Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En rensing og I Vitro aktivitet analysen for en (p) ppGpp Synthetase fra Clostridium difficile

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

Her beskriver vi en metode for rensing histidin-merket pyrophosphokinase enzymer og utnytte tynt lag kromatografi radiolabelled underlag og produkter til analysen for den enzymatiske aktiviteten i vitro. Enzym aktivitet analysen er bredt aktuelt noen kinase, nucleotide cyclase eller fosfor-transfer reaksjon som mekanisme inkluderer nukleotid trifosfat hydrolyse.

Abstract

Kinase og pyrophosphokinase enzymer overføre gamma-fosfat eller beta-gamma pyrophosphate moiety fra nukleotid trifosfat forløpere til underlag å lage fosforylert produkter. Bruk av γ -32- P merket NTP forløpere tillater samtidig overvåking av underlaget utnyttelse og produkt dannelsen av røntgenfotograferingen. Tynt lag kromatografi (TLC) på cellulose plater tillater rask separasjon og følsom kvantifisering av underlaget og produkt. Vi presenterer en metode for å utnytte den tynne lag kromatografi å analysen pyrophosphokinase aktiviteten til en renset (p) ppGpp synthetase. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å beskrive aktiviteten av syklisk nukleotid og dinucleotide synthetases og er generelt egnet for karakteriserer aktiviteten til et enzym som hydrolyzes en nukleotid trifosfat obligasjon eller overfører en terminal fosfat fra fosfat giver til et annet molekyl.

Introduction

Kinase og pyrophosphokinase (eller diphospho-kinase) enzymer overføre fosfater fra nukleotid trifosfat (NTP) forløpere til underlaget molekyler. Substrater kan inneholde andre nukleotider, aminosyrer eller proteiner, karbohydrater og lipider1. Bioinformatic analyser kan noen ganger forutsi et enzym beslektet substrat eller underlag basert på likheten til preget enzymer, men eksperimentelle validering er fortsatt nødvendig. Tilsvarende affinitet av et enzym for sin substrate(s) og som det gir fosfor-transfer reaksjonen, og effekten av co-faktorer, hemmere, eller andre enzym effektor må avgjøres eksperimentelt. For å unngå uttømming av ATP forløperen av andre ATP tidkrevende enzymer i bakteriell cytoplasma, krever kvantitativ aktivitet analyser renset protein.

Protein rensing av metall affinitet kromatografi har blitt dekket grundig i litteratur2,3. Histidin tags bestående av seks påfølgende histidin rester lagt til N - eller C-terminus en rekombinant protein tillate rask rensing av metall affinitet kromatografi4,5,6. Disse sekvensene er små sammenlignet med proteiner de endre og har vanligvis en minimal effekt på protein funksjon, selv om de kan noen ganger endre protein stabilitet eller enzym kinetics7,8. Histidin koder på N - og C-jernbanestasjonen termini av samme protein kan ha ulike effekter, som er vanskelig å forutsi uten å vite strukturen av proteinet i spørsmålet. Histidin tags er vanligvis innlemmet under kloning av et rekombinant protein ved å utforme primere som kode seks histidin rester, enten umiddelbart 3' til ATG start codon eller umiddelbart 5' å stoppe codon åpent lesing rammen. Etter forsterkning, er hexahistidine inneholder genet samskrevet i en vektor under kontroll av en induserbart selskapet og uttrykt, vanligvis i et laboratorium stamme av E. coli. Rekombinasjon protein kan deretter bli isolert på en affinitet harpiks inneholder immobilisert divalent kasjoner (vanligvis nikkel eller kobolt)9. Forurensende opprinnelige metal-bindende proteiner kan fjernes ved titrering med imidazole, som konkurransedyktig fortrenger bundet protein2. Endelig er mål protein elut fra kolonnen med høyere konsentrasjoner av imidazole. Det er flere kommersielle kilder for immobilisert metall kation harpikser, og produsentene gir anbefalinger for bufferen betingelsene og imidazole konsentrasjoner. Etter elueringsrør, kan protein være analysert av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), dialyzed eller brukes umiddelbart i funksjonelle analyser.

Det er adskillige metoder å overvåke indirekte kinase aktivitet ved å koble ATP fosfat bond hydrolyse til en andre reaksjon som utgivelser interesserer en fluorophore eller genererer chemiluminescence, men disse reaksjonene har flere bevegelige deler og kan logistisk utfordrende10. Den enkleste måten å måle spesielt fosfor-datatransport aktivitet er å overvåke direkte overføring av radiolabeled fosfatgruppe fra en kommersielt tilgjengelig γ -32-P NTP forløperen til en ikke-radiolabeled substrat11 , 12 , 13. blandinger av radiolabeled underlag og produkter kan atskilt og kvantifisert ved tynt lag kromatografi (TLC). TLC benytter differensial mobilitet av solutes i et gitt løsemiddel ved å la løsemiddelet (flytende fase) overføre kapillær handling over en overflate (solid fase) som en blanding av solutes har vært adsorbert14. Solutes som er små og/eller mangler gunstige interaksjoner med solid fase vil migrere lengre avstander fra deres første sted enn solutes med høyere molekylvekt eller stor slektskap for solid. For undersøkelse av fosfor-overføring øke fosfat moieties molekylvekt molekyler de legges til, og legger til negativ ioniske nøytrale eller surt pH11,12,14. Dette reduserer mobilitet på en grunnleggende overflate som PEI-cellulose. Når utviklet i surt kalium fosfatbuffer, kan blandinger av mono - di-, tre-, tetra- og pentaphosphate Art lett skilles på PEI-cellulose, slik at kvantifisering av hver art (figur 2, figur 3). Slike analyser utføres med cellen lysates som inneholder enzymet rundt, men dette inkluderer potensialet for aktiviteten til andre kinaser, phosphatases og generell ATPases å utarme substrat og/eller produkt. For en kvantitativ i vitro vurdering av enzym aktivitet er det nødvendig å rense enzymet rundt.

Guanosine tetraphosphate (ppGpp) og guanosine pentaphosphate (pppGpp) er ribonucleotide signalnettverk molekyler som er dannet av overføring av en pyrophosphate gruppe fra en adenosin trifosfat (ATP)-forløperen til, henholdsvis en guanosine diphosphate (BNP) eller guanosine tetraphosphate (GTP) substrat15. Disse enkelt ribonucleotide signaler, kollektivt kjent som (p) ppGpp, formidle celle hele svar på miljøstress kjent som strenge svaret i bakteriell artsmangfoldet15,16. To bevarte klasser av enzymer katalysere dannelse (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer er 'lang' bifunctional (p) ppGpp synthetase/hydrolases oppkalt etter deres likhet til avslapning og SpoT (p) ppGpp metabolske enzymer fra Escherichia coli som inneholder synthetase, hydrolase og regulatoriske domener, mens små alarmone synthetase (SAS) enzymer er korte monofunctional synthetases funnet i Gram positiv bakterier15, 17 , 18. spore-forming Gram-positive bakterien Clostridium difficile koder antatte RSH og SAS gener19. Her presenterer vi første aktivitet analyser som bekrefter at C. difficile RSH enzymet er en katalytisk aktive (p) ppGpp synthetase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. induserbart overuttrykte et histidin-merket Protein

  1. Forsterke rsh fra C. difficile R20291 genomisk DNA.
    1. Bruke en høy kvalitet utvalg, og følg produsentens instruksjoner.
    2. Forsterke C. difficile rsh bruker primere
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) og
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som introduserer en C-terminalen hexahistidine kode.
      Merk: KpnI og PstI kutte områder i primer sekvenser er uthevet.
    3. Fordøye pMMBneo vektoren og rsh-his6 PCR produktet med Pstl og KpnI begrensning kuttet nettsteder på 37 ° C i 45 minutter.
    4. Rens linearisert vektoren og PCR fragmenter via agarose gel geleelektroforese og påfølgende rensing med en DNA gel utvinning kit.
    5. Måle 280 nm absorbansen (en280) vektoren og forsterket PCR produktet. Bruke formelen Equation 1 å bestemme DNA konsentrasjonen av hver DNA-fragment.
  2. Ligate rsh i pMMBneo for uttrykket.
    1. Kombiner 25 ng av fordøyd PMMBneo vektor, 125 ng rsh-his6 gene produktet, 2 μL 10 x ligase buffer og 1 μL DNA ligase. Bruk nuclease fritt vann for å justere det totale volumet til 20 μL. Ruge på 16 ° C for 16 h.
      Merk: Effekten av hemorroider avhenger fragment størrelse og må justeres avhengig av produsenten protokoller.
    2. Forvandle ligated vektor produktet til E. coli DH5-α eller en annen recA - plasmider vedlikehold belastning. Velg for transformert celler på LB plater med 100 μg/mL kanamycin og ruge 16-24 h på 37 ° C.
    3. Velg fire kolonier fra transformasjon platen (s) og strek hver på en frisk plate som inneholder 100 μg/mL kanamycin DNA isolering. Inkuber nye plater på 37 ° C 16-24 h, og velg en isolere for påfølgende protein uttrykk.
    4. For å bekrefte den vellykkede ligation av intakt rsh protein koding regionen, plukke en koloni av utvalgte isolere i 20 μL av vann, varme ved 95 ° C i 10 min og bruke som en mal for en bekreftende PCR bruker samme primer brukes til å forsterke genet.
  3. Transformere den bekreftet plasmider etter standard transformasjon protokoller for E. coli bakteriell plasmider transformasjon til E. coli BL21 system for høy avkastning protein produksjon.
  4. Uttrykke RSH-His6 i E. coli.
    1. Velg en enkelt koloni av E. coli BL21 forvandlet pMMBneo::rsh og vaksinere 2 mL LB medium med 50 μg/mL kanamycin. Ruge på 37 ° C 12-16 h mens riste på 250 rpm.
    2. Vaksinere 500 mL LB medium som inneholder 50 μg/mL kanamycin med 0,5 mL av natten kultur for cellevekst og protein uttrykk.
    3. Inkuber uttrykk kulturen på 37 ° C og 250 rpm i en inkubator shaker til celle tetthet når en OD600 0.167 på 37 ° C.
    4. Redusere inkubator temperaturen til 30 ° C og vente 30 min for kultur temperaturen å slippe.
    5. Indusere RSH uttrykk ved å legge isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) til en siste konsentrasjon på 0,5 mM. Tillate induksjon skje over natten (for 16 til 18 h) på 30 ° C, rister på 250 rpm.
    6. Pellets med sentrifugering 3080 x g i 30 min på 4 ° C.
      Merk: Pellet kan lagres over natten på 20 ° C for rensing målet protein dagen uten merkbare tap av protein avkastning eller enzymatisk aktivitet.

2. protein rensing av nikkel affinitet kromatografi

Merk: Fortsett direkte med protein rensing trinnene nedenfor etter avklarte cellen lysate. Lagre avklart lysate på 4 ° C over natten for påfølgende protein rensing reduserer protein avkastningen.

  1. Rense protein bruker 1 mL av nikkel-Nitriloacetic Acid (Ni-NTA) harpiks på en tyngdekraften kolonne.
    1. Dagen før bruk, equilibrate kolonnen overnatting på 4 ° C med 2 mL balanse buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL lysozyme, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazole, 0,25 mM DTT, 5 mM phenylmethane sulfonyl fluorid (PMSF), 10% glyserol).
    2. Dagen etter bringe kolonnen fra 4 ° C til RT før lasting av avklart lysate og la det stå for ~ 2-3 h.
      Merk: Å bringe kolonnen til termisk likevekt er avgjørende for å unngå luftbobler danner i kolonnen.
    3. Resuspend pellets fikk i trinn 1.3.6 i lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glyserol, 0,5 mg/mL lysozyme, 10 mM imidazole, 0,25 mM DTT og 5 mM PMSF).
    4. Sonicate celler på is for 8 x 10 s intervaller, pause 30 s mellom pulser.
    5. Avklare den lysate med sentrifugering 3080 x g i 30 min på 4 ° C ved hjelp av en microcentrifuge.
    6. Forberede lysate med like mengder lyseringsbuffer så gjelder det prepped avklart lysate til kolonnen og samle gjennomflytsenhet.
    7. Nytt avklart lysate gjennomflytsenhet kolonnen og samle sekundære gjennomflytsenhet.
    8. Vask kolonnen med vaskebuffer 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazole, 10% glyserol). Samle gjennomflytsenhet.
      Merk: Inkludering av 5 mM MgCl2 i vask og elueringsrør bufferne er viktig for enzymatisk aktivitet av renset protein.
    9. Vask kolonnen med vaskebuffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 og 50 mM imidazole). Samle gjennomflytsenhet.
    10. Bruke 2 mL elueringsbufferen (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glyserol og 75 mM imidazole). Samle gjennomflytsenhet i to fraksjoner av 1 mL.
      Merk: Kolonnen etter dette trinnet kan lagres i balanse buffer ved 4 ° C Hvis samme protein vil bli renset ved neste rensing analysen. Kolonnen kan brukes opptil 3 ganger hvis lagret riktig.
  2. Vurdere kolonnen brøker for renhet SDS-side.
    1. Å kvalitativt vurdere protein rensing, kjøre 20 μL dele alle kolonnen fraksjoner på en 4/10% polyakrylamid gel for 60 min på 170 V.
    2. Flekk gel med 0,1% Coomassie blå ved romtemperatur for 5 h, rocking forsiktig på en Borstemmaskin rocker.
    3. Destain gel i 40% metanol, 10% iseddik over natten i romtemperatur, rocking på en Borstemmaskin rocker.
      Merk: En representant gel er avbildet i figur 1.
  3. Dialyze elute brøkdel 2 overnatting på 4 ° C.
    1. Dialyze mot dialyse buffer (15.7 mM Tris-HCl (pH 7.6), 471.9 mM NaCl, 15.69 mM MgCl2, 1.57 mM DTT, 1,5 mM PMSF og 15,7% glyserol) på en 200: 1 ratio med en 1 mL dialyse enhet med en 20 kDa molekylvekt cut-off (MWCO).
    2. Bestemme konsentrasjonen av dialyzed protein prøven ved å måle absorbans ved 280 nm og bruker den beregnede molar utryddelse koeffisient 82085 M-1cm-1 20.
    3. Lagre 5 μL dele dialyzed protein prøven i dele ved-80 ° C før bruk.

3. protein aktivitet analysen av tynt lag kromatografi

  1. Forbered tynt lag kromatografi platen.
    1. Før du utfører reaksjonen, forberede polyethyleneimine (PEI)-cellulose plater ved vask i deionisert vann. Sett platene i et glass kammer med dobbel destillert vann til en dybde på ~0.5 cm.
    2. Tillat vannet å migrere til toppen av platen.
      Merk: Vask platene er ikke strengt nødvendig, plater kan brukes uten, men vask øker klarheten av bildene. Vaske platene i to vinkelrett retninger ytterligere sikrer at eventuelle forurensninger i harpiksen er isolert i ett hjørne av platen (figur 2).
    3. Bringe plater av glass kammeret og la i en Borstemmaskin reol til tørr overnatting (12 – 18 h).
    4. Merke tørr platene 2.0 cm fra en med en myk blyant å indikere hvor eksemplene brukes for TLC. For 2 μL prøver, bruke prøver ikke mindre enn 1,0 cm fra hverandre (figur 2).
      Merk: Dette gjør klart skille mellom tilstøtende stedet, som er avgjørende for signalet kvantifisering. Cellulose harpiksen er ikke riper, små vil blyantstreker på overflaten ikke påvirke løsemiddel migrasjon.
    5. Når du planlegger eksperimenter, alltid forlate ett sted på hver plate ubrukt.
      Merk: Dette vil gi en tom kjørefelt for eksempel kvantifisering (figur 2). En 20 cm TLC plate har rom for 19 flekker.
  2. Enzym aktivitet analysen
    1. Forbered en 5 x buffer blanding som inneholder 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM ammonium acetate, 10 mM KCl, 1 mM DTT og 0,6 mM ATP.
      Merk: Denne blandingen kan være forberedt i store mengder og frosset i 10 μL dele for senere bruk. Ikke utsett blanding til flere fryse-Tin sykluser.
    2. Forberede personlige reaksjoner som inneholder 3 μM RSH, 1 x buffer mix, BNP, til 0,6 mM 1.2 mM MgCl2. Legg 1.0 μCi γ -32P-ATP per 10 μL reaksjon og bruke nuclease gratis vann for å bringe reaksjonen til et ønsket volum. Legge til RSH etter andre komponenter har vært blandet, som tillegg av RSH til nukleotid inneholder mix starter enzymatiske aktiviteten analysen.
      Merk: Siste reaksjon volumet avhenger av antall timepoints samplet. Hvis du vil prøve 2 μL/timepoint, samle 10 μL reaksjonsblandingen for hver 4 timepoints.
    3. Hvis du vil kontrollere for ATP hydrolyse fra forurensende nuclease aktivitet, montere en 10 μL reaksjon som inneholder ingen protein og ruge det parallelt. Spot 2 μL eksempler på t = 0 og på slutten av å sikre at ATP ikke var hydrolyzed i fravær av protein.
    4. Fjern øyeblikkelig 2 μL på tillegg kjøres, og oppdage det på merket PEI innen tallerkenen som t = 0 min prøve.
    5. Inkuber reaksjonen på 37 ° C, fjerne 2 μL dele på ønsket timepoints.
      Merk: Enzymatisk aktivitet vil opphøre når prøven er adsorbert på cellulose platen. Vente 10-30 min etter det siste stedet legges til platen før utvikling å sikre fullstendig adsorpsjon og prøve tørking.
  3. Tynt lag kromatografi
    1. Fyll kromatografi kammeret med 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3.64) til en dybde på 0,5 cm.
      Merk: Volumet nødvendig avhengig av dimensjonene for kromatografi tanken. En glassbeholder med nivå bunn som bred nok til å tillate innsetting av TLC plate uten å bøye kan brukes som en utvikle tank med en dekning. TLC platen kan bli kuttet i smalere strimler med en ren barberblad til utvikling i et glass beaker dekket i plastfolie.
    2. Lev den nederste kanten av platen i løsemiddel. La løsemiddelet til å migrere til toppen av platen (~ 90 min).
      Merk: Mens løsemiddel overføring vil stoppe på toppen av platen og prøver ikke blir mistet eller kjøres samtidig under en lengre nedsenking, plater bør ikke stå i løsemiddel over natten. Immersions lengre enn 4 h kan forårsake skal koble fra platen oppbakking og føre til tap av signal.
    3. Fjerne platen fra kromatografi tanken og plassere den på en Borstemmaskin hjell.
    4. La platen til luften tørr over natten.
      Merk: Tørke kan akselereres ved bruk av hårtørker. Tørrhet kan vurderes av fargen på harpiks, som vil mørkere når det er vått og gå tilbake til fargen på en ubrukt plate når helt tørt.
    5. Etter at platen er tørr, Pakk platen i plastfolie å unngå overføring av radioaktivt materiale til tenkelig kassetten og analysere ved autoradiography (Figur 3).
  4. Dataanalyse
    1. Utsett PEI innen platen inneholder atskilt reaksjoner på en phosphorimager kassett 4 h ved romtemperatur.
      Merk: Dette er nok eksponering å gi et klart bilde ved hjelp av de angitte konsentrasjonene av fersk γ -32P-ATP. Hvis du lavere mengder radiolabelled substrat, kan eksponeringstid økes til 12-16 h.
    2. Bilde kassetten på en phosphorimager.
    3. Bruker programvare med et grafisk brukergrensesnitt, trekke områder av interesse (ROIs) ved å velge Tegn rektangel og bruke musen til å tegne rektangulære ROIs rundt en hel lane og ATP og ppGpp steder innenfor det lane (Figur 3 ).
    4. Bruke Velg, kopiere og lime inn kommandoene (eller tilsvarende kommandoene basert på tenkelig programvare brukes) å trekke identiske ROIs i den andre baner for å sikre at ROIs måler signal i identiske områder i hver fil. Inkludere ROIs fra en ubrukt lane, som tomme.
    5. Ved hjelp av analysere | Verktøy | ROI Manager | Legge til kommandoer av tenkelig programvare, velger du alle ROIs trukket på PEI cellulose tallerkenen.
    6. Ved hjelp av analysere | Angi mål | Tiltak kommandoer, kvantifisere signal intensiteten i hver avkastning og eksportere målingene som regneark (Figur 3). Trekk tomme ROI verdier fra experimental signaler.
    7. Beregne prosentandelen av borte i hver bane er tilskrives ATP og ppGpp ved hjelp av formlerEquation
      Merk: ROIs kan tegnes og quantitated kommersielle programmer kompatible med phosphorimager eller fritt tilgjengelig ImageJ programvare (National Institutes of Health).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi presenterer en metode for affinitet rensing av en (p) ppGpp synthetase fra Clostridium difficile og vurdering av den enzymatiske aktiviteten. Figur 1 viser protein rensing av metall affinitet kromatografi. Andre elueringsrør (E2) brøken fra denne renselsen var dialyzed og brukes for enzymatiske aktiviteten analysen. Figur 2 viser de nødvendige skritt for å forberede og gjennomføre pyrophosphotransferase analyser av tynt lag kromatografi. Figur 3 viser hvordan data fra disse eksperimentene er quantitated med vekt på riktig blanking og konvertering av signal til prosenter. I figur 4Apresenterer vi en representant TLC autoradiograph en (p) ppGpp synthetase analysen bruker renset RSH, en C. difficile (p) ppGpp synthetase. Første sted plasseringen, ppGpp og ATP flekker er tydelig på autoradiograph, som er solvent fronten som er synlig fordi det inneholder sporstoffer mengder radiolabeled uorganiske fosfat. Molekyler med mer fosforsyre moieties viser mindre mobilitet fra den første spot plasseringen, som de har større molekylvekt og negative ioniske ansvaret; Dette hindrer mobilitet på den grunnleggende PEI-cellulosevatt. I løpet av 120 min på 37 ° C, ppGpp akkumulering og ATP uttømming er ubetydelig i reaksjoner mangler synthetase enzymet, mens både ATP uttømming og ppGpp akkumulering er åpenbart i nærvær av RSH figur 4A). Figur 4B viser absolutt ATP og ppGpp signalene fra fire eksperimenter. Figur 4C viser de samme dataene som figur 4B med absolutt signaler konvertert til prosent av det totale radioaktivt signalet. Dette minimerer unøyaktigheter på grunn av pipettering feil og/eller radioaktivitet og gjør at data fra eksperimenter utført på forskjellige dager til samordnes uten introdusere usikkerhet til dataene.

Figure 1
Figur 1: nikkel affinitet rensing av RSH. En Coomassie-farget SDS side gel viser lysate (L) og sentrifugeres lysate (CL) indusert BL21 pMMB::rsh-his6 samt gjennomflytsenhet (FT), vaske 1 (W1), vask 2 og elueringsrør (E1 og E2) fraksjoner etter nikkel affinitet rensing. E2 brøken var dialyzed og brukes for påfølgende enzymatisk analyser. Molekylvekt av protein størrelse vises til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse av TLC plater. (A) plater er vasket i én dimensjon ved å plassere den nederste kanten i vannet (blå). Forurensninger (gul) migrere til toppen av platen med løsemiddelet. (B) etter en plate er tørket helt, det vasket i en andre dimensjonen ved å rotere det 90 grader i forhold til første vask og igjen tillater vannet å migrere til toppen av platen. (C) etter vask, alle forurensninger er isolert i ett hjørne av platen. Harpiks av en vasket TLC plate kan være merket forsiktig med en myk blyant å indikere hvor prøver bør være oppdaget. For 2 μL prøver sikrer minst 1 cm mellom flekker tilstrekkelig utvalg separasjon. Eksempler er oppdaget 2 cm fra 'bunn' av platen. Etter eksempelprogram, som løsemiddel kan kjøre til de 'toppen' hvor eventuelle forurensninger vil ha blitt isolere av vann vasker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Signal kvantifisering. Områder av interesse (ROIs) definerer totalt, vises ATP og ppGpp signal for en tom kjørefelt og en eksperimentell lane. Signalet intensiteten i hver tomme ROI trekkes fra experimental verdien og ATP og ppGpp signalene blir normalisert til totale signalet bruker ligningene vist å presentere andelen totale radioaktivt signalet tilskrives ATP og ppGpp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Autoradiograph av en representant TLC plate: (A) dette bildet viser løsemiddel foran ATP og ppGpp første spot steder av en reaksjon utført med renset C. difficile RSH. En kontroll reaksjon som inneholder ingen protein (n.p.) lar kvantifisering av uncatalyzed ATP hydrolyse mens en tom kjørefelt gjør nøyaktig signal kvantifisering. (B) absolutt signal intensiteter av ATP og ppGpp under 120 minutter med inkubering med C. difficile RSH. Vises midler og standardavvik av fire uavhengige eksperimenter. (C) av samme data fra (B) med ppGpp signal presentert som en prosent av det totale radioaktivt signalet. ppGpp opphopning i ingen protein (n.p.) kontroll reaksjonen vises i svart. Vises midler og standardavvik to uavhengige eksperimenter med to tekniske gjentak hver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi rensing av hans-merket RSH fra C. difficile og presentere en metode for aktivitet kvantifisering bruker radiolabeled tynt lag kromatografi. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere diguanylate cyclase enzymer fra C. difficile, samt nucleotide cyclase (p) ppGpp synthetase, kinase og fosfodiesterase enzymer fra andre organismer11,12 ,13,21. Metoden er ikke ny, det er grovt gjelder for mange typer av analysen, og vi håper forskere vil finne sin presentasjon i videoformat nyttig.

De viktigste trinnene i protokollen er protein rensing (trinn 2.1.3–2.1.10), reaksjon forberedelse for tynt lag kromatografi (trinn 2.2-2.3) og dataanalyse (trinn 3.4). Vi har funnet følgende endringer er spesielt nyttig: tillegg av MgCl2 bufferne brukes for nikkel kolonnen rensing (trinn 2.1.3–2.1.10) er avgjørende for den enzymatiske aktiviteten av renset protein og presentasjonen av de enzym aktivitetsdata som % ppGpp produsert heller enn absolutt ppGpp produsert sikrer dataene samles inn på ulike dager, med forskjellige γ-32P-ATP er konsekvente. Denne metoden er tilgjengelig for noen forskningsgruppe med tilgang til en phosphorimager, og dataanalyse er grei. Ved quantitating phosphotransfer aktivitet som en prosentandel av 32P konverteres til ppGpp, vi sikre data reproduserbarhet. Fordi liten reaksjon volumer er oppdaget på PEI innen platene, er det betydelig potensial for liten pipettering unøyaktigheter å innføre betydelig feil i absolutte antallet γ -32P-ATP eller 32P-ppGpp i en gitt kjørefelt er uavhengig av det totale signalet tilstede på TLC platen, men fordelingen av radioaktivt signalet mellom mulige former. I tillegg kan det totale radioaktivt signalet i en gitt kjørefelt avhenger av alderen av γ -32P-ATP brukes i eksperimentet. 32 P har en halveringstid 14,3 dager, så uavhengige analyser utført flere dager fra hverandre kan vise betydelige forskjeller i total radioaktivt signalet oppdaget men de relative mengdene av radiolabeled ATP og ppGpp bare avhengig enzym aktivitet. Presentere dataene som "prosent ppGpp" i stedet for absolutte ppGpp hindrer signal innføring av tilfeldig støy fra pipettering feil eller radioaktivitet. Dette illustreres av forskjellene mellom figur 4B og 4 C. Begge vise midler og standardavvik av dataene fra den samme fire eksperimenter, men dataene i figur 4C har blitt normalisert på totalt radioaktivt signalet.

Vi har funnet ut at C. difficile RSH enzymet er en funksjonell ppGpp synthetase i vitro, i stand til rask pyrophosphotransfer fra en ATP-phosphodonor og en BNP acceptor. Denne reaksjonen er avhengig av magnesium, som koordinerer ATP og guanosine binding av RSH familie enzymer22. Vi har endret produsenten protokollene for nikkel affinitet kromatografi med 5 mM MgCl2 i lyse og vaskebuffere som tilsettes buffer fordi vi har funnet at rensing i fravær av magnesium er skadelig for den enzymatisk aktivitet av renset protein. Dette tyder på at magnesium ioner kan spille en ikke-pådriverrolle i å stabilisere protein strukturen i fravær av nukleotid bindende, men ytterligere strukturelle karakterisering vil være nødvendig å bekrefte dette.

Vi vet, dette arbeidet er den første publiserte rapporten for ppGpp syntese i C. difficile og angir at denne organismen er sannsynlig å utnytte (p) ppGpp-mediert strenge svar for å overleve ekstracellulære stress. (p) ppGpp metabolisme har aldri før blitt rapportert i denne viktig human patogen. At strenge svaret er involvert i utholdenhet i mange andre patogener, er det sannsynlig at (p) ppGpp-mediert signalering kan spille en rolle i høyt stress toleransen C. difficile celler og høy tilbakefall av C. difficile infeksjon23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NIAID 1K22AI118929-01. EBP ble støttet av en sommer forskning Fellowship Program stipend fra Office for forskning ved Old Dominion University i Norfolk, Virginia, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon utstede 141: Protein rensing histidin merke (p) ppGpp tynt lag Ture radionuklidenes merking pyrophosphokinase phosphotransfer
En rensing og <em>I Vitro</em> aktivitet analysen for en (p) ppGpp Synthetase fra <em>Clostridium difficile</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter