Her, leverer vi en arbejdsproces, der tillader identifikation af sunde og patologiske celler baseret på deres 3-dimensionelle form. Vi beskriver processen med at bruge 2D projektion konturer baseret på 3D overflader til at træne en selvorganiserende kort, der vil give objektive klynger af de undersøgte cellepopulationer.
Udseendet og bevægelser af immunceller er drevet af deres miljø. Som en reaktion på en patogen invasion, immunceller rekrutteres til stedet for betændelse og aktiveres for at forhindre en yderligere spredning af invasionen. Dette afspejles også af ændringer i adfærd og morfologiske udseendet af immunceller. I cancervævet, observeret lignende morphokinetic ændringer i opførsel af microglial celler: samhandel tumorsygdomme mikroglia har mindre komplekse 3-dimensionelle figurer, at have mindre-forgrenede cellulære processer, og bevæge sig hurtigere end i sund væv. Undersøgelse af sådanne morphokinetic egenskaber kræver komplekse 3D mikroskopi-teknikker, som kan være ekstremt udfordrende, når henrettet på langs. Derfor, registrering af en statisk 3D figur af en celle er meget enklere, fordi dette kræver ikke intravital målinger og kan udføres på skåret væv så godt. Men det er vigtigt at besidde analyseværktøjer, der giver mulighed for hurtig og præcis beskrivelse af 3D-figurer og tillader diagnostiske klassificering af sunde og patogene vævsprøver baseret udelukkende på statisk, figur-relaterede oplysninger. Vi præsenterer her, en værktøjskasse, der analyserer de diskrete Fourier komponenter af omridset af et sæt af 2D fremskrivninger af 3D celle overflader via selvorganiserende Maps. Anvendelsen af kunstig intelligens metoder tillader vores rammer til at lære om forskellige celle figurer som det anvendes til flere og flere vævsprøver, mens arbejdsprocessen er enkel.
Rettidig, enkel og præcis bestemmelse af patologiske status af biologisk væv er den højeste interesse for biomedicinsk forskning. Musemodeller giver mulighed for at studere en række patologiske tilstande, såsom immun reaktioner eller udviklingen af kræft, i kombination med komplekse 3D og 4 D (3 rumlige dimensioner og tid) mikroskopi-teknikker. Mikroskopi undersøgelser kan udføres via intravital eller skåret ud væv 2-foton mikroskopi, lys-ark mikroskopi, og – at en begrænset væv dybde af omtrent 100 µm-af Konfokal mikroskopi. For at have tidsrelaterede oplysninger om celler opførsel under fysiologiske eller patologiske betingelser, er det nødvendigt at overvåge væv for en længere periode, som normalt kræver intravital billeddannelse1,2 . Anvendeligheden af denne teknik er naturligvis begrænset til dyremodeller på grund af dens invasionsevne. Ikke-invasive teknikker er også tilgængelige til anvendelse på mennesker, herunder en række tomografi metoder (MSOT, CT, osv.), men disse metoder alle mangler de nødvendige rumlige- og ofte tidsmæssige opløsning til at studere adfærd på cellulært niveau.
Statiske oplysninger om forekomsten af celler kan være tilgængelige lettere via forskellige 3D imaging teknikker henrettet på skåret ud vævsprøver. Her, kinetic opførsel af cellerne er ikke målt, derfor er det nødvendigt at vedtage nye analyseteknikker, der er i stand til at bestemme den patogene status af de undersøgte celler baseret udelukkende på deres morfologi3. En sådan fremgangsmåde blev brugt til at knytte celle figurer og væv teksturer til patologisk adfærd4,5,6.
I den nye teknik beskrevet her, cellerne er rekonstrueret som 3D overflader og deres figurer er karakteriseret via 3D til 2D fremskrivninger og successive Fourier-baserede periferien-figur analyse7,8. Ved at reducere dimensioner fra 3 til 2, er problemet forenklet. Det er også muligt at karakterisere celle overflader i 3D ved at anvende sfærisk harmoniske analyse, som det er blevet gjort til medicinske billeder9. Dog kan sfærisk harmoniske ikke håndtere skarpe og robust figurer godt, der kræver et multi-skala gitter til at blive etableret på enhed sfære. Desuden antallet af nødvendige sfærisk harmoniske komponenter kan blive store (50-70), med de underliggende beregninger meget krævende og svært at fortolke10,11,12resultater.
Med vores nyligt foreslåede metode, er opgaven reduceret til en serie af 2D figur beskrivelser, hvor antallet af de 2D fremskrivninger er op til analytikeren og kan reguleres efter kompleksiteten af den 3D form. Fremskrivningerne genereres automatisk via et Python-script, der kører inde i en 3D-animation værktøj. De 2D fremskrivninger er beskrevet af de Diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deres periferi, beregnet ved et Fiji13 plugin, der er fastsat her som en del af vores softwarepakke. DFT anvendes her for at nedbryde komplekse omridset af cellen til en serie af synd og cos funktioner. På denne måde, kan vi beskrive kontur med et relativt lille antal DFT komponenter, hvilket reducerer kompleksiteten af problemet (for yderligere oplysninger se ligninger afsnit). DFT komponenter er sat i en uddannet selvorganiserende kort (SOM14), hvor eksistensen af figur klynger kan være objektivt testet8. SOMs yde en konkurrencedygtig og ukontrollerede læringsredskab fra inden for kunstig intelligens. De består af en sammenkædet række kunstige neuroner, som kommunikerer med hinanden via en vægtet kvarter afstand funktion. Neuronal systemet reagerer på det første element i input datasættet og neuroner hvis svar er den stærkeste er “sammenbygget” tættere på hinanden. Som de neurale system modtager flere og flere input, begynde data neuroner, der gentagne gange reagerer kraftigt at danne veldefinerede klynge inden for systemet. Efter passende uddannelse på et stort datasæt, der indeholder 2D form oplysninger i form af et sæt DFT komponenter, en individuel celle DFT komponenter kan sættes i den uddannet SOM og afsløre, om cellen sandsynligt tilhører den sunde eller gruppen patogene celle. Vi forventer sådan værktøj til at blive en fantastisk tilføjelse til metoderne af videnskabelige og kliniske diagnosticering.
Identifikation af potentielt patologiske tilstande ved hjælp af små, intakt vævsprøver er af stor betydning. Sådanne teknikker vil sikre en rettidig reaktion på smitsomme sygdomme og aggressive typer af kræft. De kinetiske og morfologiske svar af forskellige immun celler, fx mikroglia og makrofager, er karakteristiske for immunresponset af kroppen. Selv om i de fleste tilfælde ikke er det praktisk eller endda muligt at overvåge disse celler kinetic adfærd, er det temmelig ligetil at erhverve 3-dimensionelle billeder for at hente deres form. Typisk, immunceller antager en kompleks figur i sundt væv og en meget enklere form under betændte eller kræft forhold18. Mens tidsafhængig Karakteristik af sådan form ændring ville tilføje til vores forståelse af udvikling af immunrespons, kan ved hjælp af kun den 3D figur af en repræsentativ gruppe af celler også være tilstrækkelig til at bestemme den sunde eller patologisk karakter af væv.
Kendetegner en celle 3-dimensionelle overflade er ikke en nem opgave. Anvendelsen af sfærisk harmoniske er en måde at repræsentere en 3D overflade med et relativt stort antal (50-70) af komponenter11,12. Derudover bestemme de sfæriske harmoniske er beregningsmæssigt dyrt; projicere meget komplekse figurer på enhed sfære er enten umuligt eller meget vanskeligt på grund af behovet for at anvende flere gitre af forskellige Finheden på enhed sfære; Endelig, meningsfuld fortolkning af spektrene af sfærisk harmoniske komponenter er langt fra at være trivielt.
I vores arbejde præsenteres her, erstatte vi den vanskelige opgave at direkte 3D overflade analyse med det meget enklere tilgang til brug af 2D fremskrivninger af den oprindelige overflade for at få tilstrækkelig morfologiske oplysninger for at identificere patologiske betingelser. Vi vist alle trin i denne arbejdsproces ved hjælp af 3D mikroskopi data fra myeloide celler, mens klart påpege, at alle trin var enkle at gennemføre, og de resulterende 2-dimensionale kort var let at fortolke.
Naturligvis, en 3D til 2D projektion vil føre til tab af oplysninger om strukturen af overfladen. I vores eksempel datasæt af mikroglia i en musemodel kortikale tumor var det nok til at bruge seks vinkler, når du opretter 2D fremskrivningerne. Dog kan mere komplekse figurer eller mindre fremtrædende morfologiske ændringer kræve, at et større antal fremskrivninger er lavet for at være i stand til pålideligt identificere celle undergrupper med SOM. Af denne grund, er vores tilgang designet til at være i stand til at generere og analysere enhver antallet af fremskrivninger. Blot ved at vælge et højere antal fremskrivninger for mere komplekse former, er det muligt at skalere information tab til et acceptabelt minimum. Som et eksempel, ville interagerende celletype i figur 4a og 4b kræve et større antal fremskrivninger for at repræsentere komplekse overfladen korrekt.
Som nogen omtrentlige metode havde den hermed foreslåede arbejdsproces skal testes mod resultaterne af en manuel klassificering mikroglia18. Resultaterne præsenteres tidligere bekræftet pålideligheden af den automatiserede arbejdsgang. Arbejdsprocessen er desuden mere tid effektiv i forhold til konventionelle analyse. Den medicinske ekspert, der klassificeres mikroglia celler manuelt behov ca. 4 uger for hans analyse af datasæt, vores workflow nødvendigt kun omkring 1 dag. Robustheden af vores tilgang blev også tydeligt bevist af reproducerbarhed af de uddannede SOM til et undersæt af data, der tilhørte samme celletype, men blev ikke brugt til at træne SOM, som vist i figur 3 c.
Selvom vores tilgang ikke overveje kinetic oplysninger, undersøgte vi effekten af timing på DFT-baseret form analyse. Det mest typiske eksempel for tidsafhængig adfærd blev fundet blandt befolkningens Ambulant celle, hvor bidrag fra de højere indekserede DFT komponenter var klart observerbare, som i figur 4a. Dette kræver opmærksomhed på vigtigheden af at udnytte et stort nok antal DFT komponenter, når der beskæftiger sig med celletyper, der er tilbøjelige til at opføre sig meget tid-afhængige. På grund af automatiserede natur og høj udførelse hastighed af vores softwareværktøjer, vil det øgede antal DFT komponenter og fremskrivninger øge præcisionen og pålideligheden af resultater, samtidig med at de ikke vil hindre den beregningsmæssige ydeevne mærkbart.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Benjamin Krause for en frugtbar diskussion, og hans støtte. Forfatterne yderligere takke Robert Günther for hans hjælp med levende celle mikroskopi.
Arbejdet var støttet af DFG finansiel støtte NI1167/3-1 (JIMI) til R.N. og Z.C., DFG finansielle støtte CRC 1278 PolyTarget projekt Z01 for Z.C., C01 i TRR130 til R.N. og SFB633, TRR130, Exc257 til A.E.H. og konseilspræsident BfR ydet murene støtte SFP1322-642 F.L.K og A.L.
Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start | absnake2 | |
Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |