção transversal do blastocisto inteiro é selecionado.
Nota: a Zona pelúcida não é uma parte da medição, por isso deve ser excluído (Figura 5). - Na janela Timeline, clique em Log de medição e pressione o botão de Registro de medições .
Nota: Isto irá gravar a área selecionada. - Retorno de volta para a linha do tempo, com o botão direito na imagem e escolha Deselect.
- Mover o controle deslizante cronograma para a próxima imagem e clique na correspondente telha por baixo.
- Delinear o blastocisto na nova imagem com a ferramenta Seleção rápida. Repita a medição.
- Repita este procedimento (etapas 8,9-8,13) imagem por imagem até áreas transversais de todas as imagens são medidas e registadas.
- No final, vá para o Log de medições, selecione todas as medições sob a área variável e exportá-los em um arquivo. txt.
Nota: As unidades de área transversal são pixels quadrados.
9. a edição do arquivo de dados, com áreas de seção transversal do blastocisto gravado de imagens criado durante a fase de equilíbrio
- Transferi os dados das áreas transversais do blastocisto gravado do arquivo. txt para um editor de planilhas.
- Use o primeira área transversal valor como valor de referência 1 e expressa (transform) valor de referência de todos os outros valores para ser uma fração disso.
- Criar uma nova variável Area_r e colar os valores de área transcodificado (exceto o valor de referência) sob ele.
- Junto a variável Area_r, criar uma variável de tempo e adicionar o primeiro valor de tempo.
Nota: O valor de tempo a primeira representa o tempo que passou desde o momento em que o blastocisto foi exposto para a solução de equilíbrio para o início da gravação sob um microscópio câmera equipada. - Calcular cada valor de vez consecutiva a próxima adicionando 20 s para o valor de tempo anterior.
Nota: Este é o intervalo de tempo usado no dizimando desnecessários quadros de vídeo criados durante a gravação.
10. aquecimento do blastocisto
- Prepare a mídia para o aquecimento.
- Um dia antes do aquecimento o blastocisto, assepticamente dispense três gotas de 150 µ l de meio de recuperação em um prato bem-4. Também, em condições de esterilidade dispense médio de recuperação em um prato de 9-bem microdroplet, especialmente concebidos para microscopia de lapso de tempo e gravação. Cobrir o meio de recuperação com óleo de parafina e preincubate-lo a 37 ° C, com 6% de CO2 e de 5% O2.
Nota: O meio de recuperação é um meio de cultivo de embriões blastocisto com albumina de soro humano (HSA) adicionado. A HSA no meio de recuperação deve ser de 12 mg/mL. Para preencher os buracos no prato 9-bem, use uma pipeta para desnudamento do oócito para evitar a criação de bolhas de ar e, em seguida, sobreposição de área de microdroplet com 30 µ l do meio de recuperação. - No dia do aquecimento o blastocisto, assepticamente dispensar 500 µ l de solução (TS) em um único poço de um prato de 4-poço de descongelar e deixe-o aquecer a 37 ° C numa incubadora sem CO2.
- À temperatura ambiente, dispense assepticamente uma gota de 50 µ l de solução de diluição (DS) e duas gotas de 50 µ l de solução (WS) de lavagem em uma placa de Petri estéril. Cubra os DS e o WS1 e WS2 gotas com óleo de parafina.
Nota: Em vez de uma placa de Petri, um prato bem-4 também pode ser usado.
- Um dia antes do aquecimento o blastocisto, assepticamente dispense três gotas de 150 µ l de meio de recuperação em um prato bem-4. Também, em condições de esterilidade dispense médio de recuperação em um prato de 9-bem microdroplet, especialmente concebidos para microscopia de lapso de tempo e gravação. Cobrir o meio de recuperação com óleo de parafina e preincubate-lo a 37 ° C, com 6% de CO2 e de 5% O2.
- Aquecer o blastocisto.
- Identifica a palha HSV com o blastocisto vitrificado para ser removido do armazenamento de LN e transferir rapidamente a palha para um reservatório portátil cheio de LN em preparação para o processo de aquecimento.
- Levantar a palha com fórceps, apenas o suficiente para expor a haste de manipulação de cor. Use um alicate de descarnar auto-ajustáveis para cortar a palha no auge da haste de manipulação de cor.
- Pegue a vara de manipulação e extraí-lo da palha com um movimento rápido, ainda controlada e mergulhe imediatamente a espátula curva da haste de manipulação a 37 ° C TS.
- Agite suavemente a haste de manipulação para desanexar o blastocisto e deixá-lo para um total de 1 min no TS.
- À temperatura ambiente, transfira o blastocisto consecutivamente para DS, WS1 e WS2 por 4 min em cada meio.
- Após o procedimento de aquecimento, transferir o blastocisto para um prato de 4-bem com o meio de recuperação e lavá-lo em todos os três gotas pipetando-lo suavemente.
Nota: A lavagem é feita em cerca de 1 min. - Transferência de blastocisto ao lapso de tempo 9-bom prato com meio de recuperação. Coloque o prato 9-poço sob uma câmera lapso de tempo em uma incubadora (a 37 ° C, com 6% de CO2 e de 5% O2).
Nota: O procedimento de aquecimento Thre, que continua com a colocação do prato de 9-poço sob uma câmera lapso de tempo em uma incubadora, dura aproximadamente 17 min.
11. Time-Lapse gravação da Re-expansão do blastocisto durante a recuperação pós-aquecimento
- Execute o software de gravação de lapso de tempo.
- Escolha uma câmera de gravação.
- Pressione o botão de modo de viver .
- Coloque o cursor do mouse sobre a imagem e use o botão de rolagem para ampliá-la. Clique e segure o botão esquerdo do mouse e mova o cursor para colocar o poço com o blastocisto no meio da tela.
- Sob foco, use as setas verdes de cima para baixo para concentrar o avião de gravação do blastocisto. Sob intensidade de luz, defina a intensidade da luz.
- Clique no botão parâmetros de microscópio para definir o tempo de exposição e gama.
- Pressione fechar o modo de viver.
- Pressione o botão iniciar o projeto e inserir os dados de projeto, selecione o tipo de prato de cultura (3x3 ou 4x4) e desmarque todas as posições, exceto aquele a ser gravado.
- Defina a hora de captura para tirar uma foto a cada 5 min.
- Inicie a gravação, pressionando o botão de aprovar . Grave pelo menos 150 min.
- Pare a gravação, pressionando o botão parar o projeto .
Nota: Consulte os resultados representativos da gravação de um intacto (Figura 3) e um blastocisto recolhido (Figura 4) durante o período de recuperação pós-aquecimento.
12. a edição de vídeo do blastocisto gravado durante a Re-expansão pós-aquecimento
- Vá para a pasta do projeto e localizar imagens gravadas que são de aproximadamente 80 KB em tamanho.
- Criar outra pasta e transferir estas imagens para isso. Renomear as imagens em números, de acordo com o tempo criado. Importá-los para o software como uma sequência de imagem de edição de vídeo.
- Vá para a guia vídeo → filtro → Add e selecione filtro transformar Null .
- Clique no botão do lado direito recorte e cortar a imagem, deixando visível apenas o campo com o blastocisto gravado. Confirme com Okey e novamente com Okey.
- Clique em arquivo → Exportar → sequência de imagens. Escolha JPEG como formato de saída, defina o diretório para armazenar a salva sequência de imagens e clique Okey.
Nota: Isto irá criar imagens redimensionadas (cortadas), preparadas para medições adicionais do software de análise de vídeo.
13. a definição de uma escala de medida em Software de análise de vídeo para as imagens criadas com o Software de gravação de lapso de tempo
- Execute o analisador do software de gravação de lapso de tempo.
- Abra o projeto com o blastocisto gravado.
- Clique no botão analisar no campo com o blastocisto gravado.
Nota: Uma nova janela de Analyze vai abrir. Clique no botão para mostrar a ferramenta de medição de medição . - Use a ferramenta de medição para medir a largura da imagem inteira.
- Botão direito do mouse na imagem e salvá-lo. Nas propriedades, verificar a largura da imagem em pixels.
- Divida a largura real da imagem com sua largura em pixels.
Nota: Isto calcula o comprimento real de um único pixel na imagem. - Execute o software de análise de vídeo.
- Clique na guia da janela e selecione a linha do tempo.
- No painel Timeline, clique no sinal de tira de filme e escolha Adicionar mídia... para adicionar a sequência de imagem do blastocisto re-expansão pós-quente.
- Clique imagem análise → → → Definir escala de medida personalizada para abrir a janela de escala de medida. Para comprimento de Pixel, digite 1; para comprimento lógico, insira o comprimento calculado anteriormente real de um pixel (etapa 13,6); para unidades lógicas, digite µm. Salve a predefinição.
14. medições de área de seção transversal do blastocisto de imagens criadas durante o pós-quente Re-expansão
- Uma vez que a escala de medição é o conjunto e a sequência de imagens importadas, medir áreas transversais do blastocisto da mesma forma como descrito na etapa 8, com a única diferença é que as áreas transversais medidas nestas medições têm unidades em µm2 .
15. a edição do arquivo de dados, com áreas de seção transversal do blastocisto gravado de imagens criado durante o pós-quente Re-expansão
- Transferi os dados das áreas transversais do blastocisto gravado do arquivo. txt para um editor de planilhas.
- Criar uma variável de tempo junto a variável área e adicionar o primeiro valor de tempo.
Nota: neste caso, o primeiro valor de tempo é definido como 10 minutos, que é o início da gravação do tempo-lapso. Cada valor de vez consecutiva a seguinte é calculado adicionando-se 5 minutos para o valor de tempo anterior. Cinco minutos é o intervalo de tempo utilizado entre duas gravações de lapso de tempo consecutivas.
16. criação de um diagrama de linha
- Importe o arquivo de dados de planilha em software de análise estatística para a criação de uma trama de tempo das mudanças de área transversal do blastocisto no tempo durante a fase de equilibrio da vitrificação ou re-expansão pós-aquecimento.
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Representative Results
Em uma demonstração, mostramos o blastocisto morfodinâmica em apenas um previtrification e uma fase pós-aquecimento. Uma diferença de volume do blastocisto no final da fase de equilíbrio e no início da recuperação em meio de cultura mostrou a intensidade do encolhimento do embrião, que, de fato, a intensidade da preservação do embrião contra a cristalização do gelo.
Como isso pode ser notado da Figura 1 e a 1, o blastocisto intacto não ruiu completamente em solução de equilíbrio. O blastocoel contratados apenas parcialmente, mas cerca de 10 minutos, lentamente atingiu o tamanho re-expansão de 70%. Ao contrário disso, o blastocisto artificialmente desabou completamente esvaziado o blastocoel imediatamente após o tratamento com laser, mas em solução de equilíbrio, o seu volume não alterou qualquer mais (Figura 2, vídeo 2). A apresentação do blastocoel re-expansão médio de recuperação (Figura 3 e Figura 4) com microfotografias e com linha de diagramas mostra diferentes padrões de crescimento blastocoel. Uma exibição de uma única medição de área transversal do blastocisto é mostrada na Figura 5.
No meio de vitrificação com uma concentração mais elevada de crioprotectores, blastocistos intactos intensamente encolheu mais uma vez, enquanto o volume recolhido do blastocisto permaneceu praticamente inalterada. Uma apresentação gráfica, usando o protocolo apresentado aqui, é evidente que o blastocisto intacto sofre uma redução gradual da blastocoel (Figura 6), uma vez na solução de equilíbrio e uma vez no meio de vitrificação, enquanto o recolhido o blastocisto atingido um estágio encolhido no início da intervenção com um laser (Figura 7). Isto levanta a questão se a 10 minutos da fase de equilíbrio é realmente necessário para blastocistos recolhidos, ou se este prazo pode ser reduzido.
A apresentação de blastocoel re-expansão pode ser linear ou interrompido com várias contrações maiores ou menores (Figura 8).
Figura 1: microfotografia lapso de tempo das mudanças de um blastocisto intacta durante a exposição à solução de equilibração. Imagens foram gravadas em 20 segundos. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: microfotografia lapso de tempo das mudanças de um blastocisto artificialmente recolhido durante a exposição à solução de equilibração. Imagens foram gravadas em 20 segundos. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: microfotografia lapso de tempo das mudanças de um blastocisto intacta durante o aquecimento-recoverypost. Única imagens foram gravadas a cada 5 minutos. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: microfotografia lapso de tempo das mudanças de um blastocisto recolhido durante o aquecimento-recoverypost. Única imagens foram gravadas a cada 5 minutos. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: exibição de uma única medição de área transversal de um blastocisto. O blastocisto é cuidadosamente cercado com a ferramenta de seleção apropriada no software de análise de vídeo. A zona pelúcida é sempre excluída da medição. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: representação das mudanças na área transversal de um blastocisto intacta. Estes painéis mostram a representação das mudanças na área de seção transversal de um blastocisto intacta durante a exposição para a solução de equilíbrio (A) a vitrificação e (B) durante a recuperação pós-aquecimento. As unidades da área de seção transversal são relativo para a área de seção transversal do blastocisto inicial antes de vitrificação. Linha tracejada conectando painéis A e B é imaginária, que representa as alterações durante a vitrificação, arrefecimento a 196 ° C e o aquecimento a 37 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: representação das mudanças na área transversal de um blastocisto colapsado. Estes painéis mostram a representação das mudanças na área transversal do (A) um blastocisto recolhido durante a exposição à solução de equilíbrio (B) na vitrificação e (C) durante a recuperação pós-aquecimento. As unidades da área de seção transversal são relativo para a área de seção transversal do blastocisto inicial antes de desmoronamento e vitrificação. A linha tracejada no painel A é imaginária e representa o ponto inicial e final durante o colapso do blastocisto. Também a linha tracejada imaginária entre painéis B e C, representa as alterações durante a vitrificação, arrefecimento a 196 ° C e o aquecimento a 37 ° C. Somente as linhas sólidas em painéis B e C são o resultado das medições reais da área transversal durante o processo de recuperação e equilibrio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: apresentação gráfica de diferentes padrões de recuperação de blastocisto após aquecimento. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: vídeo lapso de tempo das mudanças de um blastocisto intacta durante a exposição à solução de equilibração. O vídeo representa as alterações, que duram cerca de 10 minutos em tempo real. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2: vídeo lapso de tempo das mudanças de um blastocisto recolhido durante a exposição à solução de equilibração. O vídeo representa as alterações, que duram cerca de 10 minutos em tempo real. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
O protocolo para a observação de blastocisto morfodinâmica durante e após a criopreservação também pode ser realizada usando ferramentas de software de outros fabricantes e instrumentos semelhantes. Sistemas de lapso de tempo ajustados para embriologia permitem o monitoramento contínuo do desenvolvimento embrionário. O objetivo deste trabalho foi apresentar a quantificação do comportamento de blastocisto durante a preparação dos blastocistos para vitrificação e após o seu aquecimento. Isto foi feito a medição objetiva de alterações na morfologia numa escala temporal. Resultados obtidos dessas medições podem ser analisados e comparados com outros resultados matematicamente. Entre os parâmetros que podem ser seguidos o protocolo descrito são mudanças no tamanho do blastocisto, seu interior celular massa, o blastocoel, ou a zona pelúcida dentro de um determinado período de tempo. O tamanho pode ser exibido como a área de superfície a maior seção transversal de blastocisto, a circunferência do blastocisto ou diâmetro e, após o cálculo, mesmo como o seu volume.
Em estudos anteriores, usando sistemas de lapso de tempo, as medições de velocidade de expansão blastocoel foram feitas apenas em embriões frescos11. Em blastocistos vitrificados/aquecido, apenas os tamanhos dos blastocistos foram medidos imediatamente após o aquecimento e antes da transferência do embrião, ou o período de tempo foi analisado em que aqueceu blastocistos re-expandidos-se para a zona pelúcida9,10 . Mais detalhada blastocisto re-expansão dinâmica foram analisada apenas no nosso anterior estudo8. Neste estudo, o protocolo de morfométricos já tem sido usado para controlar a velocidade e o padrão de re-expansões de blastocisto após aquecimento. Embora esses biomarcadores de crescimento de blastocisto mostraram-se para não ter um alto valor preditivo para implantação, pode ser usados para a comparação do potencial de recuperação de blastocisto após a vitrificação e aquecimento com protocolos e meios diferentes de criopreservação . Ou seja, as contrações maiores do blastocisto durante a blastocoel re-expansão sugerem a fragilidade da camada de trophectodermal que possa ser causada durante a criopreservação e sua incapacidade de suportar a pressão feita pelo blastocoel cheias de líquido.
O protocolo descrito morfométricos pode fornecer muitas análises comparativas adicionais de comportamento de blastocisto, não só após a criopreservação, medindo a velocidade e intensidade das mudanças no volume, o número de contrações blastocoel parcial ou total blastocisto entra em colapso, o momento de total blastocoel re-expansão, ou o tempo de incubação. Além disso, também pode ser usada para determinar o momento mais ideal de exposição de blastocisto a diferentes concentrações de crioprotectores, tal como foi apresentado nos resultados nas fases previtrification. Vanderzwalmen et al mostrou em oócitos de camundongos que vitrificação também pode ser bem sucedida se a pressão osmótica intracelular não alcança um equilíbrio com a solução crioprotetoras externo12. A fase só problemática para a gravação de blastocistos durante a preservação é o período em solução de vitrificação devido ao tempo limitado; o embrião tem que ser exposto a uma concentração mais elevada de crioprotectores e embalados em palha, em menos de 90 segundos. Para as medições, deve ser recomendável usar somente blastocistos que são doados para a investigação. No entanto, clinicamente disponíveis blastocistos podem ser gravada e novamente medido imediatamente após o aquecimento, com o objetivo de observar como eles se comportam na diluição e soluções de lavagem. Imediatamente depois de uma transferência de blastocisto da solução de lavagem para o meio de recuperação, blastocistos tendem a flutuar fora da parte inferior. Isto pode representar uma dificuldade em manter o embrião no mesmo plano focal durante a gravação. Para resolver este problema, é aconselhável preparar um prato com gotas achatadas do meio. Um problema semelhante foi observado por Vanderzwalmen et al . 12.
Em novas pesquisas, que seria útil explorar se o comprimento de exposição dos blastocistos artificialmente recolhidos a crioprotectores poderia ser reduzido, consequentemente, minimizando o efeito tóxico destes produtos químicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é uma parte do programa P3-0327 e pesquisa projeto de pesquisa J3-7177, fundada pela Fundação de pesquisa do Esloveno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
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- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
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- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
