Morfologie-gebaseerd onderscheid tussen gezonde en pathologische cellen met behulp van Fouriertransformaties en zelf-organiserende kaarten

Summary

Hier bieden we een workflow waarmee de identificatie van gezonde en pathologische cellen op basis van hun 3-dimensionale vorm. Beschrijven we het proces van het gebruik van 2D-projectie contouren op basis van het 3D-oppervlak te trainen een Self-Organizing kaart dat zorgt voor objectieve clustering van de onderzochte cel populaties.

Abstract

Het uiterlijk en de bewegingen van immuuncellen worden gedreven door hun omgeving. Als reactie op de invasie van een ziekteverwekker, de immuuncellen worden gerekruteerd voor de site van ontsteking en worden geactiveerd om te voorkomen dat een verdere verspreiding van de invasie. Dit wordt ook weerspiegeld door veranderingen in het gedrag en de morfologische verschijning van de immuuncellen. In kanker weefsel, soortgelijk morphokinetic wijzigingen zijn waargenomen in het gedrag van microglial cellen: intra-tumoral microglia hebben minder complexe 3-dimensionale vormen, die hebben minder-vertakt cellulaire processen, en sneller dan die in gezond bewegen weefsel. De behandeling van dergelijke morphokinetic eigenschappen vereist complexe 3D microscopie technieken, die zeer uitdagend wanneer lengterichting uitgevoerd kunnen worden. Daarom is de opname van een statische 3D-vorm van een cel is veel eenvoudiger, omdat dit geen intravital metingen vereist en kan worden uitgevoerd op het verwijderde weefsel zo goed. Echter, het is van essentieel belang is om te bezitten analysetools waarmee de snelle en nauwkeurige beschrijving van de 3D-vormen en laat de diagnostische classificatie van gezonde en pathogene weefselsteekproeven uitsluitend gebaseerd op statische, vorm-gerelateerde informatie. Hier presenteren we een toolkit dat de discrete Fourier-onderdelen analyseert van de omtrek van een set van 2D projecties van de 3D-cel via Self-Organizing Maps oppervlakken. De toepassing van kunstmatige intelligentie methoden kunt ons kader om te leren over verschillende vormen van de cel, zoals deze wordt toegepast op steeds meer weefselsteekproeven, terwijl de werkstroom eenvoudig blijft.

Introduction

Tijdige, eenvoudige en nauwkeurige bepaling van de pathologische status van biologisch weefsel is van het hoogste belang in biomedisch onderzoek. Muismodellen bieden de middelen om te studeren een aantal pathologische aandoeningen, zoals immuun reacties of de ontwikkeling van kanker, in combinatie met complexe 3D en 4 D (3 ruimtelijke dimensies en tijd) microscopie technieken. Microscopie studies kunnen worden uitgevoerd via intravital of weggesneden-weefsel 2-foton microscopie, licht vel microscopie, en - tot een diepte van de beperkte weefsel van ongeveer 100 µm-door confocale microscopie. Om tijd-gerelateerde informatie over de werking van de cellen onder fysiologische of pathologische omstandigheden, is het nodig om te controleren van het weefsel voor een langere periode van tijd, die meestal intravital imaging^{1,2 vereist} . De toepasselijkheid van deze techniek is natuurlijk beperkt tot dierlijke modellen als gevolg van de invasiviteit. Niet-invasieve technieken zijn ook beschikbaar voor toepassing op de mens, met inbegrip van een verscheidenheid van methoden van tomografie (AUDIOOM, CT, enz.), maar deze methoden alle gebrek aan de noodzakelijke ruimtelijke- en vaak temporele resolutie te bestuderen van gedrag op cellulair niveau.

Statische informatie met betrekking tot het uiterlijk van cellen gemakkelijker toegankelijk kan zijn via verschillende 3D-imaging technieken uitgevoerd op weggesneden weefselmonsters. Hier het kinetisch gedrag van de cellen wordt niet gemeten, dus het is noodzakelijk vast te stellen nieuwe analysetechnieken die zijn in staat om te bepalen van de pathogene status van de behandelde cellen uitsluitend op basis van hun morfologie³. Een dergelijke aanpak werd gebruikt voor het koppelen van cel vormen en structuren van het weefsel tot pathologische gedrag^4,5,6.

In de nieuwe techniek die hier worden beschreven, de cellen worden gereconstrueerd als 3D oppervlakken en hun vormen zijn gekarakteriseerd via 3D-naar-2D projecties en^7,8van de analyse van de opeenvolgende Fourier gebaseerde periferie-vorm. Doordat de afmetingen van 3 naar 2, wordt het probleem vereenvoudigd. Het is ook mogelijk te karakteriseren van de oppervlakken van de cel in 3D door sferisch harmonischen analyse, toe te passen zoals het gebeurd is voor medische beelden⁹. Echter produkt sferisch harmonischen niet scherp en ruige vormen, vereisen een Multi-Scale raster worden vastgesteld op de eenheidsbol. Bovendien kan het aantal noodzakelijke sferisch harmonischen onderdelen worden groot (50-70), met de onderliggende berekeningen zeer veeleisend en de resultaten moeilijk te interpreteren van^10,11,12.

Met onze nieuw voorgestelde methode, wordt de taak gereduceerd tot een aantal beschrijvingen van 2D shapes, waarbij het nummer van de 2D projecties tot de analist en kan worden aangepast volgens de complexiteit van de 3D-vorm. De prognoses worden automatisch gegenereerd via een Python-script dat wordt uitgevoerd binnen een 3D animatie-tool. De 2D projecties worden beschreven door de discrete Fourier transformatie (DFT) componenten van hun periferie, berekend door een Fiji¹³ plugin die hier als onderdeel van onze softwarepakket. De DFT is hier toegepast om de complexe contouren van de cel in een reeks van functies sin en cos ontleden. Op deze manier kan we beschrijven de omtrek met een relatief klein aantal DFT onderdelen, waardoor de complexiteit van het probleem (voor verdere details zie vergelijkingen sectie). De DFT onderdelen komen in een opgeleide Self-Organizing kaart (SOM¹⁴), waar het bestaan van shape clusters objectief kunnen worden getest⁸. SOMs bieden een concurrerende en ongecontroleerde leermiddel uit het gebied van kunstmatige intelligentie. Ze bestaan uit een gekoppelde matrix van kunstmatige neuronen die met elkaar via een afstandsfunctie gewogen wijk communiceren. De neuronale systeem reageert op het eerste element van de input dataset en de neuronen waarvan reactie de sterkste is "gegroepeerd" dichter bij elkaar. Aangezien het neurale systeem meer en meer ingang krijgt, beginnen gegevens neuronen die herhaaldelijk sterk reageren goed gedefinieerde cluster binnen het systeem te vormen. Na een goede training op een grote dataset die 2D vorm in de vorm van een reeks DFT onderdelen bevat, van elke afzonderlijke cel DFT componenten de opgeleide SOM kunnen worden gebracht en onthullen of de cel waarschijnlijk tot de gezonde of pathogene cel behoort. We verwachten dat zulk hulpmiddel om een geweldige aanvulling op de methoden van wetenschappelijke en klinische diagnostiek.

Protocol

1. protocol eisen

1. High-resolution deconvolved driedimensionale (3D) microscopie gegevens deconvolved met inachtneming van het criterium van de Nyquist met een voorbeeldinterval ten minste tweemaal de hoogste ruimtelijke frequentie van het model te verkrijgen van een afbeelding met hoge resolutie verkrijgen.
2. Gebruik 3D-rendering software voor de wederopbouw van de oppervlakte en de uitvoer.
3. 3D animatiesoftware geschikt voor het uitvoeren van Python scripts gebruiken (de Python script kan worden gedownload van de github repository: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) 2D prognoses maken.
4. Fiji¹³ analyseren 2D projecties en uitpakken van de DFT-componenten gebruiken
   1. Gebruik de huidige verdeling van Fiji. Als er al een geïnstalleerde versie van Fiji, zorg ervoor dat de geïnstalleerde versie de laatste is. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het uitvoeren van de Help | Update optie.
   2. Gebruik de actieve Contour plugin¹⁵, die kan worden gedownload van http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start en moet worden gekopieerd naar de map plugins.
   3. Download de plugin van de schaduw Fiji van de github repository en de kopie in de map plugins.
5. Gebruik de software van de computationele wiskunde staat voor de berekening van Self-Organizing kaarten.

2. het reconstrueren van de 3D-afbeelding.

Opmerking: Voor testdoeleinden een voorbeeld dataset die worden verstrekt in de github repository (zie hierboven).

1. Start de 3D reconstructie software en open de 3D afbeeldingsgegevens.
2. Maak een 3D-oppervlak van (alle) / de object(en).
   1. Selecteer de optie 3D-weergave en klik op oppervlakken. Klik op de volgende knop (blauwe cirkel met een witte driehoek) om door te gaan met de surface creation wizard.
   2. Selecteer het kanaal van de afbeelding voor de oppervlakte wederopbouw.
   3. Toepassing een vloeiend functie om te voorkomen dat de poreuze oppervlakken.
      1. Kies een smoothing waarde die verbergt niet de details van het oppervlak, maar vermijdt poreuze oppervlakken.
   4. Selecteer een drempelmethode-methode voor het vinden van de oppervlakken.
      1. Gebruik een absolute intensiteit drempel wanneer de objecten goed gescheiden van de achtergrond worden en een ongeveer eenvormige helderheidsniveau hebben.
      2. Een lokaal contrast drempel van toepassing wanneer de objecten in hun intensiteit variëren, maar nog steeds kunnen worden gescheiden van de lokale achtergrond en van de andere objecten die hen omringen. Het zoekgebied van de lokale drempel volgens de waarde van de verwachte diameter van de gereconstrueerde objecten instellen
   5. Filteren van de gereconstrueerde oppervlakken volgens morfologische parameters van belang, bijvoorbeeld, volume, bolvorm, oppervlakte-naar-volumeverhouding, etc.en voltooi de oppervlakte wederopbouw.
3. Opslaan en exporteren van de gegenereerde oppervlakken in een indeling die compatibel is met de 3D animatiesoftware die zal worden gebruikt in de volgende stap.

3. transformeren de 3D gereconstrueerd oppervlakken in 2D projecties

1. Blender opstart en ga naar het tabblad uitvoer in het venster van de rechterkant. Selecteer de TIFF-indeling van het dropdownmenu en stel de kleurdiepte naar 8 bits RGBA.
2. Schakelen naar de modus Scripting en open het meegeleverde scriptbestand "GUI_AutoRotate.py" uit de bibliotheek voorzien van dit werk (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
3. Klik op het Script uitvoert. Kies de map met de bestanden van de wrl desgevraagd voor input.
4. Maak indien nodig meer rotaties wanneer u werkt met meer complexe oppervlakken: Ga naar de GUI en het vak rotaties ingesteld op een waarde van meer dan 6.
   Opmerking: Een rotatie van 6 verschillende hoeken kan worden volstaan met het onderscheiden van de andere cel populaties. Het is niet aanbevolen om het maken van minder dan zes rotaties per oppervlak, vanwege mogelijke gegevens verloren gaan.
5. Het script uitvoeren door te klikken op de knop draaien in de GUI. Sla de projecties van de afzonderlijke oppervlakken in dezelfde map die werd gebruikt als de invoer map (stap 2.3). De afbeeldingen worden standaard opgeslagen in een 8 bit Tiff formaat (zie stap 2.1), die de gewenste indeling van de Fiji-plugin schaduw is.

4. vind de periferie en het berekenen van de Fourier-onderdelen met behulp van Fiji.

1. Fiji open en selecteer schaduw in het Plugins menu. Start met de standaardwaarden en later fine-tunen van de parameters. Klik op OK als u klaar bent om het programma te gebruiken.
   1. Kies een Kleurovergang drempelwaarde voor de drempelwaarde van de invoerafbeelding.
   2. Kies het aantal iteraties. Hoe hoger de waarde van het Getal van iteraties , hoe preciezer de wederopbouw van de periferie. Voor eenvoudiger vormen is een lager nummer meestal voldoende.
   3. Gebruik de Nummer van de Dilations -parameter om te bepalen hoeveel groter de startende masker wordt vergeleken met de werkelijke cel. Meer complexe vormen hoeft meestal meer dilatatie stappen voor het vinden van de juiste periferie.
   4. Vink het Donkere achtergrond als de verwachte vormen helderder dan de achtergrond.
   5. Activeer het aankruisvak ' Toon tussentijdse resultaten in alleen wanneer een kleine test dataset gebruikt om te bepalen van de prestaties van de schaduw. Het activeren van deze optie voor grotere datasets verlaagt de computationele efficiëntie en eventueel een systeem met lage videogeheugen kan stoppen.
   6. Vink het Resultaat tabellen opslaan als u wilt de resultaten van de schaduw gebruiken als input voor stap 5. Als het selectievakje is ingeschakeld, worden alle resultaten worden opgeslagen in afzonderlijke CSV-bestanden. Een samenvatting van de uitvoergegevens wordt altijd gegenereerd in een bestand genaamd "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
2. Selecteer de invoergegevens-map waarin de TIFF-bestanden die zijn gemaakt in stap 3.
3. Bieden de uitvoermap van de gegevens.
4. Klik op OK om te beginnen met de plugin.

5. zelf-organiserende kaarten

Opmerking: SOM netwerken kunnen alleen gegevens classificeren wanneer ze zijn opgeleid op een grote dataset waarin de inbreng van alle verwachte celtypes en voorwaarden. Voor demonstratie-doeleinden, dergelijke een dataset wordt verstrekt en kan worden gevonden in onze opslagplaats ("AllCells_summary_normalised.csv" van https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

1. Volg de onderstaande richtlijnen als er geen opgeleide SOM beschikbaar is nog voor de invoergegevens; Ga anders verder met stap 5.2.
   1. Start een computationele integreren, wiskundige software staat uit te voeren van de neurale netwerk classificaties.
   2. Selecteer een gegevensbestand moet worden gebruikt voor de opleiding van de SOM-netwerk. Deze dataset moet bevatten alle proefomstandigheden om het trainen van de SOM op de bijzondere celtypes en experimentele omstandigheden.
      Opmerking: Het is ook mogelijk om het gebruik van de meegeleverde AllCells_summary_normalised.csv voor het testen van het systeem.
   3. Start van de opleiding en wachten tot de opleiding is voltooid voordat u verdergaat. Standaard, is het script ingesteld op het uitvoeren van 2000 iteraties ("tijdperken").
      Opmerking: Het aantal iteraties hangt af van het tarief leren van de SOM. Afhankelijk van de invoergegevens is het raadzaam om te testen zowel hogere als lagere aantal tijdperken en observeren van de stabiliteit van het patroon van de SOM. Bij het gebruik van het script dat wordt geleverd, kan het aantal iteraties onder lijn 32 worden gewijzigd. De grootte van het netwerk kan worden gewijzigd in regel 34 (standaard die is ingesteld op 12 van de 12).
   4. Na de opleiding is voltooid, onderzoeken de topologie van het netwerk (buurman afstanden, input vliegtuigen, monster hits, enz.). Het netwerk is nu getraind en kan worden opgeslagen voor toekomstig gebruik.
2. Laden in de SOM, bij het gebruik van een reeds opgeleide kaart (dit kan komen stap 5.1 of vanuit andere bronnen) om het cluster van een dataset.
   1. Importeer het CSV-bestand dat moet worden getest met de voorgeladen opgeleide SOM. Selecteer het CSV-uitgang van de schaduw-Plugin uit stap 4 bij het gebruik van gegevens die zijn opgesteld door de schaduw plugin.
      Opmerking: Het is ook mogelijk om de voorbeeld gegevensbestanden "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" of "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv" die worden geleverd via github te gebruiken.
   2. Nadat de indeling is voltooid, de resultaten van de SOM zoals in stap 5.1.5 evalueren.
      1. Onderzoeken van de hitmap die zijn gegenereerd uit het CSV-bestand. Elke cel van de kaart wordt aangegeven hoe vaak de dataset "hits" dat bepaalde cel van de opgeleide SOM. Wanneer een groep cellen die zijn gegroepeerd in een klein gebied van deze kaart, dit geeft aan dat de dataset vrij homogene. Meerdere clusters zal aangeven dat subgroepen waarschijnlijk bestaan in de dataset.
      2. Onderzoeken de buurt gewicht afstanden. Gebieden van deze kaart, die zijn goed gescheiden overeen met groepen van objecten die heel anders dan de SOM van oogpunt gedraagt. Met DFT componenten als invoergegevens betekent dit dat deze cel groepen zeer uiteenlopende vormen van de bijbehorende 3D oppervlakken hebben.
      3. Onderzoeken de gewicht-vliegtuigen voor informatie over de bijdrage van elk element van de functie vector. In het geval van het gebruik van de 20 DFT-componenten zoals eerder beschreven, wordt 19 kaarten hier weergegeven. Bij het gebruik van de dataset gegeven voorbeeld, de eerste 5 of 6 gewicht vliegtuigen zullen afwijken, maar de rest van hen vrij gelijkaardig zal verschijnen. In dit geval geconcludeerd kan worden dat het zou volstaan om ongeveer 7 DFT-componenten gebruiken.

Representative Results

We een DFT voor het berekenen van de belangrijkste onderdelen van de shape overeenkomt met de prognoses van de cel toegepast. De Fourier-descriptors werden verkregen door het toepassen van de DFT-algoritme op de xy-coördinaat paren van de ingerichte periferie van de projecties van de cel, verkregen als de uitvoer van het AbSnake deel van onze workflow. Deze xycoordinate paren kunnen worden behandeld als een complex-gewaardeerde 2D vector "g":

Van de vector "g", we DFT gebruiken voor het berekenen van het complex-gewaardeerde Fourier spectrum:

Op basis van bekende formules van de discrete Fourier-spectrum, en het gebruik van de etikettering van de complex-getal van "g" als:

Krijgen we:
(1)
Kunnen we berekenen de echte ("A") en imaginaire ("B") onderdelen van :
(2)
(3)
Hier, de eerste DFT onderdeel G₀ komt overeen met m = 0, waardoor:
(4)
(5)
Daarom wordt dit onderdeel beschreven het geometrische middelpunt van het oorspronkelijke object.
Het tweede element van de DFT voorwaartse spectrum, G₁, correspondeert met m = 1:

(6)

Uit Eq.6 we concluderen dat deze punten een cirkel met een straal van vormen en beginhoek , waarin de cirkel beschrijft een complete revolutie terwijl de shape is eenmaal opgespoord. Het midden van de cirkel bevindt zich op de oorsprong (0, 0), de straal is | G₁| en het uitgangspunt is:

(7)

In het algemeen, voor een enkele Fourier-coëfficiënt , de coördinaten worden beschreven als:

(8)

Op dezelfde manier aan Eq.6, Eq.8 ook beschrijft een cirkel, maar met een straal van R_m= | G_m|, een beginhoek en een uitgangspunt bij , waar de contour eenmaal is getraceerd terwijl de cirkel tot en met "m" volledige banen^{16,17 loopt}.

Vorm parameters als SOM input
De workflow, zoals beschreven in Figuur 1, werd toegepast op een deconvolved (met behulp van een gemeten punt verspreiden functie) intravital multi foton microscopie dataset van microglial cellen te karakteriseren van hun morfologische veranderingen in gezond of kanker corticale weefsel¹⁸. Twintig DFT onderdelen werden berekend voor elk 2D-projectie van de gereconstrueerde 3D oppervlakken en de resultaten werden gebruikt als input voor de SOM-training. Onder fysiologische omstandigheden, de microglia presenteerde een nogal complexe shape met meerdere, sterk vertakt processen (Figuur 2a). Wanneer geplaatst in een kanker omgeving (corticale tumor model), de microglia veranderd naar een eenvoudiger, meer spindel-achtige vorm (Figuur 2b).

De opgeleide SOM werd getest teneinde haar vermogen om te onderscheiden tussen gezonde en kanker cellen. De gezonde cel bevolking werd geprojecteerd op een gemeenschappelijke ruimte voor de SOM (Figuur 2 c). De SOM gereageerd op de kanker microglia dataset met een halter-vormige actieve gebied (figuur 2d). Een blindelings gemengde invoer gegevensset die bestond van DFT vorm componenten van zowel de gezonde als de kanker groep werd geprojecteerd door de SOM in twee verschillende groepen, terwijl de vorm van hun individuele contouren vergelijkbaar zijn met die van de gescheiden groepen ( houden Figuur 2e; Vergelijk met 2 c en 2d). Geconcludeerd kan worden dat de gemengde dataset succesvol was geclusterd door de SOM.

De prestaties van de SOM die we getest door het vergelijken van de prognoses met de handmatige analyse van dezelfde gegevens door een medisch deskundige, die ingedeeld op basis van hun spatio-temporele gedrag dataset. De deskundige geïdentificeerd vier afzonderlijke cel groepen (rustende cellen, phagocytosing cellen, interagerende cellen en mobiele cellen¹⁸), die werden gereconstrueerd en gebruikt om te trainen op een 12 x 12 SOM. De opgeleide netwerk (Figuur 3a) toont groepen van hoge hit-waarde kunstmatige neuronen, met name in de bodem verlaten en de middelste gebieden van de SOM. De reactie van de opgeleide netwerk werd ook getest met vier willekeurig geselecteerde deelverzamelingen (die geen deel uitmaakten van de dataset van opleiding) van beelden uit de vier verschillende groepen geïdentificeerd door de deskundige¹⁸. Deze afbeelding deelverzamelingen resulteerde in vier welomschreven reacties door de SOM, zoals in Figuur 3b. De rustende cellen vertonen de meest complexe vorm en toonde het hoogste niveau van de scheiding binnen het neurale netwerk (Figuur 3b "rusten" paneel). De andere drie geïdentificeerde celtypes gedeeld van een gemeenschappelijke ruimte van de SOM op de bodem verlaten hoek, maar anders waren gescheiden door de SOM. De bodem verlaten hoek SOM gebied dus overeenkomt met de waarden van de DFT lager-index.

De robuustheid van de aanpak van de SOM werd getest met behulp van de opgeleide SOM met drie willekeurige deelverzamelingen van hetzelfde - rust - cell type (geen deel uitmaakt van de dataset van opleiding). Het antwoord van de SOM op deze ingang vertoont een zeer gelijkaardige reactie (Figuur 3 c, deelverzamelingen 1-3), demonstreren de robuustheid van onze aanpak.

Tijd-afhankelijke cel vorm wijzigingen worden juist gekenmerkt door DFT
Om te onderzoeken van het effect van wijzigingen van de tijd-afhankelijke van de cel vorm op de DFT-onderdelen, werden één tot drie cellen per subgroep (Zie Figuur 3b) bijgehouden voor 13 tot en met 28 tijd punten. Figuur 4 ziet u de eerste tien DFT onderdelen van een mobiele cel (figuur 4a) en een interactie cel (figuur 4b), die werden uitgezet als functie van de tijd. De mobiele cel vertoont een permanent veranderen vorm (Zie aanvullende Video 4 in ⁸), die wordt weerspiegeld door een ruwer oppervlak van DFT. Het barst van de amplitude van de DFT in het eerste derde van het tijdsverloop voor de interactie cel samenvallen met de snelle en enorme cel vorm wijzigingen zoals aanvullende Video 5 in ⁸.

Het tijdsverloop van alle 19 DFT onderdelen werd ook gekenmerkt voor deze twee cellen op drie verschillende tijdstippen tijdens het volgen van een mobiele cel (figuur 5a) en van een interactie cel (Figuur 5b). De Loodrechte assen vertegenwoordigen hierbij de zes rotatiehoeken en aangeven dat alle prognoses even belangrijk voor de karakterisatie van de shape voor beide soorten cellen zijn.

Figuur 1. Stap voor stap de workflow van de verwerking van de gegevens te identificeren cel clustering gebaseerd op de vorm van de cellen. Oppervlakken gereconstrueerd in 3D werden gebruikt als invoer voor Blender voor automatische 3D-naar-2D projecties. De rand van elke projectie bevond en de DFT-onderdelen werden berekend. De onderdelen gediend als een input ofwel een opgeleide SOM in Matlab, of om te trainen een nieuwe SOM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Typische uitstraling van muis corticale microglia cellen onder controlevoorwaarden (a) en in kanker weefsel (b) Screenshots van gereconstrueerde microglia oppervlakken. SOM projecties werden gemaakt op basis van de drie groepen van microglia monsters van de cortex van de muis: controle (niet-tumorous) cellen (c), tumorcellen (d) en een gemengde bevolking van cellen (e). Dit cijfer is aangepast met toestemming⁸. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. (a, links) Zelf-organiserende kaart van een muis microglia dataset bestaande uit 768 input functie vectoren. De dataset werd gebruikt om de trein een kunstmatig neuraal netwerk 12 x 12, met zeshoekige wijk geometrie, willekeurige initialisatie en 2000 tijdperken. (a, rechts) De overeenkomstige SOM ingang vliegtuigen van de eerste 10 DFT-componenten (b) de reacties van de SOM die is afgebeeld in (a), tot één willekeurige VRML bestand subset elke van de vier celtypes "mobiele," "interactie," "rust" en "fagocytische" als eerste beschreven in Figuur 5 van Bayerl et al. ¹⁸. (c) de reactie van de dezelfde SOM zoals in (a, links) aan drie willekeurige deelverzamelingen van de gehele dataset (die dus geen deel uitmaakten van de dataset van opleiding) van de "rustende cellen"-type 3D oppervlakken. De gelijkenis tussen de drie antwoorden is opmerkelijk. Dit cijfer is aangepast met toestemming⁸. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. (a) tijdafhankelijkheid van de eerste 10 DFT onderdelen tijdens een intravital imaging experiment van muis microglia. Dit paneel toont gegevens voor een cel van het type "Mobiele cellen". De x-as komt overeen met tijdstippen van het experiment bij 60 s tijd resolutie, de y-as toont de amplitude van de DFT-componenten in willekeurige eenheden (a.u.), terwijl de z-as komt met de DFT component van 1 tot 10 overeen. (b) Typ het volgende als in (a) maar voor een cel van de "interactie cellen". Dit cijfer is aangepast met toestemming⁸. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5. (a) het gedrag van alle 19 DFT componenten van een cel van het type "Mobiele cellen" aan het begin, in het midden en aan het einde van het experiment. De nummers op de x-as komen overeen met de DFT onderdeel-ID van 1 tot en met 19. De y-as toont de DFT component amplitude in willekeurige eenheden (a.u.), terwijl de z-as markeert de zes hoeken van willekeurige rotatie. (b) gelijk aan (a) maar voor een cel van de "interactie cellen" typt. Dit cijfer is aangepast met toestemming⁸. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De identificatie van potentieel pathologische condities met behulp van kleine, intact weefselsteekproeven is van groot belang. Dergelijke technieken zal zorgen voor een tijdige reactie op infectieziekten en agressieve vormen van kanker. De kinetische en morfologische antwoorden van diverse immuuncellen, bijvoorbeeld microglia en macrofagen, zijn kenmerkend voor de immuunrespons van het lichaam. Hoewel in de meeste gevallen het niet is praktisch of zelfs mogelijk om te controleren het kinetisch gedrag van deze cellen, is het vrij eenvoudig te verwerven van 3-dimensionale afbeeldingen om op te halen van hun vorm. Typisch, immune cellen veronderstellen een complexe shape in gezond weefsel en een veel eenvoudiger vorm onder ontstoken of kanker voorwaarden¹⁸. Terwijl de tijd-afhankelijke kenmerken van dergelijke vormverandering aan ons begrip van de ontwikkeling van de immuunrespons toevoegen zou, kan met behulp van alleen de 3D-vorm van een representatieve groep van cellen ook worden volstaat het te bepalen van de aard van de gezonde of pathologische van het weefsel.

Karakterisering van het 3-dimensionale oppervlak van een cel is niet een eenvoudige taak. De toepassing van de sferisch harmonischen is een manier om een 3D-oppervlak met een relatief groot aantal (50-70) componenten^11,12te vertegenwoordigen. Bovendien bepalen de sferisch harmonischen is computationeel duur; projecteren van de zeer complexe vormen op de eenheidsbol is onmogelijk of zeer moeilijk te wijten aan de noodzaak om meerdere rasters van verschillende fijnheid van toepassing op de eenheidsbol; Ten slotte, de zinvolle interpretatie van de spectra van de sferisch harmonischen componenten is verre van triviaal.

In ons werk hier gepresenteerd, vervangen we de moeilijke taak direct 3D oppervlakteanalyse door het veel eenvoudiger aanpak van het gebruik van 2D prognoses van het oorspronkelijke oppervlak om voldoende morfologische informatie ter identificatie van de pathologische omstandigheden te verkrijgen. We elke stap van deze workflow aangetoond met behulp van 3D microscopie gegevens uit myeloïde cellen, terwijl duidelijk erop te wijzen dat alle stappen waren eenvoudig te voltooien en de resulterende 2-dimensionale kaarten waren gemakkelijk te interpreteren.

Natuurlijk, een 3D-naar-2D-projectie zal leiden tot verlies van de informatie over de structuur van het oppervlak. In onze dataset voorbeeld van microglia in een muismodel van de corticale tumor was het genoeg om zes hoeken gebruiken bij het maken van de 2D projecties. Meer complexe vormen of minder prominente morfologische veranderingen kunnen evenwel eisen dat een groter aantal projecties worden gemaakt teneinde zitten kundig voor betrouwbaar identificeren cel subgroepen met de SOM. Om deze reden is onze aanpak bedoeld om genereren en analyseren van een willekeurig aantal projecties te kunnen. Gewoon door te kiezen voor een hoger aantal projecties voor meer complexe vormen, is het mogelijk op de schaal van het gegevensverlies tot een aanvaardbaar minimum te beperken. Als voorbeeld, zou de interactie celtype in figuur 4a en 4b een groter aantal projecties vereisen om het complex oppervlak goed vertegenwoordigen.

Iedere benaderende methode moest de hierbij voorgestelde workflow worden getoetst aan de resultaten van een handmatige classificatieproces microglia¹⁸. De resultaten eerder bevestigde de betrouwbaarheid van de geautomatiseerde workflow. Bovendien is de werkstroom meer tijd efficiënt in vergelijking met conventionele analyse. De medisch deskundige die de cellen microglia handmatig ingedeeld nodig ongeveer 4 weken voor zijn analyse van de dataset, terwijl onze workflow nodig slechts ongeveer 1 dag. De robuustheid van onze benadering werd ook duidelijk bewezen door de reproduceerbaarheid van de opgeleide SOM tot een subset van de gegevens die behoorde tot de dezelfde celtype maar werd niet gebruikt om te trainen de SOM, zoals in Figuur 3 cweergeven.

Hoewel onze benadering niet kinetische informatie achtte, onderzochten we het effect van de tijdsinstelling op de DFT gebaseerde vorm analyse. Het duidelijkste voorbeeld voor tijdafhankelijke gedrag werd gevonden onder de mobiele celpopulatie, waar de bijdrage van de hogere geïndexeerde DFT onderdelen was duidelijk waarneembare, zoals in figuur 4a. Dit vestigt de aandacht op het belang van het gebruik van een groot genoeg aantal DFT onderdelen omgang met celtypes die dreigen te gedragen in een zeer tijd-afhankelijke manier. Als gevolg van de geautomatiseerde aard en hoge bewerkingssnelheid voor onze softwaretools, zal het toegenomen aantal DFT componenten en prognoses toenemen de precisie en de betrouwbaarheid van de resultaten, terwijl ze niet aanmerkelijk de computationele prestaties hinderen zal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaris 9.1.2, software	Bitplane, Zürich, Switzerland	v.9.1.2	3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software	https://www.blender.org/	v.2.75a	3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software	https://fiji.sc/	ImageJ v.1.52b	Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE	https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis	v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour	http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start	absnake2
Computer	Any	NA	See Imaris instructions for minimum computer requirements