Summary
Her presenterer vi en time-lapse morphometric protokoll for å følge intensiteten av blastocysten krymping og re-utvidelse under previtrification intervensjoner og etter oppvarming utvinning. Anvendelsen av protokollen er mulig i i vitro fertilisering laboratorier utstyrt med time-lapse mikroskop og anbefales i utviklingen av en optimal blastocysten vitrifikasjon metode.
Abstract
Denne artikkelen beskriver den noninvasive metoden av blastocysten morphometry basert på time-lapse Mikrofotografering for nøyaktig overvåking av en blastocyst volum endre individuelle faser før og etter vitrifikasjon. Metoden kan være nyttig i å søke etter det mest optimale tidspunktet for blastocysten eksponering for ulike konsentrasjoner av cryoprotectants ved å observere blastocysten krymping og re-utvidelse i ulike pre og post vitrifikasjon faser. Med denne metodikken, kan blastocysten vitrifikasjon protokollen optimaliseres. For en bedre demonstrasjon av nytten av denne morphometric metoden sammenlignes to forskjellige blastocysten forberedelse protokoller for vitrifikasjon; en bruker en kunstig blastocoel kollapset og en uten denne intervensjonen før vitrifikasjon. Begge blastocysts' endres blir etterfulgt av time-lapse Mikrofotografering og av foto-redigering verktøy. Målingene hentes hver 20 sekunder i previtrification faser og hver 5 minutter etter oppvarming perioden. Endringene av blastocysten dimensjonene per tidsenhet presenteres grafisk i linje diagrammer. Resultatene viser en lang balanse previtrification fase der intakt blastocysten først krymper og deretter sakte påfyll blastocoel, angi vitrifikasjon med en væskefylte blastocoel. Kunstig skjult blastocysten forblir i sin krympet scenen hele balanse fasen. I fasen for vitrifikasjon også endres ikke volumet. Siden blastocysten morphometry viser et konstant antall kunstig skjulte blastocysts under previtrification trinnet, synes det at dette stadiet kan være kortere. Beskrevet protokollen gir mange sammenlignende tilleggsparametere blastocysten oppførsel under og etter kryonisk bevaring på grunnlag av hastigheten og intensiteten av endres, delvis blastocoel sammentrekninger eller totale blastocysten kollapser, og tid til en totalt blastocoel re-utvidelse eller tid til å klekking.
Introduction
Kryonisk bevaring av menneskelig preimplantation embryoer fra i vitro fertilisering programmet (IVF) er i dag en rutinen praksis i de fleste IVF laboratorier. Langsom embryoet frysing metoden begynte for klinisk bruk i 1985, med innføringen av spesifikke cryoprotectants og datastyrt frysere, som aktivert kontrollert kjøling av embryo ned til-7 ° C, når isen nucleation (såing) ble indusert i den rundt cryoprotective middels1. Ved kontinuerlig kjøling, iskrystallene ville vokse, forårsaker hyperosmolality av gjenværende flytende brøken og følgelig dehydrering og krymping av embryonale celler. På 30 ° C eller-80 ° C, ville embryoene bli kastet inn i flytende nitrogen for lengre lagring. Hva skjedde med embryo eller oocytes under nedkjøling kunne observeres av spesialtilpassede cryomicroscopes, som bidro til å forbedre kryonisk bevaring protokoller2. Frysing av blastocysts, en høyere volum og mer væske-inneholdt gryende scenen, ga mindre lovende kliniske resultater i disse dager3.
Gjennombrudd i kryonisk bevaring av blastocysten var innføringen av metoden vitrifikasjon der dehydrering cellene fant sted før du kjøler deg ved hjelp av høye konsentrasjoner av cryoprotectants4. Fjerning av væsken fra blastocoel før vitrifikasjon kan også oppnås ved å gjøre en mekanisk åpningen mellom to trophectoderm celler5. Selv om umiddelbar blastocysten etter vitrifikasjon og oppvarming er over 90%, og kliniske utfallet følgende er overføring av vitrified/varmet blastocysten inn i livmor hulrom nesten sammenlignes med resultater etter overføring av frisk embryo, denne kryonisk bevaring metoden har ennå ikke er standardisert6,7. Vitrifikasjon protokoller variere med (a) type og konsentrasjonen av cryoprotectants, (b) antallet previtrification trinn (c) varigheten av individuelle stegene, (d) bruken av en kunstig blastocoel kollapset før vitrifikasjon eller ikke, (e). skjule metoder og (f) utvidelsen blastocysten scenen (g) balanse/vitrifikasjon temperaturen på som embryoene skal vitrified8. Siden cryoprotectants kan være giftig for celler, må eksponeringstid blastocysten å disse løsningene være godt definert. Men tillater noen kryonisk bevaring medier produsenter svært fleksibel protokoller.
Interessen for forskere er vanligvis fokusert på å studere blastocysten re utvidelse evnen med sikte på å finne nye biomarkers med en bedre forutsigelse av implantasjon6,9,10. Hvordan menneskelige blastocysts tørke i forskjellige trinn for å legge cryoprotectants før vitrifikasjon og hva skjer med blastocysts etter vitrifikasjon og oppvarming, når cryoprotectants må fjernes fra cellene, og hvordan blastocysts rehydrate og å utvide etter oppvarming, er ikke godt beskrevet eller forstått. Utvikling av en metode for målsettingen og kvantifisert overvåking av blastocysten atferd i ulike kryonisk bevaring trinnene er dermed begrunnelsen.
Med time-lapse mikroskoper av forskjellige produsenter er det nå mulig å overvåke oppførsel av blastocysten i pre og post vitrifikasjon faser. Ved ytterligere dataverktøy, kan målinger av sin størrelse (morphometry) også utføres. Ved måling reduksjon eller øke i fosteret størrelse på et gitt tidspunkt, er det mulig å objectify evaluering av morphodynamics av embryo dehydrering og rehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den nasjonale medisinske etikk på 19 April 2016 (nr 0120-204/2016-2).
1. oppsett av mikroskopet innspillingssystem
- Slå av varmeplaten av mikroskopet.
- Før behandling, kan du ta et øyeblikksbilde av en blastocyst under kamera utstyrt invertert mikroskop. Husk å merke forstørrelsen der blastocysten ble registrert.
2. utvalg og Prepreparation av Blastocysts for vitrifikasjon
- Velg bare fullt utvidet dag-5 eller dag-6 blastocysts for kryonisk bevaring med minst et par indre masse (ICM) celler og sammenhengende trophectoderm.
- Laser-behandlet blastocysts med en skjult blastocoel, emnet en blastocyst en kort laser puls (0.4 - 0,7 ms) hull diameter mellom 4.3 9,4 µm, tangentially gjorde zona pellucida og et kryss mellom to tilstøtende trophectodermal celler. Tillate blastocysten helt eller delvis sammen i 5 min.
- Ubehandlet blastocysts med en intakt blastocoel, utføre ingen bestemt behandling før vitrifikasjon.
Merk: Disse blastocysts anses intakt.
3. forberedelse av kryoprotektant og en Petriskål for balanse fase
- Bruk pithe pipette for oocyte denudation (diameter 135 µm) tas aseptisk fylle balanse media (M-199 HEPES-bufret medium med 7,5% DMSO 7,5% etylenglykol, 20% DSS) inn i hullene på microdroplet for en 9-og Petriskål spesialdesignet for time-lapse mikroskopi og opptak.
Merk: Oocyte denudation er prosessen med å fjerne cumulus celler rundt oocyte. Bruk av en pipette for oocyte denudation vil bidra til å unngå etablering av luftbobler. - Overlappe området microdroplet med 30 µL av balanse media.
4. overføring av blastocysten i balanse løsning
- Dukke en laser-behandlet eller intakt blastocyst til balanse medium til bunnen av microdroplet microdroplet parabolen for 10 min ved romtemperatur (balanse fase).
- Starte en 10-minutters nedtelling så snart blastocysten overføres til balanse medium.
5. opptak av blastocysten på balanse fasen
- Overføre microdroplet parabolen med blastocysten til et kamera utstyrt mikroskop. Bruke den samme forstørrelsen som tidligere for å ta et øyeblikksbilde av samme blastocysten. Plassering av microdroplet rett slik at blastocysten er plassert ca i midten av innspillingen.
- Start opptak med mikroskopet innspillingen programvare. Merk nedtellingstiden for innspillingen er startet.
Merk: Se representant resultatene av opptak av en intakt (figur 1, Video 1) og en skjult blastocyst (figur 2, Video 2) i løpet av 10 minutters eksponering til en balanse.
6. vitrifikasjon av blastocysten
- Tas aseptisk dispensere en 50-µL dråpe vitrifikasjon (M-199 HEPES-bufret medium med 15% DMSO, 15% etylenglykol, 20% DSS, 0,5 M sukrose) i en Petriskål 2 min før nedtellingen slutter.
- Stoppe innspillingen når 10-minutters nedtellingen slutter og raskt overføre blastocysten til vitrifikasjon for 30 s ved romtemperatur.
- Pipetter forsiktig blastocysten minst 1 x innen vitrifikasjon løsningen.
- Bruk en vitrifikasjon halm for lasting blastocysten. Laste inn, sel og stupe vitrifikasjon strå i flytende nitrogen (LN) i 80 s, ikke overstiger 110 s etter den første eksponeringen til vitrifikasjon løsning.
7. video redigere bort av registrert blastocysten i balanse fasen
- Importere en innspilt video fil til programvare for videoredigering.
- Flytt glidebryteren tidslinjen til 20 s. notat hvor rammen på dette tidspunktet.
Merk: Dette nummeret skal brukes til å overvinne unødvendige videobilder. Bare rammer hver 20 s brukes. - Klikk kategorien Video , deretter bildefrekvens.... Under rammen rate omdanne, kontrollere Decimate av og angi tidligere bemerket ramme. Bekreft ved å klikke OK. Klikk fil → eksportere → bildesekvens.
- Velger JPEG som utdataformat, angi mappen som skal inneholde den lagrede sekvensen av bilder, og klikk OK.
Merk: Dette vil opprette en katalog med opptil 30 bilder av innspilte blastocysten i rekkefølge i balanse fasen av vitrifikasjon.
8. målinger av Blastocystens tverrsnitt fra bilder som er opprettet i balanse fasen
- Åpne video analyseprogramvare. Klikk kategorien vinduet og velg tidslinjen.
- Klikk filmen stripe tegnet i ruten tidslinjen og velge Legg til Media... legge til et bilde av blastocysten før den balanse fasen av vitrifikasjon- og før laser intervensjon, hvis det var noen.
Merk: Dette bildet vises blastocysten på sitt mest utvidet og dens tverrsnitt vil tjene som en referanse. - Legge til bildesekvens av tilsvarende blastocysten generert tidligere med programvare for videoredigering (av balanse fase av vitrifikasjon).
- Gå til Image → analyse → Velg datapunkter → Egendefinert for å åpne vinduet Velg datapunkter .
- Fjern merket for alle datapunkter, og deretter merke bare området, og bekreft ved å klikke OK.
- Flytt glidebryteren tidslinjen i vinduet tidslinjen til det første bildet.
- Velg kategorien vinduet og velg verktøy.
Merk: Dette vil aktivere verktøy-panelet til venstre. - Velg hurtigvalgverktøyet.
- Plasseringsmerke verktøyet inne blastocysten å ta kanten av blastocysten. Skissere blastocysten ved å plassere markøren verktøy på blastocystens ytterkanten, klikke og holde venstre museknapp og dra verktøyet markøren langs blastocystens ytterkant til hele blastocystens tverrsnitt er valgt.
Merk: Zona pellucida er ikke en del av måling, så det må være utelukket (figur 5). - I vinduet tidslinjen velger du Måleloggen og trykk knappen Registrer mål .
Merk: Dette vil registrere det merkede området. - Gå tilbake til tidslinjen, høyreklikk på bildet og velg Fjern merking.
- Flytt glidebryteren tidslinjen til neste bilde, og klikk på tilsvarende ruten under den.
- Skissere blastocysten i det nye bildet med rask markeringsverktøyet. Gjenta målingen.
- Gjenta denne prosessen (trinn 8,9-8.13) av bildet til alle bilder cross-sectional områder måles og registrert.
- Til slutt, gå til målinger loggen, velger alle målene under variabelen området , og eksportere dem i en txt-fil.
Merk: Målenhetene tverrsnitt område er firkantede bildepunkter.
9. redigering av datafilen med innspilte Blastocystens Cross-sectional områder fra bilder opprettet i balanse fasen
- Overføre data registrert blastocystens cross-sectional områder fra det .txt arkiv å en regneark-editor.
- Bruk den første tverrsnitt verdien som referanseverdi 1 og uttrykke (transformere) alle andre verdier skal en brøkdel av som refererer til verdien.
- Opprette en ny variabel Area_r og pasta transkodet området verdiene (unntatt referanseverdi) under den.
- Ved siden av variabelen Area_r Opprett en tid variabel og legge første verdi.
Merk: Første gang verdien representerer den tid som gikk fra øyeblikket blastocysten ble utsatt til balanse løsningen utbruddet av opptak under mikroskop kamera utstyrt. - Beregne hver neste sammenhengende tidsverdi ved å legge til 20 s til forrige verdi.
Merk: Dette er tidsintervallet brukt ved desimering unødvendige videobilder opprettet under opptaket.
10. oppvarming av blastocysten
- Forberede medier for oppvarming.
- En dag før oppvarming blastocysten, dispensere tas aseptisk tre 150-µL dråper utvinning medium i en 4-vel rett. Også tas aseptisk dispensere utvinning medium i en microdroplet 9-vel rett spesialdesignet for time-lapse mikroskopi og opptak. Dekke utvinning mediet med parafinolje og preincubate det på 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2.
Merk: Utvinning medium er et dyrking medium for blastocyst fase embryo med ekstra menneskelige serum albumin (HSA). HSA i utvinning medium skal 12 mg/mL. Å fylle hullene i 9-vel parabolen, bruker en pipette for oocyte denudation for å unngå etablering av luftbobler og overlegg microdroplet området med 30 µL av utvinning medium. - Ved oppvarming blastocysten, tas aseptisk dispensere 500 µL av tining løsning (TS) i en enkelt brønn på en 4-vel rett og la den varme til 37 ° C i en inkubator uten CO2.
- I romtemperatur, tas aseptisk dispensere en 50-µL dråpe fortynning løsning (DS) og to 50-µL dråper vaske løsning (WS) i et sterilt Petriskål. Dekk DS og WS1 og WS2 dråper med parafinolje.
Merk: I stedet for en Petriskål, en 4-vel rett kan også brukes.
- En dag før oppvarming blastocysten, dispensere tas aseptisk tre 150-µL dråper utvinning medium i en 4-vel rett. Også tas aseptisk dispensere utvinning medium i en microdroplet 9-vel rett spesialdesignet for time-lapse mikroskopi og opptak. Dekke utvinning mediet med parafinolje og preincubate det på 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2.
- Varm blastocysten.
- Identifisere HSV halmen med vitrified blastocysten fjernes fra LN lagring og raskt overføre halm til en LN-fylt bærbare reservoaret i forberedelse til oppvarming prosedyren.
- Løft halmen med tang, akkurat nok til å utsette farget håndtering stangen. Bruk en selvjusterende wire stripper for å klippe halm på høyden av farget håndtering stangen.
- Ta håndtering stangen og trekke den fra strå med en rask, men kontrollerte bevegelse, og umiddelbart stupe buet spatula av håndtering stangen i 37 ° C TS.
- Forsiktig swirl håndtering stangen for å løsne blastocysten og la det totalt 1 min i TS.
- I romtemperatur, overføre blastocysten fortløpende DS, WS1 og WS2 for 4 min i medium.
- Etter oppvarming prosedyren, overføre blastocysten til en 4-vel rett med utvinning medium og vask det i alle tre dråper av forsiktig pipettering det.
Merk: Vask er utført i ca 1 minutt. - Overføre blastocysten til time-lapse 9-vel parabolen med utvinning medium. Plass 9-vel rett under en time-lapse kamera i en inkubator (på 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2).
Merk: Thre oppvarming prosedyren, som fortsetter med å plassere 9-vel rett under en time-lapse kamera i en inkubator, varer ca 17 min.
11. tid-lapse innspillingen av blastocysten Re-utvidelse under gjenoppretting etter oppvarming
- Kjøre tid-lapse innspillingen programvare.
- Velg en 8MP Kamera.
- Trykk knappen Live modus .
- Plasser markøren på bildet og bruk det Rull knappen for å forstørre den. Klikk og hold venstre museknapp og flytte markøren å plassere brønnen med blastocysten midt på skjermen.
- Bruk opp og ned grønne pilene for å fokusere opptak flyet av blastocysten fokus. Under lav intensitet, angi lysintensiteten.
- Klikk mikroskop parametere for å angi eksponeringstid og Gamma.
- Trykker Lukk live modus.
- Trykk starte project og angi prosjektdataene, Velg kultur parabolen (3 x 3 eller 4 x 4) og uncheck alle posisjoner unntatt det skal registreres.
- Sett fange timing å ta et bilde hvert 5 min.
- Starte innspillingen ved å trykke på Godkjenn -knappen. Registrere minst 150 min.
- Stopp innspillingen ved å trykke på Stopp prosjektet .
Merk: Se representant resultatene av opptak av en intakt (Figur 3) og en skjult blastocyst (Figur 4) under restitusjonsperioden etter oppvarming.
12. video redigere bort av registrert blastocysten under Re-utvidelse etter oppvarming
- Gå til prosjektmappen og finne innspilte bilder som er omtrent 80 KB i størrelse.
- Opprette en ny mappe og overføre bildene til den. Endre navn på bilder i tall etter da opprettet. Importere dem til videoredigering programvare som en bildesekvens.
- Gå til Video-fanen → Filter → Legg til og velg Null transformering filter.
- Klikk beskjære på høyre side og beskjære bildet, slik at synlig bare feltet med innspilte blastocysten. Bekreft med OK og igjen med OK.
- Klikk fil → eksportere → bildesekvens. Velger JPEG som utdataformat, angi mappen som skal inneholde den lagrede sekvensen av bilder, og klikk OK.
Merk: Dette vil opprette (beskåret) bildest├╕rrelser forberedt for ytterligere mål i video analyseprogramvare.
13. innstilling av en målskala i Video analyseprogramvare for bilder opprettet med tid-lapse innspillingen programvare
- Kjør Analyzer av tid-lapse innspillingen programvare.
- Åpne prosjektet med innspilte blastocysten.
- Klikk på analyser -knappen i feltet med innspilte blastocysten.
Merk: Et nytt analyser-vindu åpnes. Klikk på knappen mål å vise måleverktøyet. - Bruk måleverktøyet til å måle bredden på hele bildet.
- Høyreklikk på bildet og lagre den. I egenskapene, kan du kontrollere bildets bredde i piksler.
- Dele bildets faktiske bredde med bredden i piksler.
Merk: Denne beregner den faktiske lengden på en enkelt piksel i bildet. - Kjør video analyseprogramvare.
- Klikk kategorien vinduet og velg tidslinjen.
- Klikk filmen stripe tegnet i ruten tidslinjen og velge Legg til Media... legge bildesekvens av post varme nytt voksende blastocysten.
- Klikk bilde → analyse → Angi målskala → Egendefinert åpne målskala. Bildepunktlengden, angi 1; for logisk lengde, angi beregnet tidligere faktiske lengden på et bildepunkt (trinn 13,6); Angi µm. lagre forhåndsinnstillingen for logiske enheter.
14. målinger av Blastocystens tverrsnitt fra bilder opprettet under Re-utvidelse etter varme
- Når målskalaen er sett og bildesekvens importert, måle blastocystens cross-sectional områder i samme måte som beskrevet i trinn 8, med den eneste forskjellen er at de målte cross-sectional områdene i disse målingene har enheter i µm2 .
15. redigering av datafilen med innspilte Blastocystens Cross-sectional områder fra bilder opprettet under Re-utvidelse etter varme
- Overføre data registrert blastocystens cross-sectional områder fra det .txt arkiv å en regneark-editor.
- Opprett en tid variabel ved variabelen området og legge første verdi.
Merk: I dette tilfellet, den første tidsverdien er satt til 0 minutter, som er utbruddet av tid-lapse innspillingen. Hver neste ganger verdien beregnes ved å legge 5 minutter til forrige verdi. Fem minutter er tidsintervallet brukes mellom to påfølgende time-lapse innspillinger.
16. opprettelsen av et linje-Diagram
- Importere regneark datafilen i statistisk analyse software for å lage en tid tomt blastocystens tverrsnitt endringer i tid i balanse fasen av vitrifikasjon eller re-utvidelse etter oppvarming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en demonstrasjon viste vi blastocysten morphodynamics i bare én previtrification og én post oppvarming fase. En forskjell i blastocystens volum på slutten av fasen balanse og begynnelsen av utvinne kultur medium viste intensiteten av embryoet krymping, som er, faktisk, intensiteten av embryoet bevaringen mot is krystallisering.
Som det kan være lagt merke fra figur 1 og Video 1, kollapset intakt blastocysten ikke helt i balanse løsning. Blastocoel kontrakt bare delvis, men innen 10 nådde sakte re-utvidelsen størrelsen på 70%. Variabelnavn, kunstig skjult blastocysten tømt helt blastocoel umiddelbart etter laserbehandling, men i balanse løsning, volumet endre ikke noen mer (figur 2, Video 2). Presentasjon av blastocoel re-utvidelse i utvinning medium (Figur 3 og Figur 4) med microphotographs og med linje diagrammer viser ulike mønstre av blastocoel vekst. En visning av en enkelt måling av tverrsnitt område av blastocysten er vist i figur 5.
I vitrifikasjon medium med en høyere konsentrasjon av cryoprotectants, intakt blastocysts intensivt krympet igjen, mens den skjulte blastocysten volum forble nesten uendret. Fra en grafisk fremstilling, ved hjelp av protokollen som presenteres her, er det tydelig at intakt blastocysten gjennomgår en gradvis reduksjon av blastocoel (figur 6), en gang i balanse løsning og en gang i vitrifikasjon medium, mens den kollapset blastocysten nådd et krympet trinn i begynnelsen av intervensjon med en laser (figur 7). Dette utgjør spørsmålet om 10 minutter av balanse er virkelig nødvendig for skjult blastocysts, eller om denne perioden kan forkortes.
Presentasjon av blastocoel re-utvidelse kan være lineær eller avbrutt med flere større eller mindre sammentrekninger (Figur 8).
Figur 1: Time-lapse Mikrofotografering endringene til en intakt blastocysten ved eksponering for balanse løsning. Enkeltbilder innspilt hver 20 sekunder. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Time-lapse Mikrofotografering endringene til en kunstig skjult blastocysten ved eksponering for balanse løsning. Enkeltbilder innspilt hver 20 sekunder. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Time-lapse Mikrofotografering endringene til en intakt blastocysten under recoverypost oppvarming. Enkeltbilder innspilt hver 5 minutter. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Time-lapse Mikrofotografering endringene til en skjult blastocyst under recoverypost oppvarming. Enkeltbilder innspilt hver 5 minutter. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: visning av en enkelt måling av tverrsnitt område av en blastocyst. Blastocysten er nøye omkranset med et egnet markeringsverktøy i video analyseprogramvare. Den zona pellucida, ekskluderes alltid fra målingen. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representasjon av endringene i tverrsnitt område av en intakt blastocysten. Disse skjermbildene viser representasjon av endringer i tverrsnitt område av en intakt blastocysten ved eksponering for balanse løsning (A) vitrifikasjon og (B) under gjenoppretting etter oppvarming. Enhetene tverrsnitt område er relative til den første blastocysten tverrsnitt før vitrifikasjon. Den stiplede linjen koble paneler A og B er innbilt, representerer endres under vitrifikasjon, kjøling-196 ° c, og oppvarmingen til 37 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: representasjon av endringene i tverrsnitt område av en kollapset blastocyst. Disse skjermbildene viser representasjon av endringer i tverrsnitt område av (A) en skjult blastocyst ved eksponering for balanse løsning (B) på vitrifikasjon og (C) under gjenoppretting etter oppvarming. Enhetene tverrsnitt område er relative til den første blastocysten tverrsnitt før skjule og vitrifikasjon. Den stiplede linjen på panel A er imaginære og start- og punktet under blastocyst sammenbruddet. Den imaginære stiplede linjen mellom paneler B og C, representerer også endres under vitrifikasjon, kjøling-196 ° c, og oppvarmingen til 37 ° C. Bare solid linjene i paneler B og C er et resultat av faktiske målinger av tverrsnitt område under balanse og gjenopprettingsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: grafisk fremstilling av ulike mønstre av blastocysten gjenoppretting etter oppvarming. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Intervallfoto endringene til en intakt blastocysten ved eksponering for balanse løsning. Video representerer endringene, som varer nesten 10 minutter i sanntid. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Intervallfoto endringene til en skjult blastocyst ved eksponering for balanse løsning. Video representerer endringene, som varer nesten 10 minutter i sanntid. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen for observasjon av blastocysten morphodynamics under og etter kryonisk bevaring kan også utføres ved hjelp av lignende instrumenter og verktøy fra andre produsenter. Time-lapse systemer justert for embryologi tillater kontinuerlig overvåking av embryo utvikling. Hensikten med verket var å introdusere kvantifisering av blastocysten oppførsel under utarbeidelsen av blastocysts vitrifikasjon og etter deres oppvarming. Dette ble gjort av objektiv måling av endringer i morfologi på en tidsskala. Innhentet resultatene av disse målingene kan matematisk analysert og sammenlignet med andre resultater. Blant parameterne som kan følges av beskrevet protokollen endringer i størrelsen på blastocysten, dens indre cellemasse, blastocoel eller zona pellucida innen en viss tid. Størrelsen kan vises overflaten i blastocysten omkrets og diameter største blastocysten tverrsnittet, og etter beregning, som volumet.
I tidligere studier bruker time-lapse systemer, ble blastocoel ekspansjon hastighet målinger gjort bare på embryoer11. I vitrified/varmet blastocysts, bare blastocysts' størrelser ble målt umiddelbart etter oppvarming og før embryoer, eller tidsperioden ble analysert som varmet blastocysts nytt utvidet til den zona pellucida9,10 . Mer detaljert blastocysten re utvidelse dynamics ble analysert i våre tidligere studie8. I denne studien har morphometric protokollen allerede brukt til å spore hastigheten og mønster av blastocysten re-utvidelser etter oppvarming. Selv om disse blastocysten vekst biomarkers har vist ikke for å ha en høy prediktiv verdi for implantasjon, kan de brukes til sammenligning av blastocysten utvinning potensielle etter vitrifikasjon og oppvarming med forskjellige kryonisk bevaring media og protokoller . Nemlig foreslå de større sammentrekninger av blastocysten under blastocoel re-utvidelse svakhet av det trophectodermal laget som kan oppstå under kryonisk bevaring, og sin manglende evne til å tåle trykket laget av væskefylte blastocoel.
Beskrevet morphometric protokollen kan gi mange flere sammenlignende analyser av blastocysten atferd, ikke bare etter kryonisk bevaring, ved å måle hastigheten og intensiteten av endringer i volum, delvis blastocoel sammentrekninger eller totalt blastocysten kollapser, tid til totalt blastocoel re-utvidelse, eller tid til å klekking. Videre, det kan også brukes previtrification faser for å bestemme det mest optimale tidspunktet for blastocysten eksponering for ulike konsentrasjoner av cryoprotectants, som ble presentert i resultatene. Vanderzwalmen et al. viste på mus oocytes at vitrifikasjon også kan lykkes hvis intracellulær osmotisk trykk ikke når en likevekt med eksterne kryoprotektant løsning12. Bare problematisk fasen for opptak av blastocysts under bevaring er perioden i vitrifikasjon på grunn av begrenset tid; fosteret har å bli utsatt for en høyere konsentrasjon av cryoprotectants og pakket inn halm på mindre enn 90 sekunder. For disse målene, vil det bli anbefalt å bruke bare blastocysts som blir donert til forskning. Klinisk tilgjengelig blastocysts kan likevel være registrert og målt igjen umiddelbart etter oppvarming, med sikte på å observere hvordan de oppfører seg i fortynning og vask løsninger. Umiddelbart etter en blastocyst overføring fra vask løsning til utvinning medium, blastocysts tendens til å flyte av bunnen. Dette kan representere en vanskelighet i å holde embryoet i samme fokalplanet under opptak. For å løse dette problemet, anbefales det å forberede en rett med flat dråper medium. Et lignende problem har blitt observert av Vanderzwalmen et al. 12.
Videre forskning, ville det være nyttig å utforske om lengden på eksponering for kunstig skjulte blastocysts cryoprotectants kunne reduseres, derfor minimere den toksiske effekten av disse kjemikaliene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er en del av programmet P3-0327 og forskning forskningsprosjekt J3-7177, grunnlagt av den slovenske Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
