Här, tillhandahåller vi ett arbetsflöde som möjliggör identifiering av friska och sjukliga celler baserat på deras 3-dimensionell form. Vi beskriver processen för att använda 2D projektion konturer baserat på de 3D-ytorna för att utbilda en självorganiserande karta som kommer att ge objektiva klustring av de undersökta cellpopulationer.
Utseende och förehavanden av immunceller drivs av sin omgivning. Som en reaktion på en patogen invasion, immuncellerna rekryteras till platsen för inflammation och aktiveras för att förhindra en ytterligare fördelning av invasionen. Detta avspeglas också av förändringar i beteendet och immuncellerna morfologiska utseende. I cancervävnaden, liknande morphokinetic förändringar har observerats i beteendet hos mikrogliaceller: intra-tumoral mikroglia har mindre komplexa 3-dimensionella figurer, med mindre förgrenade cellulära processer, och flytta snabbare än i friska vävnad. Prövningen av sådana morphokinetic egenskaper kräver komplexa 3D mikroskopi tekniker, som kan vara mycket utmanande när utförat longitudinellt. Registrering av en statisk 3D form i en cell är därför mycket enklare, eftersom detta kräver inte intravital mätningar och kan utföras på exciderad vävnad samt. Men det är viktigt att inneha analysverktyg som gör den snabb och exakt beskrivningen av de 3D-formerna och tillåter diagnostisk klassificering av friska och patogena vävnadsprover baserade enbart på statiska, form-relaterad information. Här presenterar vi en verktygslåda som analyserar de diskreta Fourier komponenterna av konturerna av en uppsättning 2D projektioner av 3D cellen ytbehandlar via självorganiserande kartor. Användning av artificiell intelligens metoder tillåter vårt ramverk att lära sig om olika cell former som den tillämpas på fler och fler vävnadsprover, medan arbetsflödet är enkelt.
Snabb, enkel och exakt fastställande av patologiskt status av biologisk vävnad är av högsta intresse inom biomedicinsk forskning. Mus-modeller ger möjlighet att studera en rad sjukdomstillstånd, till exempel immunreaktioner eller cancerutveckling, i kombination med komplexa 3D och 4 D (3 rumsliga dimensioner och tid) mikroskopi tekniker. Mikroskopi studier kan vara utförs via intravital eller exciderad vävnad 2-foton mikroskopi, ljus ark mikroskopi, och – begränsad vävnad djup av cirka 100 µm-av konfokalmikroskopi. Att har tid-relaterad information om cellernas beteende under fysiologiska eller patologiska förhållanden, är det nödvändigt att övervaka vävnaden under en längre tid, vilket oftast kräver intravital imaging1,2 . Tillämpligheten av denna teknik är naturligtvis begränsad till djurmodeller på grund av dess invasivt. Icke-invasiva tekniker finns också för användning på människor, inklusive en mängd tomografi metoder (MSOT, CT, etc.), men dessa metoder alla saknar nödvändigt rumsliga- och ofta temporal upplösning att studera beteende på cellnivå.
Statisk information om utseendet av celler kan nås enkelt via olika 3D avbildningstekniker avrättades den censurerade vävnadsprover. Här, den kinetiska beteenden av cellerna mäts inte, därför är det nödvändigt att anta nya analysmetoder som kan avgöra patogena status för de undersökta celler baserat enbart på deras morfologi3. Ett sådant tillvägagångssätt användes att länka cell former och vävnad texturer till patologiskt beteende4,5,6.
I den nya teknik som beskrivs här, cellerna rekonstrueras som 3D-ytor och deras former är karakteriserade via 3D-att-2D prognoser och successiva Fourier-baserade periferi-form analys7,8. Genom att minska dimensioner från 3 till 2, är problemet förenklad. Det är också möjligt att karaktärisera den cell ytbehandlar i 3D genom att tillämpa sfäriska övertoner analys, som det har gjorts för medicinska bilder9. Dock hanterar sfäriska övertoner inte skarpa och robusta former väl, som kräver ett flerskalig rutnät fastställas på området för enheten. Dessutom antalet nödvändiga sfäriska övertoner komponenter kan vara stort (50-70), med underliggande beräkningarna mycket krävande och resultaten svåra att tolka10,11,12.
Med vår nyligen föreslagna metod förminskas uppgiften till en serie 2D form beskrivningar, där antalet 2D projektionerna är upp till analytikern och kan justeras enligt komplexiteten i 3D formen. Prognoserna genereras automatiskt via ett Python-skript som körs inuti en 3D animation verktyg. 2D prognoserna beskrivs av Diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deras periferi, beräknas av en Fiji13 plugin som tillhandahålls här som en del av våra programpaket. DFT används här för att bryta ner komplexa konturerna av cellen till en serie av synd och cos funktioner. På detta sätt kan vi beskriva konturerna med ett relativt litet antal DFT komponenter, vilket minskar komplexiteten av problemet (för ytterligare detaljer se ekvationer avsnitt). DFT komponenter sätts i en utbildad självorganiserande karta (SOM14), där förekomsten av formen kluster kan vara objektivt testade8. SOMs ge ett konkurrenskraftigt och oövervakade läromedel från fältet av artificiell intelligens. De består av en länkad rad konstgjorda nervceller som kommunicerar med varandra via en vägda stadsdelen avstånd funktion. Neuronala systemet svarar på det första elementet i den ingående datamängden och nervceller vars svar är den starkaste ”grupperas” närmare varandra. Som neurala systemet tar emot mer ingång, börja data nervceller som upprepade gånger reagerar starkt bilda väldefinierade kluster inom systemet. Efter lämplig träning på en stor datamängd som innehåller 2D form i form av en uppsättning DFT komponenter, alla enskilda cellens DFT komponenter kan sättas i utbildad SOM och avslöja huruvida cellen sannolikt hör till de friska eller gruppen patogena cell. Vi förväntar oss sådant verktyg att bli ett bra komplement till metoderna för vetenskaplig och klinisk diagnostik.
Identifiering av potentiellt sjukdomstillstånd med hjälp av små, intakt vävnadsprover är av hög betydelse. Sådana metoder kommer att garantera ett snabbt svar på infektionssjukdomar och aggressiva typer av cancer. Kinetiska och morfologiska Svaren olika immunceller, t.ex. mikroglia och makrofager, är karakteristiska för immunförsvaret av kroppen. Även i de flesta fall inte är det praktiskt eller ens möjligt att övervaka dessa celler kinetiska beteende, är det ganska enkelt att förvärva 3-dimensionella bilder för att hämta sin form. Typiskt, immunceller anta en komplex form i frisk vävnad och en enklare form under inflammerad eller cancerogena förhållanden18. Medan sådana formförändringen tidsberoende egenskaper skulle lägga till vår förståelse av utvecklingen av immunförsvaret, kan använder bara 3D formen av en representativ grupp av celler också vara tillräcklig för att bestämma den friska eller patologiska naturen av vävnad.
Kännetecknar en cell 3-dimensionell yta är inte en enkel uppgift. Tillämpningen av sfäriska övertoner är ett sätt att representera en 3D-yta med ett relativt stort antal (50-70) komponenter11,12. Att bestämma den sfäriska övertoner är dessutom beräkningsmässigt kostsamt. projicera mycket komplexa former på området för enheten är omöjligt eller mycket svårt på grund av behovet av att tillämpa flera nät av olika finhet på området för enheten. Slutligen, meningsfulla tolkningen av spektra av sfäriska övertoner komponenter är långtifrån trivial.
I vårt arbete som presenteras här, ersätter vi den svåra uppgiften att direkt 3D ytanalys med den mycket enklare metoden att använda 2D projektioner av den ursprungliga ytan för att få tillräcklig morfologisk information för att identifiera patologiska förhållanden. Vi visade varje steg i arbetsflödet med hjälp av 3D mikroskopi data från myeloida celler, medan tydligt påpeka att alla steg var enkla att slutföra och de resulterande 2-dimensionella kartorna var lätta att tolka.
Naturligtvis, en 3D-att-2D-projektion kommer att leda till förlust av information om strukturen på ytan. I vårt exempel dataset av mikroglia i en musmodell kortikala tumör var det nog att använda sex vinklar när du skapar 2D prognoserna. Mer komplexa former eller mindre framträdande morfologiska förändringar kan dock kräva att ett större antal projektioner är skapade för att kunna tillförlitligt identifiera cell undergrupper med SOM. Av denna anledning, är vår metod utformad för att kunna generera och analysera valfritt antal projektioner. Bara genom att välja ett högre antal projektioner för mer komplexa former, är det möjligt att skala förlusten av information till en acceptabel minimum. Som ett exempel, skulle den samverkande Celltypen i figur 4a och 4b kräva ett större antal projektioner för att representera komplexa ytan ordentligt.
Som någon ungefärlig metod hade härmed föreslagna arbetsflödet ska testas mot resultaten av en manuell klassificeringsprocessen av mikroglia18. De resultat som presenteras tidigare bekräftade tillförlitligheten i den automatiserat arbetsflöden. Arbetsflödet är dessutom mer tidseffektivt jämfört med konventionella analys. Den medicinska expert som klassificeras mikroglia celler manuellt behövs cirka 4 veckor för hans analys av datamängden, medan vårt arbetsflöde behövs endast cirka 1 dag. Robustheten av vårt tillvägagångssätt bevisades också tydligt av reproducerbarheten för utbildade SOM till en delmängd av data som hörde till samma celltyp men användes inte att träna SOM, som visas i figur 3 c.
Trots att vår inställning inte ansåg kinetiska information, undersökte vi effekten av timing på DFT-baserade form analys. Det mest typiska exemplet för tidsberoende beteende hittades bland mobila cell befolkningen, där bidraget från högre indexerade DFT komponenter var tydligt observerbara, som i figur 4a. Detta kräver uppmärksamhet på vikten av att utnyttja ett tillräckligt högt antal DFT komponenter när man arbetar med celltyper som sannolikt kommer att uppträda på ett sätt som mycket tidsberoende. Tack vare automatiserade natur och hög exekveringshastighet av våra verktyg, kommer att det ökade antalet DFT komponenter och prognoser öka noggrannheten och tillförlitligheten av resultaten, medan de påtagligt inte kommer att hindra den computational prestandan.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Benjamin Krause för den givande diskussionen och hans stöd. Författarna ytterligare tackar Robert Günther för hans hjälp med den levande cellen mikroskopi.
Arbetet stöddes av det finansiella stödet som DFG NI1167/3-1 (JIMI) till R.N. och Z.C., DFG finansiella stöd CRC 1278 PolyTarget projektet Z01 för Z.C., C01 i TRR130 till R.N. och SFB633, TRR130, Exc257 till Augustus och J.B.S. BFREN gett intramurala stöd SFP1322-642 för F.L.K och A.L.
Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start | absnake2 | |
Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |