यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि उनके 3 आयामी आकार के आधार पर स्वस्थ और रोग कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है प्रदान करते हैं । हम 3d प्रक्षेपण पर आधारित रूपरेखा का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन 3 डी के लिए एक आत्म-नक्शा है कि जांच सेल आबादी का उद्देश्य clustering प्रदान करेगा आयोजन को प्रशिक्षित सतहों ।
उपस्थिति और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आंदोलनों उनके पर्यावरण से प्रेरित हैं । एक रोगज़नक़ आक्रमण करने के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं सूजन की साइट पर भर्ती कर रहे हैं और आक्रमण के आगे प्रसार को रोकने के लिए सक्रिय कर रहे हैं । यह भी व्यवहार में परिवर्तन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूपात्मक उपस्थिति के द्वारा परिलक्षित होता है । कैंसर ऊतक में, समान morphokinetic परिवर्तन microglial कोशिकाओं के व्यवहार में देखा गया है: इंट्रा ट्यूमर microglia कम जटिल 3 आयामी आकार है, कम शाखाओं वाले सेलुलर प्रक्रियाओं, और स्वस्थ में उन से अधिक तेजी से कदम ऊतक. ऐसे morphokinetic गुणों की परीक्षा में जटिल 3डी माइक्रोस्कोपी तकनीक की आवश्यकता होती है, जो longitudinally को निष्पादित करते समय अत्यंत चुनौतीपूर्ण हो सकती है । इसलिए, एक सेल के एक स्थिर 3d आकार की रिकॉर्डिंग बहुत आसान है, क्योंकि यह intravital माप की आवश्यकता नहीं है और के रूप में अच्छी तरह से उत्पाद के ऊतकों पर किया जा सकता है । हालांकि, यह विश्लेषण उपकरण है कि 3 डी आकार की तेजी से और सटीक वर्णन की अनुमति देने और स्वस्थ और रोगजनक ऊतक नमूनों के नैदानिक वर्गीकरण केवल स्थिर, आकार से संबंधित जानकारी पर आधारित की अनुमति देता है के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक toolkit कि आत्म-आयोजन नक्शे के माध्यम से 3d कोशिका के 2 डी अनुमानों का एक सेट की रूपरेखा के असतत रूपान्तर घटकों का विश्लेषण करती है वर्तमान । कृत्रिम खुफिया तरीकों के आवेदन हमारे ढांचे के रूप में यह अधिक से अधिक ऊतक नमूनों के लिए लागू किया जाता है के रूप में विभिन्न कोशिका आकृतियों के बारे में जानने के लिए अनुमति देता है, whilst कार्यप्रवाह सरल रहता है.
जैविक ऊतक के रोग की स्थिति का समय पर, सरल और सटीक निर्धारण जैव चिकित्सा अनुसंधान में सबसे अधिक ब्याज की है । माउस मॉडल जटिल 3 डी और 4d (3 स्थानिक आयामों और समय) सूक्ष्म तकनीक के साथ संयोजन में रोग की स्थिति, जैसे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं या कैंसर के विकास, की एक सीमा का अध्ययन करने के लिए साधन प्रदान करते हैं । सूक्ष्म अध्ययन intravital या उत्पाद-ऊतक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, हल्की चादर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जा सकता है, और-फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा-लगभग १०० µm की एक सीमित ऊतक गहराई करने के लिए. आदेश में शारीरिक या रोग की स्थिति के तहत कोशिकाओं के व्यवहार के बारे में समय से संबंधित जानकारी के लिए, यह समय की एक विस्तारित अवधि के लिए ऊतक पर नजर रखने के लिए आवश्यक है, जो आम तौर पर intravital इमेजिंग1,2 की आवश्यकता है . स्वाभाविक रूप से, इस तकनीक की प्रयोज्यता अपनी इनवेसिव के कारण पशु मॉडलों तक ही सीमित है । गैर इनवेसिव तकनीक टोमोग्राफी तरीकों की एक किस्म (MSOT, सीटी, आदि) सहित मानव अनुप्रयोगों, के लिए भी उपलब्ध हैं, लेकिन इन तरीकों सभी आवश्यक स्थानिक कमी-और अक्सर लौकिक संकल्प सेलुलर स्तर पर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए ।
स्थैतिक कोशिकाओं के प्रकटन के बारे में जानकारी और अधिक आसानी से विभिंन 3 डी इमेजिंग उत्पादीय ऊतक नमूनों पर मार डाला तकनीकों के माध्यम से सुलभ हो सकता है । यहां, कोशिकाओं के काइनेटिक व्यवहार मापा नहीं है, इस प्रकार यह उपंयास विश्लेषण तकनीक है कि केवल उनकी आकृति विज्ञान3पर आधारित जांच की कोशिकाओं की रोगजनक स्थिति निर्धारित करने में सक्षम है अपनाने के लिए आवश्यक है । इस तरह के एक दृष्टिकोण के लिए कक्ष आकार और ऊतक textures रोग व्यवहार4,5,6से लिंक किया गया था ।
यहां वर्णित नई तकनीक में, कोशिकाओं को 3d सतहों के रूप में खंगाला जाता है और उनकी आकृतियों को 3d-2d अनुमानों और परवर्ती रूपान्तर आधारित परिधि-आकृति विश्लेषण7,8के माध्यम से पहचाना जाता है । आयामों को 3 से 2 तक कम करके, समस्या को सरलीकृत किया गया है । यह भी यह चिकित्सा9छवियों के लिए किया गया है के रूप में गोलाकार harmonics विश्लेषण लागू करने के द्वारा 3 डी में सतहों सेल की विशेषता के लिए संभव है. हालांकि, गोलाकार harmonics अच्छी तरह से तेज और बीहड़ आकार को संभाल नहीं, इकाई क्षेत्र पर स्थापित किया जा करने के लिए एक बहु-स्केल ग्रिड की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, आवश्यक गोलाकार harmonics घटकों की संख्या बड़ी (50-70), अंतर्निहित गणना बहुत मांग और परिणाम10,11,12व्याख्या करने के लिए मुश्किल के साथ हो सकता है ।
हमारे नए प्रस्तावित विधि के साथ, कार्य 2d आकार वर्णन है, जहां 2 डी अनुमानों की संख्या विश्लेषक पर निर्भर है की एक श्रृंखला के लिए कम है और 3 डी आकार की जटिलता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । अनुमानों एक अजगर स्क्रिप्ट है कि एक 3 डी एनीमेशन उपकरण के अंदर चलाता है के माध्यम से स्वचालित रूप से उत्पंन कर रहे हैं । 2 डी अनुमानों असतत रूपान्तर के द्वारा वर्णित है रूपांतर (DFT) उनकी परिधि के घटकों, एक फिजी13 प्लगइन है कि हमारे सॉफ्टवेयर पैकेज के भाग के रूप में यहां प्रदान की जाती है द्वारा गणना की । DFT यहां लागू किया जाता है ताकि पाप और क्योंकि कार्यों की एक श्रृंखला में सेल के जटिल रूपरेखा विघटित करने के लिए । इस तरह, हम DFT घटकों की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ रूपरेखा का वर्णन कर सकते हैं, इस प्रकार समस्या की जटिलता को कम करने (अधिक जानकारी के लिए देखें समीकरण अनुभाग) । DFT अवयव एक प्रशिक्षित स्वयं में डाल रहे है नक्शे का आयोजन (सोम14), जहां आकार क्लस्टर के अस्तित्व को निष्पक्ष8परीक्षण किया जा सकता है । SOMs कृत्रिम बुद्धि के क्षेत्र से एक प्रतिस्पर्धी और पर्यवेक्षणीय शिक्षण उपकरण प्रदान करते हैं । वे एक भारित पड़ोस दूरी समारोह के माध्यम से एक दूसरे के साथ संवाद जो कृत्रिम ंयूरॉंस की एक लिंक सरणी से मिलकर बनता है । न्यूरॉन सिस्टम इनपुट डेटासेट के पहले तत्व के लिए प्रतिक्रिया करता है और न्यूरॉन्स जिसका जवाब सबसे मजबूत है “समूहीकृत” एक दूसरे के पास. के रूप में तंत्रिका तंत्र और अधिक से अधिक इनपुट प्राप्त करता है, डेटा न्यूरॉन्स कि लगातार प्रतिक्रिया जोरदार रूप से प्रणाली के भीतर क्लस्टर परिभाषित करने के लिए शुरू । एक बड़े डेटासेट कि DFT घटकों का एक सेट के रूप में 2d आकार जानकारी शामिल है पर उचित प्रशिक्षण के बाद, किसी भी व्यक्ति सेल के DFT घटकों प्रशिक्षित सोम में रखा जा सकता है और पता चलता है कि क्या सेल की संभावना स्वस्थ या रोगजनक सेल समूह के अंतर्गत आता है । हम इस तरह के उपकरण वैज्ञानिक और नैदानिक निदान के तरीकों के लिए एक महान इसके अलावा बनने की उम्मीद है ।
छोटे, बरकरार ऊतक नमूनों का उपयोग कर संभावित रोग की स्थिति की पहचान उच्च महत्व का है । ऐसी तकनीक संक्रामक रोगों और आक्रामक प्रकार के कैंसर के लिए एक समय पर प्रतिक्रिया का आश्वासन देगा । विभिंन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के काइनेटिक और रूपात्मक प्रतिक्रियाओं, जैसे, microglia और मैक्रोफेज, शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता है । हालांकि ज्यादातर मामलों में यह व्यावहारिक या भी इन कोशिकाओं के काइनेटिक व्यवहार पर नजर रखने के लिए संभव नहीं है, यह काफी 3 आयामी छवियों को प्राप्त करने के लिए अपने आकार को पुनः प्राप्त सरल है । आमतौर पर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को स्वस्थ ऊतक में एक जटिल आकार और सूजन या कैंसर की स्थिति के तहत एक बहुत सरल रूप ग्रहण18। इस तरह के आकार परिवर्तन के समय निर्भर विशेषताओं Whilst प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास की हमारी समझ में जोड़ना होगा, केवल कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि समूह के 3d आकार का उपयोग भी स्वस्थ या रोग प्रकृति निर्धारित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है ऊतक के ।
निस्र्पक एक सेल के 3-आयामी सतह एक सरल काम नहीं है । गोलाकार harmonics के आवेदन11,12घटकों के एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या (50-70) के साथ एक 3d सतह का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक तरीका है. इसके अलावा, गोलाकार harmonics निर्धारण गणना महंगा है; इकाई क्षेत्र पर बहुत जटिल आकार पेश या तो असंभव है या बहुत इकाई क्षेत्र पर विभिन्न सुंदरता के कई ग्रिड लागू करने के लिए की वजह से मुश्किल; अंतत:, गोलाकार harmonics घटकों के स्पेक्ट्रा की सार्थक व्याख्या तुच्छ होने से दूर है.
हमारे यहाँ प्रस्तुत काम में, हम रोग स्थितियों की पहचान करने के लिए पर्याप्त रूपात्मक जानकारी हासिल करने के लिए मूल सतह के 2d अनुमानों का उपयोग करने के बहुत सरल दृष्टिकोण के साथ प्रत्यक्ष 3 डी सतह विश्लेषण के कठिन काम की जगह । हम माइलॉयड कोशिकाओं से 3 डी सूक्ष्म डेटा का उपयोग करके इस कार्यप्रवाह के हर कदम का प्रदर्शन किया, स्पष्ट रूप से इशारा करते हुए कि सभी कदम को पूरा सरल थे, और जिसके परिणामस्वरूप 2 आयामी नक्शे की व्याख्या करने के लिए आसान थे ।
स्वाभाविक रूप से, एक 3d-2d प्रक्षेपण सतह की संरचना के बारे में जानकारी के नुकसान को बढ़ावा मिलेगा । एक माउस cortical ट्यूमर मॉडल में microglia के हमारे उदाहरण डेटासेट में, यह 2d अनुमानों को बनाते समय छह कोणों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त था । हालांकि, अधिक जटिल आकृतियों, या कम प्रमुख रूपात्मक परिवर्तनों की आवश्यकता हो सकती है कि अनुमानों की एक बड़ी संख्या के रूप में बनाया है ताकि मज़बूती से सोम के साथ सेल उपसमूह की पहचान करने में सक्षम हो । इस कारण से, हमारे दृष्टिकोण को उत्पंन करने और अनुमानों के किसी भी संख्या का विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए डिज़ाइन किया गया है । बस अधिक जटिल आकार के लिए अनुमानों की एक उच्च संख्या का चयन करके, यह एक संतोषजनक ंयूनतम करने के लिए सूचना हानि पैमाने पर संभव है । एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 4a और 4b में बातचीत सेल प्रकार अनुमानों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी क्रम में जटिल सतह का प्रतिनिधित्व करने के लिए ठीक है ।
किसी भी अनुमानित विधि के रूप में, इसके द्वारा प्रस्तावित कार्यप्रवाह18microglia के एक मैनुअल वर्गीकरण प्रक्रिया के परिणामों के खिलाफ परीक्षण किया जाना था । पहले प्रस्तुत परिणामों ने स्वचालित कार्यप्रवाह की विश्वसनीयता की पुष्टि की । इसके अलावा, कार्यप्रवाह पारंपरिक विश्लेषण की तुलना में अधिक कुशल समय है । microglia कोशिकाओं को वर्गीकृत करने वाले चिकित्सा विशेषज्ञ अपने डेटासेट के विश्लेषण के लिए लगभग 4 हफ्तों की जरूरत है, जबकि हमारे कार्यप्रवाह के बारे में केवल 1 दिन की जरूरत है । हमारे दृष्टिकोण की मजबूती भी स्पष्ट रूप से एक ही सेल प्रकार से संबंधित डेटा का एक सबसेट के लिए प्रशिक्षित सोम के reproducibility द्वारा सिद्ध किया गया था, लेकिन सोम ट्रेन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, चित्र 3सी में दिखाने के रूप में.
हालांकि हमारे दृष्टिकोण काइनेटिक जानकारी पर विचार नहीं किया, हम DFT आधारित आकार विश्लेषण पर समय के प्रभाव की जांच की । समय पर निर्भर व्यवहार के लिए सबसे विशिष्ट उदाहरण मोबाइल सेल की आबादी है, जहां उच्च अनुक्रमित DFT घटकों से योगदान स्पष्ट रूप से देख रहा था, के रूप में चित्र 4aके बीच में पाया गया । यह DFT घटकों के एक उच्च पर्याप्त संख्या के उपयोग के महत्व को ध्यान कॉल जब कोशिका प्रकार है कि एक बहुत समय निर्भर तरीके से व्यवहार करने की संभावना है के साथ काम । कारण स्वचालित प्रकृति और हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण के उच्च निष्पादन की गति, DFT घटकों और अनुमानों की वृद्धि हुई संख्या परिशुद्धता और परिणामों की विश्वसनीयता में वृद्धि होगी, whilst वे appreciably गणना प्रदर्शन में बाधा नहीं होगा ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक उपयोगी चर्चा और उनके समर्थन के लिए बिंयामीन Krause धंयवाद । लेखक आगे जी सेल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए रॉबर्ट गुंठर धंयवाद ।
इस कार्य को DFG वित्तीय सहायता NI1167/3-1 (जिमी) से R.N. और Z.C., DFG वित्तीय सहायता सीआरसी १२७८ PolyTarget परियोजना Z01 के लिए Z.C., C01 में TRR130 के लिए R.N. और SFB633, TRR130, Exc257 को A.E.H. और J.B.S. के द्वारा समर्थित किया गया F. L K और अल के लिए बीएफआर अंदर सहायता SFP1322-642 प्रदान की गई
Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start | absnake2 | |
Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |