Summary
Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.
Abstract
Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase gama fosfat veya beta-gamma pirofosfat yan yüzeyler için fosforile ürünler üretebilmek için nükleotit trifosfat öncüleri aktarın. Kullanımı γ -32- P NTP öncüleri etiketli eşzamanlı substrat kullanımı ve ürün oluşumu radyografi tarafından izleme sağlar. Selüloz tabaklarda ince tabaka Kromatografi (TLC) hızlı ayırma ve substrat ve ürün hassas miktar sağlar. Biz saf (p) ppGpp sentetaz pyrophosphokinase etkinliği tahlil için ince katmanlı Kromatografi kullanan bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce etkinliği döngüsel nükleotit ve dinükleotit sentetaz ile karakterize etmek için kullanılan ve geniş bir nükleotit trifosfat bağ hidrolize veya bir terminal aktarır herhangi bir enzim aktivitesinin karakterize için uygundur başka bir molekül fosfat fosfat donörden.
Introduction
Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase (veya diphospho-kinaz) fosfatlar substrat moleküllerine nükleotit trifosfat (NTP) öncüleri aktarmak. Yüzeyler diğer nükleotit, amino asitler veya proteinler, karbonhidratlar ve lipidler1içerebilir. Bioinformatic analizleri bazen bir enzim soydaş substrat veya yüzeylerde karakterize enzimler benzerlik dayalı tahmin edebilirsiniz, ancak deneysel doğrulama hala gereklidir. Benzer şekilde, onun substrate(s) ve hangi fosfor-devret tepki tromboksan oranı için bir enzim ilgi ve etkileri etkenler, inhibitörleri veya diğer enzim effectors deneysel olarak belirlenmelidir. Bakteriyel sitoplazma mevcut diğer ATP tüketen enzimler tarafından ATP habercisi tükenmesi önlemek için saf protein nicel etkinlik deneyleri gerektirir.
Protein Saflaştırma metal benzeşme Kromatografi tarafından iyice edebiyat2,3' te karşılanmıştır. N - veya C-terminus için Rekombinant protein eklenmiş altı ardışık histidin kalıntıları oluşan histidin Tag hızlı arıtma metal benzeşme Kromatografi4,5,6tarafından izin verir. Bu DNA dizileri bazen protein istikrar ve/veya enzim kinetiği7,8değiştirebilirsiniz, ancak onlar değiştirmek ve genellikle protein işlevi, en az bir etkisi proteinler karşılaştırıldığında küçüktür. Histidin Etiketler, N - ve C-termini aynı protein söz konusu protein yapısını bilmeden tahmin etmek zor farklı etkileri olabilir. Histidin Etiketler genellikle bir Rekombinant protein altı histidin kalıntıları, ya hemen kodlamak astar tasarlayarak 3' ATG başlama kodonu veya hemen 5'-kodonu açık okuma çerçevesi, klonlama sırasında dahil edilmiştir. Amplifikasyon sonra hexahistidine içeren gen indüklenebilir bir organizatörü kontrol altında bir vektör içine bakmaksızın ve ifade, genellikle E. colibir laboratuvar suşu. Rekombinasyon protein sonra immobilize divalent katyonlar (genellikle nikel veya kobalt)9içeren bir benzeşme reçine izole. Yerel metal bağlanıcı proteinler kirletici rekabetçi ilişkili protein2yerinden imidazole ile titrasyon tarafından kaldırılabilir. Son olarak, hedef protein imidazole daha yüksek konsantrasyonları ile sütun eluted. Çeşitli ticari kaynaklar için immobilize metal katyon reçineler ve üreticileri imidazole konsantrasyonları ve tampon koşulları için öneriler sağlar. Elüsyon sonra protein Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz, diyaliz veya olabilir hemen içinde işlevsel testleri kullanılır.
Dolaylı olarak serbest bırakır veya Kemiluminesan oluşturur veya bir fluorophore heyecanlandıran ikinci bir tepki ATP fosfat bağı hidroliz kaplin tarafından kinaz etkinliğini izlemek için birkaç yöntem vardır, ama bu tepkiler birden çok hareketli parçalar ve -ebilmek var olmak Lojistik10zor. Özellikle fosfor-devret etkinliği ölçmek için en kolay yolu doğrudan radiolabeled fosfat grubu transferi bir piyasada bulunan γ -32-P izlemektir bir sigara radiolabeled substrat11 NTP habercisi , 12 , 13. karışımları radiolabeled yüzeylerde ve ürünleri ayrılmış ve ince tabaka Kromatografi (TLC) sayılabilir. TLC solutes verilen bir çözücü içinde fark hareketliliğini kılcal eylem tarafından üzerine adsorbe14solutes karışımı olmuştur bir yüzey üzerinde (katı faz) geçirmek çözücü (sıvı faz) izin vererek kullanır. Küçük ve/veya eksikliği katı faz ile olumlu etkileşimler solutes göç solutes daha yüksek moleküler ağırlık veya masif büyük benzeşim ile daha ilk konumlarından daha uzun mesafeler. Fosfor-devret sınavına fosfat moieties eklenir ve nötr veya asidik pH11,12,14, negatif iyon yük eklemek molekül molekül ağırlığı artırmak. Bu onların hareketlilik PEI-selüloz gibi temel bir yüzeyi azaltır. Asidik potasyum fosfat arabellekte zaman, karışımları mono-, di-, tri-, tetra-ve pentaphosphate türler PEI-selüloz üzerinde miktar her türün (Şekil 2, Şekil 3) izin, kolayca ayrılabilir. Faiz enzim içeren hücre lysates kullanarak bu tür deneyleri yapılabilir ama bu substrat ve/veya ürün tüketmek için diğer kinaz, fosfatazlar ve genel ATPases aktivite olasılığını içerir. Enzim aktivitesinin kantitatif vitro değerlendirilmesi için faiz enzim arındırmak gereklidir.
Guanozin tetrafosfat (ppGpp) ve guanozin pentaphosphate (pppGpp) olan, sırasıyla, bir pirofosfat havalesi ile oluşan moleküller grup bir adenozin trifosfat (ATP) öncül bir guanozin nükleotittir (GSYİH) sinyal ribonucleotide veya guanozin tetrafosfat (GTP) substrat15. Topluca (p) ppGpp bilinen bu tek ribonucleotide sinyaller, çevresel stres farklı bakteri türleri15,16katı yanıt olarak bilinen bir hücre genelinde yanıt aracılık. Enzimlerin iki korunmuş sınıf katalizler oluşumu (p) ppGpp15,17 ' Rel/DPT homolog (RSH) enzimlerdir 'uzun' bifonksiyonel (p) ppGpp sentetaz/Hidrolazlar onların benzerlik Real ve SpoT (p) adlı ppGpp metabolik küçük alarmone sentetaz (SAS) enzimler sadece Gram pozitif bakteri15' te, bulunan kısa monofunctional sentetaz iken sentetaz, hidrolaz ve Düzenleyici etki alanlarını içeren enzimler Escherichia coli üzerinden 17 , 18. spor oluşturmayan gram-pozitif bakteri Clostridium difficile sözde RSH ve SA'ları genler19kodlar. Burada, C. difficile RSH enzim catalytically etkin (p) ppGpp sentetaz olduğundan emin olun ilk etkinlik deneyleri mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. histidin öğesini protein indüklenebilir Overexpression
- Rsh C. difficile R20291 genomik DNA dan yükseltmek.
- Yüksek sadakat polimeraz kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin.
- C. difficile rsh primerler kullanılarak yükseltmek
rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) ve
rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), C-terminal hexahistidine etiket tanıtır.
Not: KpnI ve astar sekanslarında siteleri kesmek PstI kalın vardır. - PMMBneo vektör sindirmek ve siteler için 45 dk 37 ° C'de rsh-his6 PCR ürünü Pstl ve KpnI kısıtlaması ile kesti.
- Doğrusallaştırılmış vektör ve PCR parçaları özel Jel Elektroforez ve DNA jel ekstraksiyon kiti ile sonraki arıtma ile arındırmak.
- Vektör ve güçlendirilmiş PCR ürünü 280 nm absorbans (bir280) ölçmek. Denklemi kullanın
her DNA parçasının DNA konsantrasyonu belirlemek için.
- Rsh ifade için pMMBneo içine ligate.
- Sindirilmiş PMMBneo vektör, 125 birleştirmek 25 ng ng rsh-his6 gen ürünü, 10 ligaz arabellek x 2 μL ve DNA ligaz 1 μL. Nükleaz boş su 20 μL için toplam ses seviyesini ayarlamak için kullanın. 16 h için 16 ° C'de kuluçkaya.
Not: Tüp ligasyonu etkinliğinin parçası boyutuna bağlıdır ve üretici protokollerine göre ayarlanması gerekir. - Ve birleştirilmiş vektör ürün E. coli DH5-α veya başka bir recA - plazmid bakım soy dönüştürmek. Dönüştürülmüş hücrelerin LB plakaları ile 100 μg/mL sefaloridin seçin ve 16-24 h 37 ° C'de için kuluçkaya
- Dört kolonileri dönüştürme plaka (s) seçin ve her 100 μg/mL sefaloridin DNA izolasyonu için içeren bir taze plaka üzerinde çizgi. 16-24 h 37 ° C'de yeni tabaklar kuluçkaya ve sonraki protein ifade için bir izole seçin.
- Bölge desteği sağlam rsh protein başarılı ligasyonu onaylamak için seçilmiş bir koloni izole su, 20 μL çekme 10 min için 95 ° c ısı ve gen yükseltmek için kullanılan aynı astar kullanarak bir doğrulayıcı PCR için şablon olarak kullanmak.
- Sindirilmiş PMMBneo vektör, 125 birleştirmek 25 ng ng rsh-his6 gen ürünü, 10 ligaz arabellek x 2 μL ve DNA ligaz 1 μL. Nükleaz boş su 20 μL için toplam ses seviyesini ayarlamak için kullanın. 16 h için 16 ° C'de kuluçkaya.
- E. coli bakteri plazmid dönüşüm E. coli BL21 sisteme yüksek verimli protein üretimi için Standart dönüştürme protokolleri göre doğrulanmış plazmid dönüşümü.
- RSH-His6 E. coliiçinde hızlı.
- E. coli BL21 pMMBneo ile dönüştürülmüş bir koloni seçin::rsh ve 2 mL LB orta 50 μg/mL sefaloridin ile aşılamak. 37 ° C'de kuluçkaya 250 devir / dakikada sallayarak ise 12-16 h.
- 500 mL 0.5 mL hücre büyümesi ve protein ifade için gecede kültür ile 50 μg/mL sefaloridin içeren LB orta aşılamak.
- Hücre yoğunluğu bir OD600 0.167 37 ° C'de ulaşıncaya kadar 37 ° C ve bir kuluçka Shaker 250 d/d ifade kültür kuluçkaya
- Kuluçka makinesi sıcaklığı 30 ° C ile azaltmak ve bırakmak kültür sıcaklık için 30 dakika bekleyin.
- RSH ifade izopropil β-D-thiogalactoside (IPTG) ekleyerek 0,5 mM son bir konsantrasyon için neden. İndüksiyon 250 devir / dakikada sallayarak 30 ° C'de gecede (16-18 h) için yer almak izin verir.
- Santrifüjü 3,080 x g 4 ° C'de 30 dk için de tarafından cips
Not: Pelet gecede hedef protein, protein verim veya enzimatik aktivite fark kaybı olmadan ertesi gün arındırıcı için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
her DNA parçasının DNA konsantrasyonu belirlemek için.2. protein saflaştırma nikel benzeşme Kromatografi tarafından
Not: doğrudan protein saflaştırma adımları aşağıda verilen hücre lysate açıklığa kavuşturulması sonra devam edin. Sonraki protein saflaştırma protein verimini azaltır için depolama 4 ° C'de lysate gecede açıklığa kavuşturuldu.
- Nikel-Nitriloacetic asit (Ni-NTA) reçine 1 mL bir yerçekimi sütun kullanarak protein arındırmak.
- Önceki gün kullanın, sütun gecede 4 ° C'de 2 mL denge arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL lizozim, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazole, 0,25 mM DTT, 5 mM phenylmethane Sülfanil ile equilibrate florür (PMSF), % 10 gliserol).
- Ertesi gün getirmek sütun RT açıklanan yükleme önce 4 ° C lysate ve izin vermek o öne için ~ 2-3 h.
Not: sütun için termal denge getirmek içinde sütun oluşturan hava kabarcıklarını önlemek çok önemlidir. - Adım 1.3.6 lizis arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, % 10 gliserol, 0,5 mg/mL lizozim, 10 mM imidazole, 0,25 mM DTT ve 5 mM PMSF) elde Pelet resuspend.
- Hücreler buz üzerinde 30 duraklatma 8 x 10 s aralıklar için solüsyon içeren temizleyicide s bakliyat arasında.
- Lysate tarafından Santrifüjü kullanarak bir microcentrifuge 4 ° C'de 30 dk 3,080 x g de açıklığa kavuşturmak.
- Lysate lizis arabellek eşit miktarda hazırlamak sonra uygulamak hazırlandı sütuna lysate açıklık ve akışı aracılığıyla toplamak.
- Sütun ve ikincil akışı aracılığıyla toplamak için lysate akışı aracılığıyla yeniden uygulama açıklık.
- Sütun yıkama arabellek 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazole, % 10 gliserol) ile yıkayın. Akışı aracılığıyla toplamak.
Not: 5 mM MgCl2 yıkama ve elüsyon arabellekleri eklenmesi saf protein enzimatik aktivite için önemlidir. - Sütun yıkama arabellek 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 ve 50 mM imidazole) ile yıkayın. Akışı aracılığıyla toplamak.
- 2 mL elüsyon arabellek (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, % 10 gliserol ve 75 mM imidazole) uygulanır. Akışı aracılığıyla iki kesirler 1 ml toplamak.
Not: aynı protein sonraki arıtma assay olarak saf bu adım sonra sütun 4 ° C'de denge arabellekte saklanabilir. Sütun 3 kez düzgün depolanan kullanılabilir.
- Sütun kesirler için saflık SDS-sayfa tarafından değerlendirmek.
- Niteliksel protein saflaştırma değerlendirmek için tüm sütun kesirler 20 μL aliquots 170 V, 60 dk için %4 / % 10 polyacrylamide jel çalıştırın.
- Leke jel % 0,1 Coomassie mavi 5 h, yavaşça benchtop rocker üzerinde sallanan için oda sıcaklığında.
- % 40 metanol, % 10 buzul asetik asit gecede, oda sıcaklığında, benchtop rocker üzerinde sallanan jel destain.
Not: resim 1' de bir temsilcisi jel resimde.
- Diyaliz kesir 2 gece 4 ° C'de elute
- 1 mL diyaliz cihaz bir 20 kDa moleküler ağırlık dan sonra aranmaz ile (MWCO) kullanarak 200: 1 oranında karşı diyaliz tampon (15.7 mM Tris-HCl (pH 7,6) 471.9 mM NaCl, 15.69 mM MgCl2, 1.57 mM DTT, 1.5 mM PMSF ve % 15.7 gliserol) diyaliz.
- 280 absorbans ölçerek diyaliz protein örnek konsantrasyonu belirlemek nm ve hesaplanan molar tükenme katsayısı 82085 M-1cm-1 20kullanarak.
- Diyaliz protein örneği 5 μL aliquots kadar kullanmak aliquots-80 ° C'de depolayın.
3. protein etkinliği tahlil ince tabaka Kromatografi tarafından
- İnce Tabaka Kromatografi plaka hazırlayın.
- Reaksiyon gerçekleştirmeden önce polyethyleneimine (PEI) hazırlamak-selüloz tabak yıkama deiyonize su tarafından. Tabakları ~0.5 cm derinliğe Çift Kişilik distile su ile bir cam bölme yerleştirin.
- Su plaka başına geçirmek izin.
Not: tabak yıkama plakaları olmadan kullanılmış olabilir ama çamaşır elde edilen görüntülerin netliğini artırmak gibi kesinlikle gerekli değildir. İki dikey yönde daha fazla tabak yıkama herhangi bir kirletici reçine mevcut plaka (Şekil 2) bir köşesinde izole sağlar. - Cam odadan tabakları getir ve kuru gecede (12-18 h) için bir benchtop raf bırakmaktır.
- Kuru plaka 2,0 cm bir kenar örnekleri için TLC nereye uygulanacağını belirtmek için yumuşak bir kalem ile işaretleyin. Örnekleri 2 μL örnekler için uygulanan en az 1.0 cm arayla (Şekil 2).
Not: Bu sinyal miktar için önemlidir bitişik nokta arasında açık ayırma sağlar. Selüloz reçine değil de çizilmiş, küçük kalem işaretleri yüzeyi ile solvent geçiş engel olmaz. - Deneyler planlarken, her zaman tek bir noktada her plaka üzerinde kullanılmayan bırakın.
Not: Bu örnek miktar (Şekil 2) bir boş lane sağlayacaktır. Bir 20 cm TLC tabak 19 noktalar için yerim.
- Enzim etkinliği tahlil
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM amonyum asetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT ve 0.6 mM ATP içeren bir 5 x arabellek karışım hazırlayın.
Not: Bu karışımı büyük miktarlarda hazırlanan ve daha sonra kullanmak için 10 μL aliquots donup kalan ev. Mix birden çok donma-çözülme çevrimleri için maruz. - Bireysel tepkiler 3 mikron RSH, 1 x arabellek karıştırmak, 0.6 mM GSYİH, 1,2 mM MgCl2içeren hazır olun. γ -32P-ATP başına 10 μL tepki 1.0 μCi ekleyip nükleaz boş su istenen bir birim kadar tepki getirmek için kullanabilirsiniz. Sonra diğer bileşenler karışık, RSH ek nükleotit içeren karışımı olarak enzimatik aktivite assay başlatır gibi RSH ekleyin.
Not: Son tepki birim timepoints örnek sayısına bağlıdır. 2 μL/timepoint örnekleme yapmak için her 4 timepoints için tepki karışımı 10 μL bir araya getirin. - ATP hidroliz bulaşıcı nükleaz aktivitesindeki için denetlemek için hiç protein içeren bir 10 μL tepki montaj ve paralel olarak kuluçkaya. T 2 μL örnekleri spot = 0 ve ATP protein yokluğunda hidrolize değil emin olmak için deney sonunda.
- Hemen RSH eklenmesi 2 μL kaldırmak ve t olarak etiketli PEI-selüloz plaka üzerine spot = 0 dk örnek.
- 37 ° C'de 2 μL aliquots istenen timepoints, kaldırma, reaksiyon kuluçkaya.
Not: örnek selüloz plaka adsorbe zaman enzimatik aktivite sona erer. Son nokta plaka geliştirme tam adsorpsiyon ve örnek kurutma emin olmak için önce eklendikten sonra 10-30 dakika bekleyin.
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM amonyum asetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT ve 0.6 mM ATP içeren bir 5 x arabellek karışım hazırlayın.
- İnce Tabaka Kromatografi
- Kromatografi odası 1,5 M 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) 0.5 cm derinliğe ile doldurun.
Not: Birimin Kromatografi tank boyutları bağlı olacaktır. Herhangi bir cam kaba bükmeden TLC plaka ekleme izin kadar geniş bir düzey alt ile bir kapak ilavesi ile gelişmekte olan bir tank olarak kullanılabilir. TLC plaka ile plastik film kaplı cam ölçek geliştirme sağlamak için temiz bir razorblade dar şeritler halinde kesip çıkarabilirsiniz. - Solvent plaka alt kenarına bırakın. Solvent (~ 90 dk) plaka başına geçirmek izin verir.
Not: solvent geçiş plaka üst kısmında durdurmak ve örnekleri kayıp veya birlikte uzun bir daldırma sırasında çalıştırmak iken, tabak içinde solvent gecede bırakılmamalıdır. Immersions 4 h uzun yedekleme plaka ayırmak ve sinyal kaybına neden reçine neden olabilir. - Kromatografi tankından plaka çıkarın ve raf kurutma bir benchtop yerleştirin.
- Hava plakasına gecede kuru izin verir.
Not: Kurutma bir saç kurutma makinesi kullanımı ile hızlandırılmış. Kuruluk rengine dönmek için kullanılmayan bir plaka tamamen kuru zaman rengini ve ıslak koyulaştırır reçine tarafından tespit edilebilir. - Sonra plaka kurudur, plaka radyoaktif madde transferi için görüntüleme kaset önlemek ve autoradiography (Şekil 3) çözümlemek için plastik film şal.
- Kromatografi odası 1,5 M 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) 0.5 cm derinliğe ile doldurun.
- Veri Analizi
- Phosphorimager kaset oda sıcaklığında 4 h için ayrılmış tepkiler içeren PEI-selüloz plaka maruz.
Not: Bu taze γ -32P-ATP belirtilen konsantrasyonlarda kullanarak çok net bir görüntü vermeye yeterli pozlama olduğunu. Radiolabelled substrat daha düşük miktarlarda kullanılması halinde, pozlama süresi 12-16 h ile artırılabilir. - Görüntü bir phosphorimager kasette.
- Düşsel bilgisayar yazılımı ile bir grafik kullanıcı arabirimini kullanarak, Dikdörtgen çizmek seçerek ve dikdörtgen ROIs bir tüm lane ve ATP ve ppGpp noktalar o lane (Şekil 3 içinde yer alan çizmek için fareyi kullanarak ilgi bölgeleri (ROIs) çekmek ).
- Seçin, Kopyala, Yapıştır komutları (veya karşılık gelen komutları kullanılan görüntüleme yazılımını temel alan) kullanın ROIs sinyal her şeritte aynı alanları içinde ölçüm vardır emin olmak için aynı ROIs diğer yolları içinde çizmek için. Boşluk olarak kullanılmak üzere kullanılmayan bir Lane ROIs içerir.
- Kullanarak analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi | Eklemek komutları görüntüleme yazılımı, tüm PEI selüloz plaka üzerinde çizilmiş ROIs seçin.
- Kullanarak analiz | Ayarla ölçümleri | Ölçü komutları, sinyal yoğunluğu içinde her yatırım getirisini ölçmek ve ölçüleri (Şekil 3) elektronik verme. Deneysel sinyalleri boş ROI değer çıkarın.
- ATP ve formülleri kullanarak ppGpp atfedilebilecek battaniye sinyal içinde her lane ne yüzdesini hesaplamak
Not: ROIs alınabilir ve ticari yazılım phosphorimager ile uyumlu veya serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım (Ulusal Sağlık Enstitüleri) kullanarak quantitated.
- Phosphorimager kaset oda sıcaklığında 4 h için ayrılmış tepkiler içeren PEI-selüloz plaka maruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz Clostridium difficile ve enzimatik faaliyete değerlendirilmesi (p) ppGpp sentetaz benzeşme arıtma için bir yöntem mevcut. Şekil 1 metal benzeşme Kromatografi tarafından elde protein saflaştırma gösterir. Bu arıtma üzerinden ikinci elüsyon (E2) kesir diyaliz ve enzimatik aktivite tayini için kullanılan. Şekil 2 hazırlamak ve ince tabaka Kromatografi tarafından pyrophosphotransferase deneyleri taşımak için gerekli adımları ayrıntılarını verir. Şekil 3 uygun blanking ve sinyal yoğunluk için yüzdeleri bir vurgu ile bu deneyler verilerinden nasıl quantitated gösterir. Şekil 4A, biz bir temsilcisi TLC autoradiograph arıtılmış RSH, C. difficile (p) ppGpp sentetaz kullanarak (p) ppGpp sentetaz testin mevcut. Radiolabeled inorganik fosfat eser miktarda içerdiği için görünür olan çözelti açık olduğu gibi ilk nokta konum, ppGpp ve ATP noktalar autoradiograph üzerinde açıkça görülebilir. Sahip oldukları büyük moleküler ağırlık ve daha negatif iyon yük gibi moleküller daha fazla fosforik asit moieties ile daha az hareket eden ilk nokta konumdan sergi; Bu onların hareketlilik üzerinde temel PEI-selüloz engellemektedir. 37 ° C'de 120 dk boyunca, ppGpp birikimi ve ATP tüketimi yok denecek kadar ATP azalması ve ppGpp birikimi RSH 4A rakamhuzurunda kolayca belirgin iken sentetaz enzimi eksik reaksiyonlarda azdır). Şekil 4B dört deneyler mutlak ATP ve ppGpp sinyalleri gösterir. Şekil 4 c gösterir mutlak sinyalleri aynı verilerle Şekil 4B olarak toplam radyoaktif sinyal yüzdeleri için dönüştürülür. Bu yanlışlıklar pipetting hata ve/veya radyoaktif bozunma nedeniyle en aza indirir ve belirsizlik veri tanıtımı olmadan havuza alınmış için farklı günlerde gerçekleştirilen deneyler verileri sağlar.
Şekil 1: nikel benzeşme arıtma RSH. Lysate (L) ve bağlı BL21 pMMB centrifuged lysate (CL) gösteren bir Coomassie lekeli SDS-sayfa jel::rsh-his6 yanı sıra akışı aracılığıyla (FT), 1 (W1) yıkamak, 2 ve elüsyon (E1 ve E2) kesirler nikel benzeşme arıtma sonra yıkayın. E2 kesir diyaliz ve sonraki enzimatik deneyleri için kullanılan. Moleküler Ağırlık protein boyut standartların sağ tarafta gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hazırlık TLC plakaların. (A)tabak su (mavi) alt kenarı yerleştirerek bir boyut içinde yıkanmış. Çözücü ile plaka tepesine kirleticileri (sarı) geçirin. (B) bir tabak tamamen kurumuş sonra o ilk yıkama göre 90 ° döner ve tekrar su plaka başına geçirmek ikinci bir boyut yıkanır. (Yıkama, daha sonraC) kirletici plaka bir köşesinde yalıtılır. Yıkanmış TLC plaka reçine yavaşça nerede örnekleri görmüş gerekirdi belirtmek için yumuşak bir kalemle işaretlenmiş olabilir. 2 μL örnek için en az 1 cm noktalar arasında yeterli örnek ayırma sağlayacaktır. Örnekleri plaka 'alt' dan 2 cm fark. Örnek uygulama sonra solvent nerede herhangi bir kirletici maddeleri su yıkama tarafından izole 'top için ' çalışmasına izin verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: sinyal quantification. Faiz (ROIs) toplam tanımlama bölgelerinde, ATP ve ppGpp sinyal boş bir lane ve deneysel bir lane için gösterilir. Sinyal şiddeti her boş ROI içinde deneysel değerden çıkarılır ve ATP ve ppGpp sinyalleri toplam radyoaktif sinyal ATP ve ppGpp atfedilebilecek yüzdesi sunmak için gösterilen denklemleri kullanarak toplam sinyali için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Autoradiograph temsilcisi TLC plaka: (a)bu görüntü gösterir solvent ön, ATP, ppGpp ve ilk nokta konumları kullanarak yürütülen bir tepki saf C. difficile RSH. Boş bir lane doğru sinyal miktar izin verirken hiç protein (n.p.) içeren bir denetim tepki uncatalyzed ATP hidroliz miktar sağlar. (B) mutlak sinyal yoğunluklarda ATP ve ppGpp, kuluçka C. difficile RSH ile 120 dakika boyunca. Anlamına gelir ve standart sapmalar dört bağımsız deneyler gösterilmiştir. (C) ppGpp aynı verilerle (b) sinyal toplam radyoaktif sinyal yüzdesi olarak sundu. ppGpp birikimi yok protein (n.p.) kontrol tepki olarak siyah olarak gösterilir. Anlamına gelir ve standart sapmalar ile iki teknik çoğaltır her iki bağımsız deneyler gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada onun öğesini RSH dan C. difficile arıtma raporu ve radiolabeled ince tabaka Kromatografi kullanarak faaliyet miktar için bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce diguanylate cyclase enzim C. difficile, yanı sıra (p) ppGpp sentetaz, nükleotit cyclase, kinaz ve diğer organizmalar11,12 fosfodiesteraz enzim etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır ,13,21. Yöntem roman olmasa da, genel olarak tahlil birçok türleri için uygun olan ve araştırmacılar kendi sunum video formatında yararlı bulacaksınız umuyoruz.
Protokol içinde en kritik adım protein saflaştırma (adımları 2.1.3–2.1.10), ince tabaka Kromatografi (adım 2.2 – 2.3) için tepki hazırlık ve veri analizi (adım 3.4) vardır. Özellikle yardımcı olmak için aşağıdaki değişiklikler bulduk: MgCl2 nikel sütun arıtma (adımları 2.1.3–2.1.10) için kullanılan arabellekleri için saf protein enzimatik aktivite ve tanıtımı için çok önemli eklenmesidir enzim etkinliği verilerini % ppGpp olarak üretilen daha ziyade mutlak ppGpp üretilen farklı günlerde toplanan verilerin sağlar daha ile farklı γ-32P-ATP tutarlı. Bu yöntem bir phosphorimager erişimi olan herhangi bir araştırma grubuna erişilebilir ve veri analizi basittir. Phosphotransfer aktivite 32P yüzdesi olarak quantitating tarafından ppGpp için dönüştürülür, veri tekrarlanabilirlik sağlamak. Çünkü çok küçük tepki birimleri PEI-selüloz plakalar lekeli, hafif pipetting yanlışlıklar γ -32P-ATP veya 32P-ppGpp verilen bir şeritte mutlak miktarı önemli hata tanıtmak için önemli potansiyel var TLC plaka ama olası biçimler arasında radyoaktif sinyal dağılımı üzerinde mevcut toplam sinyalinin bağımsızdır. Buna ek olarak, belirli bir şeritte toplam radyoaktif sinyal γ -32P-ATP deneyde kullanılan yaşın bağlı olabilir. 32 P 14.3 gün bir yarı ömrü vardır, bağımsız deneyleri gerçekleştirilen bu yüzden birkaç gün arayla toplam radyoaktif sinyali algılandı önemli farklılıklar gösterebilir ama radiolabeled ATP ve ppGpp göreli miktarda enzim etkinliği sadece bağlıdır. Verileri 'yüzde ppGpp' yerine mutlak ppGpp sunmak sinyal rasgele gürültü giriş pipetting hata veya radyoaktif bozunma engeller. Bu rakam 4B arasındaki farklar tarafından gösterilmiştir ve 4 c Hem anlamına gelir ve standart sapmalar aynı dört deney verileri görüntüler, ancak Şekil 4 c verilerde toplam radyoaktif sinyal için normalleştirilmiş.
C. difficile RSH enzim bir fonksiyonel ppGpp sentetaz vitro, hızlı pyrophosphotransfer bir ATP phosphodonor ve bir GSYİH alıcısı yetenekli olduğunu belirledik. Bu tepki magnezyum, ATP ve guanozin bağlama RSH aile enzimler22tarafından koordine bağlıdır. Nikel benzeşme Kromatografi 5 mM MgCl2 lizis dahil etmek için üretici protokolleri değiştirdiniz ve yıkama arabellekleri yanı sıra elüsyon tampon magnezyum yokluğunda arıtma için zararlı olduğunu bulduk çünkü enzimatik aktivite saf protein. Bu magnezyum iyonları protein yapısı nükleotit bağlama yokluğunda sabitleme katalitik olmayan bir rol oynayabilir, ama daha fazla yapısal karakterizasyon bundan emin olmak gerekli olacaktır göstermektedir.
Bizim bilgi, bu eser ilk yayımlanmış rapor C. difficile ppGpp sentezi ve bu organizma ekstraselüler stres hayatta bir (p) ppGpp-aracılı sıkı yanıt-e doğru kullanmak olasıdır gösterir. (p) ppGpp metabolizma daha önce hiç bu önemli insan patojen bildirdi. Verilen bu sıkı yanıt sebat birçok diğer patojenleri de karıştığı, (p) ppGpp-aracılı sinyalleşme C. difficile hücreleri yüksek stres toleransı ve C. difficile yüksek nüks oranı bir rol oynayabilir olasıdır enfeksiyon23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu eser NIAID 1K22AI118929-01 tarafından finanse edildi. EBP Old Dominion University, Norfolk, Virginia, ABD araştırma Office bir yaz Araştırma Bursu Programı hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | - | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | - | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | - | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | - |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al.
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).
