Summary
Her præsenterer vi en protokol for murine i vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner med biotin. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af protein af interesse.
Abstract
Proteinuri skyldes forstyrrelse af det glomerulær filter, der er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes med deres slids membraner. Filteret glomerulær, især slids mellemgulvet, delikat struktur bygger på samspillet mellem forskellige celle overflade proteiner. At studere disse celle overflade proteiner har hidtil været begrænset til in vitro- undersøgelser eller histologiske analyse. Her præsenterer vi en murine i vivo biotinylation mærkning metode, som giver studier af glomerulær celle overflade proteiner under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af en protein af interesse. Semi-kvantitering af glomerulær celle overflade overflod er let tilgængelige med denne nye metode, og alle proteiner tilgængelige for biotin perfusion og immunoprecipitation kan studeres. Isolering af glomeruli med eller uden biotinylation kan desuden yderligere analyse af glomerulær RNA og protein samt primære glomerulær cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).
Introduction
Proteinuri er kendetegnende for glomerulær skade og normalt ledsager afbrydelse af glomerulær filter1. Filteret glomerulær er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes. Filteret glomerulær delikat molekylære struktur er meget dynamisk og underlagt celle overflade protein menneskehandel både raske og syge nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose af celle overflade proteiner har vist sig at være afgørende for overlevelse af podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner udtrykt på podocytes. Nephrin er rygraden i glomerulær slids mellemgulvet, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belægning sekundære mund processer i podocytes8,9,10. Endocytic handel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til bedste af vores viden, har endocytose af celle overflade proteiner ikke endnu blevet beskrevet i glomerulær endotelceller i litteraturen. Imidlertid udtrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for de forskellige typer af endocytose (dvs. clathrin-afhængige, tømmerflåde-afhængige endocytose)15,16. Derfor, endotel celle overflade handel kan studeres med denne metode bruger, for eksempel vaskulære endotel (VE)-cadherin og intracellulære vedhæftning molekyle (ICAM-2) som en celle overflade markør protein for glomerulær endotelceller17 .
Desværre, der er ingen nøjagtige in vitro- model for de sarte tre-lags glomerulær filter i hvilken celle overflade protein handel kan studeres. Målet med denne metode er således at studere glomerulær protein menneskehandel i vivo. Denne protokol indeholder desuden oplysninger om, hvordan at isolere glomeruli, muliggør yderligere analyse af glomerulær RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerulær isolation teknikker har været beskrevet af forskellige grupper18,19.
Vi og andre har tidligere brugt ex vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner af biotinylation2,3,4,20,21. Men i denne ex vivo metode, isolerede glomeruli blev udsat for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic handel. Alternativt, immunofluorescens mærkning af glomerulær celle overflade proteiner har flittigt blevet brugt i litteratur2,20,22. Med denne metode, men kun et lille antal proteiner kan analyseres inden for ét dias, og kvantitering af immunofluorescens billeder er ofte vanskelig.
Denne roman i vivo metode giver et pålideligt redskab til at studere glomerulær celle overflade protein overflod og menneskehandel præcist i raske og syge nyrer, og det kan bruges som et supplement til immunofluorescens test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blev der indsamlet en in-house racen fra den lokale dyrs pleje facilitet eller fra Janvier Labs i Frankrig. Undersøgelserne blev gennemført efter retningslinjerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (USA 's nationale institutter i sundhed publikation nr. 85-23, revideret 1996). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante institutionelle godkendelser (delstatsregeringen LANUV reference nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. forberedelse af instrumenter, løsninger og udstyr
- Forberede 1 L af fosfatbufferet saltopløsning suppleret med 1 mM magnesiumchlorid (MgCl2) og 0,1 mM calciumchlorid (CaCl2) (PBSCM) og filtrere det gennem en steril filter.
- Forberede perfusion 5 mL sterilt PBSCM pr. musen og placere den på is.
- For hver mus, forberede 5 mL sterilt PBSCM suppleret med 0,5 mg/mL biotin.
- For hver mus, forberede 5 mL sterilt PBSCM og tilføje 0,8 x 108 magnetiske perler (fx., 200 µL af en 4 x 108 perler/mL løsning, uden forbehandling) for embolisering af glomeruli. Forberede denne løsning under celle kultur bænken at holde de magnetiske perler i den oprindelige tube sterile. Placer denne løsning på is.
- Forbered en quenching løsning ved at tilføje 100 mM glycin til PBSCM (5 mL pr mus) og holde den på is.
- Gøre en collagenase løsning (U/mL 0.378 A collagenase i sterile PBSCM). Per mus, afpipetteres 1 mL af opløsningen, collagenase i et 2 mL rør og placere den på is.
- Til vask, forberede sterile PBSCM (Se trin 1.1) i en 50 mL tube og placere den på is.
- Perfusion, at bruge en sprøjte pumpe med en strøm af 2,0 mL/min.
- Forberede en 10 mL sprøjte med en 21G kanyle. Placer spidsen af nålen i en 20-30 cm lange kateter (indre diameter, ID = 0.58 mm). Tilslut kateteret (ID 0.58 mm) med en 10 cm kort kateter (ID 0,28 mm) og skær spidsen af mindre kateteret skrå til en nem indsættelse i mus aorta.
- For ligatur procedurer under operationen, skære tre 5-7 cm silke tråde (4-0 til 6-0) pr. mus.
- For kirurgi, forberede 3 kirurgiske klemmer, 2 kirurgisk saks, 2 pincet, 2 fine pincet, 1 fine saks og svaberprøver. Forberede bedøvelse (fx intraperitoneal anæstesi ketamin 100 mg/kg legemsvægt og xylazin 5 mg/kg legemsvægt).
- Til isolering af glomeruli af to nyrer, bruge en 100 µm celle si, to 50 ml rør og en magnet catcher.
- Forberede CHAPS lysisbuffer: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7,5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0.1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) pH 8,0; 2 mM sodiumorthovanadate; og 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Cool centrifuger til 4 ° C.
2. operation Under lup
- Bedøver musen (f.eks. med ketamin/xylazin intraperitoneal, se trin 1.11). Udføre den tå-knivspids test for at bekræfte korrekte anæstesi.
- Desinficer den ventrale side af musen med 70% isopropanol.
- Udføre en median snit gennem huden fra bækken til brystbenet og fjern skindet fra abdominal fascia med pincet. Skære huden på begge sider i midten af maven med kirurgisk saks.
- Ændre kirurgiske værktøjer. Anvend en median klip fra formet som et sværd i blæren gennem laget mavemuskel og opdele dem i fire kvadranter ved hjælp af kirurgiske saks og pincet. Fastgør den øverste to sidebemærkning med klemmer mod halsen af musen med to kirurgiske klemmer.
Bemærk: Maven er nu åbnet. - Sætte viscerale organer til side med en steril vatpind og skære den hepatisk-phrenic ligament med fine sakse.
- Forberede en ligatur (med en silke tråd 4-0 til 6-0) i nærheden af aorta proksimalt for nyrearterier på højden af binyrerne med to fine pincet. Spænd den proksimale aorta ligatur at afskaffe blodgennemstrømning med pincet.
- Gratis distale aorta fra fascien, fedt og andre væv og forberede en ligatur omkring hepatisk/mesenterica arterie kranie af nyrearterier ved hjælp af fine kirurgisk pincet.
- Forberede en ligatur (med en silke tråd 4-0 til 6-0) i nærheden af aorta distale af nyrearterier og klemme vena cava og aorta på højden af tvedeling.
- Skær et lille hul i aorta distale til nyrearterier således at hullet er halv diameter af aorta. Sætte kateteret ind i aorta og ordne det med den forberedte ligatur.
Forsigtig: Undgå bobler i perfusion systemet for at forhindre luft emboli. - Start perfusion med den iskolde PBSCM med en væskehastighed på 2 mL/min.
- Skær et hul i nyre-vene på niveauet for nyrearterier med fine kirurgisk saks og stramme ligatur omkring den hepatiske og mesenteriallymfeknuderne arterier.
Bemærk: Nyrer skal vende bleg efter igangsætning perfusion.
3. in Vivo Biotinylation
- Ændre sprøjten boble-fri til iskolde PBSCM suppleret med 0,5 mg/mL biotin for overfladen mærkning og perfuse nyrer med 5 mL med en væskehastighed på 2 mL/min.
Bemærk: PBSCM opløsninger (f.eks. ved at dreje 50 mL rør) blandes forsigtigt at undgå danner bobler inden for løsningen. Efter aspiration af løsning inden for sprøjten, evakuere alle bobler eller luft fra sprøjten. Bruge en ekstra kanyle (21G) på sprøjten til at fylde plads i kanylen, der er tilsluttet ordningen kateter. Endelig holde sprøjten ind kanyle med kateter uden bobler. - Ændre sprøjten boble-fri til iskolde PBSCM suppleret med 100 mM glycin til dæmpning glomeruli og perfuse med 5 mL på en strøm af 2 mL/min.
- Ændring af sprøjten boble-fri til iskolde PBSCM suppleret med 200 μl magnetiske perler/mL og perfuse nyrer på 2 mL/min.
Bemærk: På overfladen nyre embolisering af glomeruli med brun magnetiske perler kan ses.
4. isolering af Glomeruli fra to nyrer
- Fjerne nyrerne på hilum og fjerne kapslen. Placer nyrerne på is i 15 mL af PBSCM i en 10 cm celle kultur parabol. Aflive mus med livmoderhalskræft dislokation under anæstesi efter høst nyrerne. Procedurerne for kirurgi og perfusion sidste ca 20-22 min.
- Skær nyrerne i de mindste stykker muligt med en ny dobbelt-kant klinge. Flytte vævet ind i et 2 mL rør med 1 mL af collagenase A (Se trin 1,6) og fordøje ved 37 ° C i 30 min. Før og efter fordøjelse, blandes forsigtigt med en 1000 μL skære pipette.
- Skyl den fordøjede væv gennem en 100 μm celle si ved hjælp af iskolde PBSCM. Forsigtigt brug celle-skraber til at hakke det resterende væv lavpunktet celle si og skyl det med iskold PBSCM bagefter til en samlet maengde paa 50 mL.
- Der centrifugeres suspension ved 4 ° C 500 x g for 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes med lidt mindre end 1,5 mL iskold PBSCM mens vortexing pellet. Bagefter, sætte glomerulær suspension ind i et nyt 2 mL rør.
5. vask
- Bruge magnet catcher for at trække glomeruli til den ene side. Vent 1 minut før glomeruli har flyttet mod magneten.
- Fjern supernatanten med 1000 μL pipette, mens 2 mL tube forbliver i magnet catcher. Under første og anden vask trin (Se trin 5.3), 250 μL af supernatanten forbliver i røret for at undgå tab af glomeruli. Udføre denne procedure hurtigt for at undgå at lade rørformede strukturer synker til bunden af røret.
Bemærk: Proceduren for vask vil vare længere ellers. - Fjerne 2 mL tube fra magnet catcher og tilsættes 1 mL PBSCM, pipetteres op og ned (meget vigtigt), derefter vortex.
- Lægge røret tilbage i magnet catcher og starte forfra med trin 5.2.
- Gentag trinene vask, indtil renheden af glomeruli har nået 90%. Dette, undersøge en repræsentativ prøve af supernatanten under et mikroskop (40-100 X).
Bemærk: Glomeruli vises som runde strukturer, der indeholder brun magnetiske perler. Aflangt strukturer er rørformede fragmenter, og gratis magnetiske perler vises som brune runde prikker. Celle debris muligvis vises som pladskrævende strukturer. - Hvis renhed er nået, skønne Greven af glomeruli ved at opløse glomeruli i 1 mL PBSCM. Efter blanding, tage en alikvot af 10 μL og tælle glomeruli under mikroskop. Beregne antallet af glomeruli med følgende ligning: endelige antal glomeruli = antallet af glomeruli i 10 μL alikvot x 100.
- Vellykket isolation af glomeruli fører til en række 10.000-40.000 glomeruli.
6. protein udvinding og Immunoprecipitation (IP)
- Indsamle glomeruli ved centrifugering ved 4 ° C ved 6800 x g i 5 min. Fjern supernatanten mens du bruger en magnet catcher og resuspenderes i iskold lysisbuffer (fx., 30.000 glomeruli i 300 μL; CHAPS, se trin 1.11). Homogeniseres prøver med et væv homogeniseringsapparat med den højeste hastighed til 30 s og lyse dem på is i 30 min.
- Fjerne uopløselige materiale ved centrifugering ved 15.000 x g i 30 min for 4 ° C. Der afpipetteres supernatanten, som indeholder cellen lysate ind i en ny 1,5 mL rør. Kassér pelleten.
- Måle proteinkoncentration af supernatanten ved hjælp af en bicinchoninic (BCA)-baseret metode efter fabrikantens anvisninger. En vellykket lysering af 30.000 glomeruli udbytter til en glomerulær protein beløb på 700-1000 µg/mL. Justere lige protein beløb med lysisbuffer.
- Tage en alikvot af 10% af den samlede mængde for glomerulær lysate og tilføje 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) før inkubation i 5 min. ved 95 ° C.
- IP, Ruger resten af lysate med streptavidin Agarosen perler natten over ved 4 ° C på en overhead shaker.
- Centrifugeres Agarosen perler på 1000 x g i 3 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten tilføje 800 μL lysisbuffer at vaske perlerne for uspecifik protein binding.
- Gentag vask 3 gange, og Fjern supernatanten helt.
- Tilsæt 30 μL af 2 x Laemmli + DTT og inkuberes ved 95 ° C i 5 min.
- Indlæse den lysate og IP sonder en 10% SDS gel og køre SDS gel på 70 V i 30 min, så på 20 mA pr. gel for 1,5 h. bagefter, duppes gel i 2 timer ved 200 mA på en nitrocellulose membran.
- Blokere nitrocellulose membran natten over ved 4 ° C med 5% bovint serumalbumin (BSA) i vask buffer.
- Inkuber membran med antistof interesse natten over ved 4 ° C. Vask med vask buffer 3 gange for 5 min på en shaker og inkuberes membran med HRP-tagged sekundær antistof i 1 time ved stuetemperatur. Gentag trinnet vask.
- Visualisere den lysate og immunoprecipitation sonder på membranen ved hjælp af en super-opløsning kemiluminescens agent med en CCD kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at isolere glomeruli præcist, er det nødvendigt at perfuse murine nyrerne med PBSCM først. Perfusion med PBSCM forvandler nyrerne bleg (fig. 1A). Embolisering af glomeruli med magnetiske perler kan ses som brune prikker på nyre overflade (figur 1B). Isolering af glomeruli med magnet catcher må røbe forurening med renal tubuli (figur 1C). Forud for yderligere analyse af glomeruli > 95% renhed af glomeruli skal opnås ved at vaske glomeruli mere grundigt (fig. 1D).
In vivo biotinylation bygger på evnen til at mærke celle overflade proteiner med biotin. For at undersøge dette, er murine nyrerne perfunderet med PBSCM eller ikke-cellemembranen gennemtrængelig biotin. Som vist i figur 2, etiketter biotin kapillær sløjfer i biotin-perfunderet men ikke i kontrol mus nyrerne. For at undersøge celle overflade proteiner af glomerulus mærket af i vivo biotin perfusion, udføres immunoprecipitation af biotin brøkdel af glomerulær ekstrakter. Figur 3 A viser, at glomerulær transmembrane proteiner nephrin og podocalyxin immunoprecipitated inden for biotin brøkdel. Men i kontrol mus, ingen nephrin eller podocalyxin er opdaget i immunoprecipitated del af biotinylated proteiner. Som en negativ kontrol, intracellulær protein ekstracellulære-signal reguleret kinaser p42 og p44 (ERK) findes ikke i immunoprecipitated del af biotinylated proteiner både kontrol-og biotin-perfunderet mus nyrerne. For at bekræfte, at celle overflade protein nephrin er faktisk biotinylated af denne metode, er nephrin udfældet fra kontrol og biotin-perfunderet mus nyrerne. For at visualisere biotin, er immunoprecipitated fraktion plettet med streptavidin. Figur 3 B viser biotinylated nephrin i biotin-perfunderet men kontrollere ikke dyr. Lysate kontrol angiver lige store mængder af protein i kontrol og biotin-perfunderet dyr. Endotel protein vaskulære endotel (VE)-cadherin er immunoprecipitated inden for biotin brøkdel, som vist i figur 3C. I control mus, er ingen VE-cadherin fældet, mens VE-cadherin er til stede i lysates af kontrol og biotin-perfunderet dyr. Intracellulære vedhæftning molekyle 2 (ICAM-2) er udfældet fra biotin-perfunderet dyr, og ingen ICAM-2 er fundet i kontroldyr. Lysates kontrol og biotin-perfunderet dyr viser lige store mængder af ICAM-2 (figur 3C). Aktin serveret som kontrolelementet lastning.
Denne metode kan bruges til at kvantificere mængder af glomerulær celle overflade proteiner i modeller af nefropati (fx, nefrotoksiske nefritis, NTN). I den tidlige fase af NTN [dag 1 (1 d) efter NTN serumbehandling] stiger proteinuri hastigt. I den senere fase af NTN [dag 18 (18 d)] falder proteinuri betydeligt. Figur 4 viser nephrin celle overflade overflod i tidlige NTN (1 d). I vivo biotinylation analysen (figur 4A) viser en reduktion af celle overflade nephrin i NTN dyr i forhold til kontrol. Den densitometric analyse viser en betydelig reduktion af biotinylated nephrin (57%) i NTN dyr i forhold til kontrol (fig. 4C). Kvantitativ analyse af samlede nephrin til aktin afslører ingen væsentlige forskelle mellem kontrol og NTN mus (fig. 4B). Ved hjælp af en p57 podocyte celle specifik farvning, vises podocyte tal lige store mængder i NTN og kontrol dyr (tal 4D og 4E). Figur 5 viser resultaterne af nephrin celle overflade overflod i slutningen NTN (18 d). Figur 5 A viser i vivo biotinylation analysen i kontrol og NTN mus der angiver en genopretning af celle overflade nephrin. Densitometric analyse viser ingen væsentlige forskelle på celle overflade nephrin i kontrol og NTN mus (figur 5B). Samlede nephrin blev reduceret med 25% i NTN mus (figur 5C). Podocyte tal var faldet i NTN mus i forhold til kontrol af ca 19% (tallene 5 d og 5E).
Figur 1 : Nyre perfusion og isolation af glomeruli. (A) Se gennem mikroskopet i den murine situs efter perfusion med PBSCM. Kateter i aorta er angivet med en pil. Perfusion med PBSCM fører nyrerne til at aktivere bleg. (B) embolisering af glomeruli med magnetiske perler vises som brune prikker på nyre overflade. (C) Se selv mikroskopet viser jeg) forurening af glomeruli (brune runde strukturer); II) med tubuli (lys aflange strukturer); og iii) celle debris. Renhed af glomeruli er ca 50%. Gratis magnetiske perler vises som brune prikker (forstørrelse 100 X). (D) Se gennem mikroskopet viser en 95% renhed af glomeruli (forstørrelse 100 X). Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Biotin opdaget i glomerulær kapillær loop. Repræsentative immunofluorescens billede af musen glomeruli (C57BL/6) perfunderet med PBSCM (kontrol) og biotin (biotin). Biotin (grøn) er visualiseret ved streptavidin i glomerulær kapillær loop kun i biotin-perfunderet mus. Control mus viser ikke glomerulær biotin farvning. WT1 (rød) er registreret i kerner af podocytes i både mus. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: In vivo biotin mærkning af glomerulær celle overflade proteiner. (A) Western blot analyse af immunoprecipitated (IP) biotinylated celle overflade proteiner (IP: streptavidin Agarosen perler) og lysates (lysate) af nyrerne fra PBSCM-perfunderet (kontrol) og biotin-perfunderet (biotin) mus. Transmembrane proteiner nephrin og podocalyxin er kun registreret i immunoprecipitated prøver af biotin-perfunderet mus nyrerne. I control mus fundet nephrin og podocalyxin ikke i immunoprecipitated sonder af kontrol mus nyrerne. Lysates kontrol og biotin-perfunderet dyr, er total nephrin og podocalyxin udtrykt ligeligt i begge grupper. Intracellulær protein ekstracellulære-signal reguleret kinaser p42 og p44 (ERK) registreres ikke i immunoprecipitated sonder kontrol og biotin-perfunderet mus nyrerne. I lysates af både mus grupper, er ERK fundet i lige store mængder. Actin er plettet som lastning kontrol. B Western blot analyse af immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) i PBSCM-perfunderet (kontrol) og biotin-perfunderet (biotin) mus. I biotin-perfunderet nyrerne, er nephrin visualiseret med streptavidin farvning, mens ingen registrering af nephrin er fundet i kontrol mus. Immunoprecipitated del af nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) og den lysate fraktion (lysate, WB: nephrin) farvet for nephrin show lige store mængder af nephrin. Aktin bruges som lastning kontrol. C Western blot analyse af immunoprecipitated biotinylated celle overflade protein (IP: streptavidin Agarosen perler) og lysates (lysate) af nyrerne fra PBSCM perfunderet (kontrol) og biotin-perfunderet (biotin) mus. Transmembrane markør protein vaskulære endotel (VE)-cadherin og intracellulære vedhæftning molekyle 2 (ICAM-2) registreres kun i immunoprecipitated fraktion af biotin-perfunderet dyr. Control mus registreres ingen VE-cadherin eller ICAM-2. Actin fungerer som en loading kontrol. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Glomerulær protein nephrin overflod i tidlige nefrotoksiske nefritis nefropati (NTN). (A) Western blot analyse af overflade nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) og total nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) i kontrol og nefrotoksiske serum-behandlede mus (NTN 1 d). Actin fungerer som en loading kontrol. I forhold til kontrol, NTN behandlede mus Vis reduceret celle overflade nephrin (IP: α-nephrin, WB streptavidin) i forhold til kontrol. (B) kvantitativ analyse af samlede nephrin/actin i kontrol og NTN 1 d mus [styre n = 4, NTN n = 6, ikke-signifikante forskelle (ns)]. (C) Densitometric analyse af celle overflade nephrin (biotinylated nephrin/total nephrin) i kontrol og NTN mus (* p < 0,01, styre n = 4, NTN n = 6). (D) Immunhistokemi af p57 viser podocytes i kontrol og NTN 1 d mus. (E) kvantitativ analyse af p57 positive celler pr. tuft område (μm2). (40 glomeruli pr. mus kvantificeret, ns). Western blot data viser middel ± SD. Podocyte tæller vise middel ± SEM. Unpaired t-test med welchs korrektion. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Glomerulær protein nephrin overflod i slutningen nefrotoksiske nefritis nefropati (NTN). (A) Western blot analyse af overflade nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) og total nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) i kontrol og nefrotoksiske serum behandlede mus (NTN 18 d). I forhold til kontrol, NTN 18 d mus Vis lige store mængder af celle overflade nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin). NTN behandlede mus på dag 18 skærm mindre samlede nephrin, og actin fungerer som en loading kontrol. (B) densitometric analyse viser ingen væsentlige forskelle i celle overflade nephrin mellem kontrol og NTN 18 d mus (styre n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric analyse af samlede nephrin til aktin. I NTN mus på dag 18, der er mindre udtryk for nephrin i forhold til kontrol (styre n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) Immunhistokemi af p57 viser podocytes i kontrol og NTN 18 d mus. Der er mindre p57 positive celler (rød) i NTN 18 d mus i forhold til kontrol. Magnetiske perler vises som sorte prikker. (E) kvantitativ analyse af p57 positive celler pr. glomerulær tuft område (μm2) (*** p < 0,0001, styre n = 2, NTN n = 2, 40 glomeruli pr. mus kvantificeret). Western blot data viser middel ± SD. Podocyte tæller vise middel ± SEM. statistisk analyse: parrede t-test med welchs korrektion. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden præsenteres muliggør vellykket isolation af glomeruli at undersøge glomerulær RNA og protein. Derudover kan primære glomerulær cellekulturer udføres fra de isolerede glomeruli. Hvis biotin er anvendt før glomerulær isolation, kan mærkning af glomerulær celle overflade proteiner udføres. Med denne metode, i vivo glomerulær celle overflade protein handel kan studeres, og semi-kvantitering af protein overflod er muligt. De mest kritiske trin til vellykket test glomerulær celle overflade protein overflod er 1) udvikle manuel ekspertise i mus kirurgi især cannulation af aorta, 2) boble-fri forbindelse af sprøjter for at undgå luft embolisering af den glomeruli, og 3) arbejder på iskolde betingelser når perfusion med PBSCM er begyndt.
For denne teknik er manuel ekspertise i mus kirurgi afgørende. Cannulation af aorta er især kritisk, som dissektion af fartøjet vil forhindre perfusion af nyrerne. Snit i aorta skal være stor nok (ca. 50% af fartøjets diameter) til at skabe nok diskplads til at indføre kateteret. Hvis kateteret er skåret diagonalt, vil indførelsen af kateteret ind i aorta blive lettere. Ud over dissektion, skal indførte kateteret være placeret højt inden for aorta for at ikke blokere nyrearterier. Nyrearterier vil ellers ikke være perfunderet med biotin og de magnetiske perler.
Biotin er en lille vitamin, der binder med høj affinitet til streptavidin proteiner. På grund af sin lille størrelse (244 Da), biotin ændrer ikke funktionen af conjugated proteiner og vil blive filtreret gennem glomerulus. Ved inkubering med streptavidin, kan biotinylated proteiner let adskilles fra ukodede proteiner ved agarosegelelektroforese perler eller andre metoder. N-hydroxysuccimide (NHS) estere af biotin binde til Amin (-NH2) grupper af proteiner, der er rigelige på sidekæder af lysin rester, f.eks. Sulfo-NHS-LC-biotin er vand opløselige og celle-vandtætte, hvis cellemembraner er intakt. Sulfo-NHS-LC-biotin har vist sig at mærke celle overflade proteiner23. Binding af biotin NHS estere til amine grupper er afhængige af pH (7-9) og brugen af amin-fri buffere (dvs. PBSCM). PBSCM med en pH-værdi på 7,4 blev derfor brugt til at perfuse mus nyrerne med biotin, da det kombinerer ideelle fysiologiske egenskaber med optimal opløselighed og funktionen af biotin. For at slukke proteiner efter mærkning, er perfusion af PBSCM med glycin udført, giver mulighed for gratis biotin at blive bundet til amine grupper af glycin. For at forhindre cellulære processer efter død af dyret, er det vigtigt at udføre perfusion med en iskold løsning og fortsætte med at arbejde på is.
Lig ex vivo biotinylation metoder, mekanisk stress behandling glomeruli under i vivo biotinylation protokoller maj også indvirkning endocytose, hurtig, signalering begivenheder og RNA integritet. Det er derfor vigtigt, at alle trin er udført på is til at reducere risikoen for enzymatisk cellulære aktivitet.
Proteinuric dyremodeller som nefrotoksiske serum nefritis (NTN) skader mus nyrerne alvorligt. Især resulterer NTN i mesangial ekspansion, glomerulær sklerose og rørformede læsioner, hvilket fører til nyre fibrose i fremskredne stadier af sygdommen (42 dage)24. Nedsat perfusion af sclerosed glomeruli i sygdomsmodeller kan føre til partisk resultater af protein overflod. Sclerosed glomeruli vil sandsynligvis ikke være perfunderet med magnetiske perler og dermed kan ikke blive isoleret i denne metode. I sygdomsmodeller fører til alvorlige glomerulær sklerose, kan ved hjælp af teknikker til at isolere glomeruli via forskellige sieving trin være et alternativ til den magnetiske perler, der bruges i denne protokol25. Men hvis glomeruli er stærkt sclerosed, selv perfusion med biotin kan være nedsat. Desuden vil ex vivo biotinylation, hvor uddraget glomeruli er badet ex vivo i biotin løsninger21, sandsynligvis ikke være en fordel i disse modeller. Alternativt, brug af immunofluorescens for at opdage protein overflod i alvorligt syge glomeruli kan være en fordel, som det ikke stole på perfusion af glomeruli.
Semi-kvantitering af protein overflod ved hjælp af denne teknik fungerer godt ved hjælp af densitometri. Men små forskelle i protein overflod kan blive savnet som følge af detektionsgrænsen for densitometri.
Den beskrevne teknik kan overføres til andre dyrs organer, der er perfunderet, forudsat at strukturerne af interesse er tilgængelige ved isolationen teknikker eller den overflade protein af interesse er specifikke for én celle type eller organ struktur. Selvom alle overflade proteiner er biotinylated af denne teknik, vil ved hjælp af et specifikt antistof til immunoprecipitation føre til brøkdel af celle overflade protein udtryk for den specifikke proteiner (som vist i nephrin i figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Blanka Duvnjak for hendes enestående teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Bidragyder spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling, analyse af data, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
