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Medicine

In-vitro- Methode zur Kontrolle Konzentrationen Halogenkohlenwasserstoffe in kultivierten alveolären Epithelzellen

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Wir beschreiben eine einfache Protokoll speziell für die präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in-vitro- zu erreichen, um unser Verständnis der Mechanismen der epithelialen Lungenversagen zu verbessern und Roman testen Therapien für akute Atemnotsyndrom.

Abstract

Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein Syndrom der diffuse alveoläre Schädigung mit eingeschränkter alveoläre Flüssigkeit Clearance und schwere Entzündungen. Die Verwendung von halogenierten Substanzen wie Sevofluran oder Isofluran, für die Sedierung von Patienten der Intensivstation (ICU) kann verbessern Gasaustausch, alveoläre Ödem reduzieren und dämpfen Entzündungen bei ARDS. Es fehlen jedoch Daten über die Nutzung der inhalierten Mittel zur kontinuierlichen Sedierung auf der Intensivstation zu Lungenschäden vorzubeugen oder zu behandeln. Um die Auswirkungen von halogenierten Agenten auf alveolären Epithelzellen "physiologischen" Bedingungen zu untersuchen, wir beschreiben ein einfaches System für Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit und setzen sie an halogenierten Agenten bieten präzise kontrollierte "Luft" Brüche und "Medium" Konzentrationen für diese Mittel. Wir entwickelten eine versiegelte luftdichten Kammer in der Platten mit menschlichen alveoläre verewigt Epithelzellen einen präzisen, kontrollierten Bruchteil von Sevofluran oder Isofluran verwenden einen kontinuierlichen Gasstrom durch eine Narkose Maschine-Schaltung zur Verfügung gestellt ausgesetzt sein könnten. Zellen wurden 24 Stunden lang 4 % Sevofluran und Isofluran 1 % ausgesetzt. Gas-Massenspektrometrie wurde durchgeführt, um die Konzentration der halogenierten Wirkstoffe gelöst in das Medium zu bestimmen. Nach dem ersten waren Stunden, die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran mittelfristig 251 mg/L und 25 mg/L, bzw.. Die Kurven der Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran aufgelöst in das Medium zeigten ähnliche Kurse im Laufe der Zeit mit einem Plateau erreicht eine Stunde nach der Exposition.

Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in Vitro , unser Verständnis der Mechanismen, die in epithelialen Lungenschädigung bei ARDS zu verbessern und neue Therapien für test erreichen die -Syndrom.

Introduction

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Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein klinisches Syndrom gekennzeichnet durch diffuse alveoläre Schädigung, Lungenödem und Linksventrikuläre respiratorische Insuffizienz. Obwohl ARDS mehr als 10 % der Intensivstation (ICU) Kinobesuche und fast 25 % der ICU-Patienten, die eine mechanische Lüftung darstellt, ist es noch ein unter anerkannten Herausforderung für Kliniker, mit einer Krankenhaus-Mortalität von 35-45 %1. Trotz intensiver Forschung ist die Identifizierung eines effektiven ARDS pharmakologische Therapie oder Prävention bisher fehlgeschlagen. Zwei wichtige Funktionen tragen zur Mortalität bei ARDS: alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC) (d. h. die veränderte Resorption der alveoläre Ödem Flüssigkeit aus Lufträume distal Lunge) und schwere Entzündungen2beeinträchtigt. Da ARDS Sterblichkeit hoch bleibt, gehört aktuellen Initiativen auch Primärprävention; Allerdings ist eine zentrale Herausforderung zur Identifizierung von Risikopatienten in denen ARDS voraussichtlich entwickeln wird und wer profitieren würde, wenn ARDS vereitelt werden konnten.

Flüchtigen halogenierten Anästhetika Sevofluran und Isofluran, sind weit verbreitet in Vollnarkose im OP-Saal zur Verfügung stellen. Weltweit mehr als 230 Millionen Patienten, die eine größere Operation jährlich erfordern allgemeine Anästhesie und Beatmung3, und klinische Ergebnisse und Gesundheitswesen Auslastung4 postoperative pulmonale Komplikationen beeinträchtigen . Die Verwendung von Sevofluran anstelle von Propofol wurde verbesserte Lungenentzündung bei Patienten mit Thoraxchirurgie und signifikante Abnahme der Nebenwirkungen wie ARDS und postoperativen pulmonalen Komplikationen5zugeordnet. In ähnlicher Weise hatte eine Vorbehandlung mit Isofluran schützende Wirkung auf die Atemwege Mechanik, Sauerstoffversorgung und Hämodynamik in experimentellen Tiermodellen von ARDS6,7. Obwohl weitere Studien die Auswirkungen von inhalativen Agenten auf die Ergebnisse im noncardiac Surgery gerechtfertigt sind, ist eine ähnliche Abnahme der pulmonalen Komplikationen in einer Meta-Analyse zeigt, dass inhaliert Anästhetika kürzlich beobachtet worden – als gegen eine intravenöse Anästhesie – sind signifikant assoziiert mit einem Rückgang der Sterblichkeit für Herzchirurgie8.

Prospektive Daten über den Einsatz von volatilen Agenten für die Sedierung von Intensivpatienten zur Vorbeugung oder Behandlung Lungenschäden fehlt. Jedoch mehrere Studien unterstützen die Wirksamkeit und Sicherheit von inhalativen Sevofluran jetzt für die Sedierung von Intensivpatienten und präklinische Studien haben gezeigt, dass inhalierte Sevofluran und Isofluran7,9 Gasaustausch verbessern, reduzieren alveoläre Ödem und abschwächen Entzündungen in experimentellen Modellen des ARDS. Darüber hinaus verringert Sevofluran Typ II Epithelzelle Schaden10, während Isofluran die Integrität der Alveolar-Kapillare Barriere durch Modulation der tight Junction Protein11unterhält. Allerdings sind weitere Studien notwendig, um zu überprüfen, inwieweit der experimentelle Nachweis der Orgel Schutz von inhalativen Sevofluran und Isofluran auf den Menschen übersetzt werden könnte. Eine erste Single-Center randomisierte kontrollierte-Studie (RCT) aus unserer Gruppe festgestellt, dass frühe Verwendung von inhalativen Sevofluran bei Patienten mit ARDS verbesserte Sauerstoffversorgung, verringerte Niveaus von einigen Pro-inflammatorische Marker und reduzierten Lunge epithelialen zugeordnet wurde Schaden Sie, wie die Ebenen der löslichen Form des Rezeptors für advanced Glycation Endprodukte (sRAGE) im Plasma und alveoläre Flüssigkeit12bewertet.

Zusammengenommen könnten die wohltuende Wirkung von Sevofluran und Isofluran auf Lungenschädigung verweisen auf mehrere biologischer Signalwege oder Funktionsabläufe, die abhängig von der Wut Weg sind nämlich alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC), epitheliale Schädigung, Translokation des nuclear Factor (NF)-κB, und Makrophagen Aktivierung. Darüber hinaus kann Sevofluran Ausdruck der Wut-Protein selbst beeinflussen. Da frühere Forschungen durch unser Research-Team und andere entscheidende Rollen für RAGE in alveoläre Entzündung und Lunge epithelialen Verletzungen/Reparatur bei ARDS unterstützt, entwarfen wir ein experimentelles Modell zum translational Verständnis der Mechanismen der Sevofluran in Lunge Schädigung und Reparatur13,14,15. Die in-vitro- Effekte von Sevofluran und Isofluran wurden in einer neuartigen menschlichen alveoläre epithelialen Primärzelle Linie speziell entwickelt, um die Luft-Blut-Schranke der peripheren Lunge, hAELVi (menschlichen alveoläre epithelialen LentiVirus Studie untersucht. verewigt), mit alveolären Typ-ähnliche Eigenschaften einschließlich funktioneller enge Kreuzungen16.

Während der Vorbereitung des Design unserer in-vitro- Untersuchungen (z. B. Kulturen der alveolären Epithelzellen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit mit der Exposition gegenüber "inhaliert" Sevofluran oder Isofluran, verstanden wir aus bisher veröffentlichten Studien, die Bruchteile von Sevofluran sind nur in der "Luft" Schnittstelle17,18,19 mit standard-Monitore (ähnlich denen in einer klinischen Einstellung) untersucht worden. Halogenierte Agent-Konzentrationen wurden in der Regel nach die minimale alveoläre Konzentration (MAC)-Werte gewählt (z. B. beim Menschen, für Sevofluran, 0.5, 1,1 und 2,2 vol%, Vertreter, 0.25, 0.5 und 1 MAC; für Isoflurane, 0.6, 0.8, und 1.3 vol% repräsentieren jeweils 0,25, 0,5 und 1 MAC)20. Sevofluran und Isofluran-Konzentrationen wurden in der Tat nie in das Kulturmedium selbst, wodurch die Gültigkeit des früheren experimentelle Modelle/Instrumenten untersucht. Darüber hinaus verwendet die meisten Experimente eine anaerobe Glas, die versiegelt wurde, nachdem die Luft Mischung mit Sevofluran im Inneren gespült hatte. Da unser Ziel war es, alveoläre Epithelzellen "physiologischen" Bedingungen zu studieren, glaubten wir, dass ein anaerober Zustand möglicherweise nicht optimal und wäre nicht kompatibel mit lange experimentelle dauern. Daher wir unser eigenes System auf Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit entwickelt und setzen sie auf halogenierte Agenten (Sevofluran und Isofluran) mit dem Ziel, präzise kontrollierte "Luft" Brüche und "mittlere" Konzentrationen für diese Mittel. Unserer Meinung nach ist dieser experimentellen Schritt, der bisher in der Literatur nicht beschrieben hat, vor jeder weiteren in-vitro- Untersuchungen von Sevofluran und Isofluran obligatorisch.

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Protocol

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(1) Kultur der alveolären Epithelzellen (hAELVi)

  1. Auftauen
    1. 4 mL Anbau Ready-to-Use menschlichen alveoläre epithelialen (HuAEC) Medium in ein Kunststoffrohr 15 mL Pipette und schnell Auftauen das Fläschchen in einem vorgeheizten Wasserbad (37 ° C).
    2. Übertragen Sie die aufgetauten Zellsuspension auf einer 15 mL-kunststofftube mit 4 mL des Mediums vor die Röhre bei 200 X g für 5 min zentrifugieren.
    3. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL des Mediums Anbau. Übertragen Sie anschließend die Zellen auf einem T25-Kolben.
    4. Pflegen Sie die Zellen unter Standardbedingungen (5 % CO2, 95 % befeuchteten Luft, 37 ° C)
  2. Aufteilung
    1. Überprüfen Sie den Status der Zellen mikroskopisch. Wenn die Zellen 80-90 % Zusammenfluss sind, teilen Sie die Zellen, folgende Schritte 1.2.2 durch 1.2.10.
    2. Die Anbau-Medien der Zellen mit einer sterilen Pipette abzusaugen.
    3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 4 mL des Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und Aspirieren Sie des DPBS.
    4. Fügen Sie 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung (TE), die Zellen vor der Inkubation bei 37 ° C für 3 Minuten, bis die Zellen beginnen sich zu lösen; Suchen Sie nach Ablösung unter dem Mikroskop.
    5. Die Zellen mit 2 mL des Kulturmediums aufschwemmen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Dann Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet wieder mit 3 mL des Mediums Anbau.
    6. Verwenden Sie Trypan blauen Farbstoff Ausschluss Test um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Nehmen Sie 30 µl Zellsuspension und 30 µl eine 0,4 % ige Lösung von Trypan blau in einem Rohr. Danach mischen Sie effektiv die Lösung 3-bis 5-Mal mit einer 100 µl Pipette. 10 µl der Lösung nehmen und legte es unter dem Deckglas der Hemocytometer.
    7. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen und die Anzahl der toten Zellen in den Bereichen der Hemocytometer (blau). Dann berechnen die Zellviabilität [%] unter Verwendung der Gleichung: Zelle überleben = 100 – (100 / Gesamt-Anzahl der Zellen x Anzahl der toten Zellen)
    8. Übertragen Sie die aliquoten mit Pellet resuspendierte Zelle auf eine neue Zelle Kultur T25 Kolben oder 6 Well-Platte. Die Zellen, die insgesamt 5 mL Anbau Medium in den T25-Kolben oder 1 mL für jedes gut die 6 Well-Platte zu erreichen fügen Sie das Anbau-Medium hinzu.
    9. Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator unter Standardbedingungen (5 % CO2, 95 % befeuchteten Luft, 37 ° C)
    10. Sobald die Zellen vollständig konfluierende, sind sie bereit für das Experiment.

2. Vorbereitung einer luftdichten Kammer

Hinweis: Der Bauplan für den luftdichten Kammer ist in Abbildung 1. dargestellt.

  1. Verwenden Sie einen hermetischen Polypropylen Karton mit einer Kapazität von 6,5 L. Länge, Breite und Höhe sind 30 x 20 x 15,5 cm, beziehungsweise. Bitte beachten Sie, dass das Volumen des Quaders ist niedriger als die theoretische Volumen aufgrund der abgerundeten Ecken.
  2. Bohren Sie ein Loch mit Durchmesser 2,5 cm auf der Unterseite der seitlichen Wand.
  3. Legen Sie ein Wellrohr mit einer grünen Markierung, die dienen als das Gas-Luft Gemisch Eingang Rohr, und mit Silikon abdichten.
  4. Eine zweite 2,5 cm Durchmesser Bohrung auf der Oberseite der gegenüberliegenden seitlichen Wand zu bohren.
  5. Legen Sie ein weiteres Wellrohr mit einem roten Kennzeichen und verbinden Sie es mit einem Aktivkohlefilter, dienen als das Gas-Luft Gemisch Ausgang Rohr, und mit Silikon abdichten.
  6. Bohren Sie ein Loch mit knapp 4 mm Durchmesser in der Mitte der mittleren Wand der Box.
  7. Legen Sie kurze Infusion Schlauch, der verbunden ist an einen Verteiler mit einem rotierenden männlichen Luer-Lock, die wird in einem Gasanalysator angeschlossen werden und mit Silikon abdichten.
  8. Platzieren Sie ein digitales Thermometer/Hygrometer in der luftdichten Kammer.

3. setzen Sie alveoläre Epithelzellen zu halogenierten Agenten (Sevofluran und Isofluran)

Hinweis: Eine schematische Zeichnung des Gerätes ist in Abbildung 2. dargestellt.

Vorsicht: Obwohl tierexperimentelle Studien keine Hinweise auf fetale Schaden oder Beeinträchtigung der Fortpflanzungsfähigkeit ergaben, und eine sehr kleine Studie beim Kaiserschnitt kein unerwünschten Auswirkungen auf die Mutter und Fötus zeigen, halogenierte die Sicherheit der Verwendung (z. B. Agenten Sevofluran oder Isofluran) während der wehen und der Geburt hat bis heute nicht nachgewiesen wurde. Während menschliche Schwangerschaften wurden darüber hinaus keine kontrollierten Daten gesammelt. Deshalb experimentieren mit Sevofluran oder Isofluran während Schwangerschaft abgeraten werden sollte.

  1. Arbeiten Sie unter einer Labor-Dunstabzugshaube.
  2. Anpassen einer Narkose Maschine-Schaltung um die Gasleitung von Lachgas durch Kohlendioxid (CO2) zu wechseln.
  3. Die maßgeschneiderte Narkose Maschine Schaltung stecken Sie die luftdichten Kammer mit dem grün markiert, gewellte Rohr. Legen Sie einen beheizten Luftbefeuchter (z. B. auf ICU Ventilatoren verwendet) in das Rohr zwischen die Narkose Maschine und luftdichten Kammer fließen Gasgemisch auf etwa 37 ° C erwärmen
  4. Installieren die luftdichten Kammer auf einer heißen Platte, Bereitstellung einer Heizung Platte Temperatur von 37° C.
  5. Setzen Sie die 6 Well-Platte mit hAELVI Zellen in der luftdichten Kammer und den Deckel verschließen.
  6. Regulieren Sie die Gas-Durchflussmengen (d. h. das Gemisch aus Luft und CO2) um die Standardbedingungen, definiert als 5 % der CO2 und 95 % der befeuchteten Luft schnell zu erhalten.
  7. Die halogenierten Agent Verdampfer zu öffnen und wählen Sie den gewünschten Prozentsatz (in der vorliegenden Studie getesteten Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran waren 4 % und 1 %, beziehungsweise).
  8. Beachten Sie die Zusammensetzung der Mischung und Sevofluran oder Isofluran Gaskonzentration als durch eine externe Gasanalysator gemessen und angezeigt auf dem Bildschirm.
  9. Sobald die Zielwerte erreicht werden, reduzieren Sie das frische Gas-Durchfluss auf 1 L/min.
  10. Die luftdichten Kammer kann mit diesem Gas-Durchfluss so lange wie nötig für das Experiment aufrechterhalten werden.

4. Messen Sie Sevofluran oder Isofluran durch Chromatographie

  1. Vorbereitung der Proben
    1. Zu verschiedenen Zeitpunkten, ganz kurz öffnen die Kammer, die untersuchten Proben zu nehmen (in der vorliegenden Studie verwendet eine 6-Well-Platte) und schließen Sie den Deckel. Halten Sie die anderen Proben im Feld. Aspirieren Sie dann 1 mL des Mediums in jeder Probe mit einer mehrbändigen einstellbare Mikropipette enthalten.
    2. Legen Sie das Medium in 10 mL Headspace Chromatographie Fläschchen, die hermetisch dicht mit einer Teflon versiegelte Kappe geschraubt werden sollten. Frieren Sie die Chromatographie-Fläschchen bei-20 ° C, wenn Sie sie nicht sofort verwenden.
    3. Bereiten Sie eine Stammlösung von Sevofluran und eine weitere Stammlösung von Isofluran, jeweils 50 g/L in Methanol. Bereiten Sie gleichzeitig eine Stammlösung Chloroform (interner Standard, IS) bei 2 g/L in Methanol. Speichern Sie alle standard-Lösungen bei-20 ° C.
    4. Bereiten Sie funktionierende Lösungen von Sevofluran und Isofluran bei 50, 500 und 5000 mg/L in hochreinem Wasser/Dimethyl Sulfoxyde (50/50; V/V). Für interne Standardisierung wird die Arbeitslösung bei 100 mg/L in Methanol fixiert.
  2. Analyse der zellulären Muster
    Hinweis: Die Extraktionsverfahren basiert auf den zuvor validierten Methode von Gaschromatographie und Massenspektrometrie von Bourdeaux Et al. 1 und verwendet die gleichen Parameter der Sensibilität und Spezifität. Sevofluran und Chloroform (IS) dienten in diesem Protokoll und Isofluran wurde im Zusammenhang mit der multiparametric Analysemethode. Kurz, für Massenspektrometrie Erwerb, wurde die Methode nach der reinen Lösung Injektion entwickelt. Dann wurde m/Z mit Referenzstandards und Literaturdaten bestätigt. Drei m/Z wurden ausgewählt, für jeden Analyten (außer IS): 1 m/Z zur Quantifizierung (die am häufigsten vorkommende und höher), für die Fülle wurde durch die Integration der Fläche unter der Kurve für die Quantifizierung berechnet und zwei m/Z zur Bestätigung. Mit drei m/Z, konnten Analyten speziell dann identifiziert werden, weil alle m/Z hatte die selben Retentionszeit, als auch weil alle Beträge in m/Z (Verwandter von Ionen-Bestätigung vs. Quantifizierung) waren die gleichen in der reinen Norm und in allen Proben. Mit diesem Erwerb Modus könnte Analyten identifiziert und quantifiziert mit guter Spezifität.
    1. Konstruieren ein 8-zackiger Kalibrierkurven mit Konzentrationsbereiche von 0,5-400 mg/L und mehrere Qualität steuert (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 und 400 mg/L).
      Hinweis: Um jede Kalibrierung zu validieren, wurden vier Qualitätskontrollen verwendet: die untere Grenze der Quantifizierung (C1 = 0,5 mg/L), zwei intermediate level (C2 = 20 mg/L und C3 = 75 mg/L) und die letzte Stufe (C4 bei 400 mg/L; obere Ebene der Quantifizierung). Alle Standards und Kontrollen wurden analysiert in kultivierten Zellen Matrizen, Matrix-Effekt zu vermeiden. Für jede Kalibrierkurve wurde eine leere Matrix analysiert, um überprüfen, ob gab es keine Interferenzen mit kultivierten zelluläre und internen Standards.
    2. Bereiten Sie eine Stammlösung von Sevofluran und eine weitere Stammlösung von Isofluran, jeweils 50 g/L in Methanol. Bereiten Sie gleichzeitig eine Stammlösung Chloroform (interner Standard, IS) bei 2 g/L in Methanol. Speichern Sie alle standard-Lösungen bei-20 ° C. Dann bereiten Sie funktionierende Lösungen von gemischten Sevofluran/Isofluran bei 50, 500 und 5000 mg/L im Reinstwasser / Dimethyl Sulfoxyde (50/50; V/V). Ist wird die Arbeitslösung bei 100 mg/L in Methanol verdünnt.
    3. Kalibrierkurven und Kontrollen Vorbereitung der Proben durch einen 50 µL der IS (100 mg/L) in 1 mL der zellularen Probe Matrizen.
    4. Bereiten Sie Beispiellösungen mit 200 µL des gesättigten Natrium-Chlorid-Wasser-Lösung in einem 10 mL-Headspace-Rohr, hermetisch verschraubt mit einer Teflon versiegelte Kappe.
  3. Gaschromatographie und Massenspektrometrie
    1. Analyseergebnisse verwenden Sie Headspace-Injektionen in einer Gaschromatographie gekoppelt mit der Masse Nachweisverfahren.
    2. Führen Sie Headspace-Röhrchen für 10 min bei 80 ° C mit Heizung Shaker. Dann zurückziehen und 1,5 mL der Gasprobe in den Gaschromatographen injizieren. Legen Sie den Parameter des Injektors bei 260 ° C mit einem Split-Fluss bei 100 mL/min, 2 min zu Beginn des Laufs Chromatographie.
    3. Verwenden Sie Split/splitless Injektor mit einem Träger-Modus programmiert-Druck. Erstens halten Sie den Gasdruck 40 kPa für 0,15 min. Dann erhöhen Sie den Preis Programm Druck bis 150 kPa bei 125 kPa/min vor dem Einstellen einer Rate von 16 kPa/min 300 kPa Druck für 5 Minuten.
    4. Simultan auf die Injektion beginnen mit einer Temperatur von 60 ° C für 1 min und Steigerung, bis eine Temperatur von 140 ° C mit einer Rate von 20 ° C/min erreicht wird. Dann steigen Sie die Temperatur wieder, bis 250 ° C erreicht ist. Die Gesamtzeit des Laufs ist 7 min.
    5. Die Chromatographie-Trennung mit einer fused-Silica Kapillaren Spalte (30 m x 1,4 µm, 0,25 mm ID) durchführen. Durchführen Sie Masse Experimente mit einem einzelnen Ion Zustandsüberwachung (SIM) und überwachen Sie Ion Quantifizierung m/Z 181 und Ion Qualifikationen m/Z 151 und 51 gleichzeitig eine Retentionszeit (RT) von 2,30 min für Sevofluran, m/Z 149 (Ion Quantifizierung), m/Z 115 und 87 (ion Qualifikationen) für Isofluran bei RT 2,8 min und m/Z 83 (Ion Quantifizierung) wie Chloroform bei RT 3.70 min..
    6. Bestimmen Sie die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran in der Zellkultur durch ihre Flächenverhältnisse derjenigen der IS mit einem Gewicht quadratische Passform. Die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) für Sevofluran und Isofluran war bei 0,5 mg/L und die obere Grenze der Quantifizierung (ULOQ) 400 mg/L.

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Representative Results

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Die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran, die das Medium im Laufe der Zeit aufgelöst, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2, ausgewiesen.

Die Kurse der Sevofluran und Isofluran Konzentrationen im Medium waren im Laufe der Zeit ähnlich. Unmittelbar nach die erforderliche Konzentration von halogenierten Agent festgelegt wurde, erhöhte Konzentrationen im Laufe der ersten Stunde. Dann wurde ein Plateau erreicht, die beibehalten, bis die Verwaltung von halogenierten Agent beendet wurde. Nach Unterbrechung der Verwaltung verringerte Konzentrationen innerhalb einer Stunde (Abbildung 3).

Nach dem ersten waren Stunden, die mittlere Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran mittelfristig 251 mg/L und 25 mg/L, beziehungsweise. Zwischen den verschiedenen Experimenten ergab sich kein signifikanter Unterschied.

Figure 1
Abbildung 1: Bauplan der luftdichten Kammer Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Zeichnung des Gerätes Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Konzentration von Sevofluran (n = 5) und Isofluran (n = 5) im Laufe der Zeit. A) Konzentration von halogenierten Agent im Laufe der Zeit. Werte werden ausgedrückt in mg/L. Werte werden ausgedrückt in Mittelwert und SEM. B) Konzentration von halogenierten Agent im Laufe der Zeit für jedes Experiment. Wert werden ausgedrückt in mg/L. C) Bruchteil der halogenierten Agent im Laufe der Zeit in der luftdichten Kammer gemessen an der Gas-Analyzer. Werte werden in Prozent angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zeit Konzentration von Sevofluran im medium Bruchteil der Sevofluran
(mg/L) in der luftdichten Kammer
Median IC (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (Haltestelle) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 min 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stop + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tabelle 1: Konzentrationen von Sevofluran in das Medium im Laufe der Zeit aufgelöst. Numerische Daten sind als Mittelwert mit interquartilbereich für die Konzentration und als Prozentsatz für den Bruchteil ausgedrückt. IQR (für quartilabstands)

Zeit Konzentration von Isofluran in das medium Bruchteil der Isofluran
(mg/L) in der luftdichten Kammer
Median IC (%)
5min 2 [2 - 2.5] 0,8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0,9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (Haltestelle) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5min 19 [12 - 25] 0
Stop + 30min 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabelle 2: Konzentrationen von Isofluran in das Medium im Laufe der Zeit aufgelöst. Numerische Daten sind als Mittelwert mit interquartilbereich für die Konzentration und als Prozentsatz für den Bruchteil ausgedrückt. IQR (für quartilabstands)

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Discussion

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Unser Protokoll beschreibt eine einfache Methode um Zellen auf einen genauen Bruchteil eines halogenierten Anästhetikum wie Sevofluran und Isofluran verfügbar zu machen. Darüber hinaus berichten wir hier – zum ersten Mal – eine strenge Korrelation zwischen der Gas-Anteil und die Konzentration von Sevofluran und Isofluran in das Kulturmedium selbst. Dieser grundlegende Schritt ermöglicht jetzt sicher unsere luftdichten Kammer nutzen, um die Auswirkungen dieser halogenierte Stoffe in einer kultivierten Monoschicht der menschlichen alveolären Epithelzellen zu studieren.

Derzeit nutzen die meisten Forschungsteams, die die Effekte von Sevofluran in alveoläre Zellen ein Glas, das zuerst mit halogenierten Gas gesättigt ist und anschließend versiegelt. In diesem Fall Sevofluran verstoffwechselt werden kann, und es könnte spekuliert werden, dass der Anteil der flüchtigen Agent führt zu einer instabilen Gaskonzentration linear im Laufe der Zeit verringern kann. Die Korrelation zwischen den Gas-Bruch von Sevofluran und seine Konzentration in das Kulturmedium ist jedoch nicht klar in der Literatur beschrieben. In der Regel die Konzentration von Sevofluran in diesen Experimenten verwendeten Wahl basiert auf eine einfache Beziehung zwischen den Gas-Anteil und den Mac. MAC wurde im Jahre 1965 eingeführt und ist die Konzentration von Dampf in der Lunge, die benötigt wird, um zu verhindern, dass eine motorische Reaktion (Bewegung) bei 50 % der Probanden als Reaktion auf eine chirurgische Reiz (Schmerzen)22. MAC wird verwendet, um die Stärke oder die Potenz der betäubenden Dämpfe zu vergleichen. Bei Intensivpatienten ist MAC, FeSevo und der klinischen Richmond Bewertung Agitation-Sedation Scale (RASS)23korreliert. Obwohl es ein nützlicher Indikator in der täglichen klinischen Praxis ist, ist die Bedeutung dieses Parameters nie in der Umgebung von experimentelle in Vitro Forschung. untersucht worden In unserem Protokoll anhand Chromatographie Analysen des Mediums, wir die genaue Korrelation zwischen der Sevofluran enthalten in der Gas-Fraktion und der Sevofluran aufgelöst in das Medium. Mit dieser Methode die spezifische Wirkung eines flüchtigen Agenten ausgedrückt entsprechend der realen Konzentration im Medium anstatt basierend auf der Annäherung an einen klinischen Effekt. Dieses wichtige Element ermöglicht die Studie über die spezifische Wirkung eine genaue Konzentration eines halogenierten Agenten auf Zellen wachsen in einem Medium, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Konzentrationen von inhalativen Agenten vergleichen. Darüber, wie die Luftdichte Kammer sehr einfach zu bedienen ist, ermöglicht diese Methode Forscher das Experiment mit Präzision zu replizieren.

Ein weiterer wichtiger Punkt, der die Verwendung der Korrelation zwischen Gas Bruchteil und MAC in der experimentellen Forschung ausschließen kann ist, dass ein halogenierter Agent geringe Löslichkeit im Blut (Blut/Gas-Verteilungskoeffizienten bei 37 ° C = 0,63 bis 0,69 für Sevofluran). Eine minimale Menge von Sevofluran ist vorgeschrieben, um im Blut vor dem Druck in den Lungenbläschen lösen sich Gleichgewicht mit dem Druck in der arteriellen erreicht. Somit steigt während der Induktion der Anästhesie, die alveoläre (Ende-Gezeiten) Konzentration (AF, alveoläre Bruch) von Sevofluran um die inspirierten Konzentration (FI, inspiriert Bruchteil). Jedoch in Vitro Kulturbedingungen erlauben keine solche Mechanismen und üblichen Zelle Medien bestehen hauptsächlich aus wässrigen Lösungen. Darüber hinaus ist die Löslichkeit Koeffizient zwischen Wasser/Gas (Verteilungskoeffizienten bei 37 ° C = 0,36 für Sevofluran) geringer als zwischen Blut und Gas, die entscheidende Bedeutung der Chromatographie Analysen zugrunde liegen.

Zusätzlich, wenn ein verschlossenen Glas verwendet wird, wird der Luftsauerstoff in das Glas durch die Zellen mit der gleichzeitigen Erzeugung von Kohlendioxid absorbiert. Dieser Effekt ist wahrscheinlich unbedeutend in kurzen experimentellen Verfahren, aber für mehr experimentellen Laufzeiten, Zellen, die Sauerstoff beraubt werden würde auf einen anaeroben Stoffwechsel wechseln; Diese Änderung im Stoffwechsel kann eine gewisse Voreingenommenheit in experimentellen Untersuchungen veranlassen. Im Gegensatz zu versiegelten Jar, wenn unsere luftdichten Kammer verwenden sind im Laufe der Zeit um die gezielte halten Sauerstoff und halogenierte Agent fließt einstellbar. Dieses wichtige Merkmal unseres Protokolls erlaubt daher das Design von in-vitro- Experimenten für lange Zeiträume (z. B. mehr als einen Tag), so dass es ein interessantes Werkzeug, um die zellulären Mechanismen epithelialen Lungenschädigung studieren und Reparatur im Laufe der Zeit, vor allem wenn halogenierte Agenten verwendet werden. Die Auswirkungen der Inhalativen Anästhetika auf Lungenzellen oder Gewebe während der alveolären Verletzungen bleiben während dieser Therapie scheint sehr ermutigende Ergebnisse12zeigen bisher schlecht untersucht.

Es gibt jedoch Beschränkungen in Bezug auf diese Technik. Erstens eine Narkose Maschine Schaltung ist notwendig, um Sauerstoff, Kohlendioxid, bieten und halogenierte Agent Gas strömt. Mit einem solchen Gerät ist zwingend erforderlich, legen Sie die Durchflussmenge und stabile Konzentrationen im Laufe der Zeit zu erhalten. Zweitens, dass das Medium vor Chromatographie Analysen, probieren die luftdichten Kammer kurz geöffnet, die induziert eines vorübergehenden Rückgang der Gaskonzentrationen. Da wir eine Narkose Maschine Schaltung einsetzen, sind Gas strömt danach erhöht, bis erwarteten Konzentration wieder auf die Gasanalysator erreicht werden. Drittens haben wir die Konzentration im Medium für nur einen Bruchteil der jeden halogenierten Agenten ausgewählt apriorische basierend auf vorherigen Studie gemessen. Viertens: um die Zelle Medium zum Wachstum der alveolären Epithelzellen zu stabilisieren, müssen wir Kohlendioxid in einer Konzentration von 5 % zu verwenden. In der Tat bietet keine Narkose Maschine Schaltung eine solche Konzentration von Kohlendioxid. Die Narkose Maschine Schaltung muss daher angepasst werden, um die Verbindung von Kohlendioxid Gasstrom anstelle von Lachgas zu ermöglichen. Eine solche Verbindung sollte ausschließlich im Rahmen der experimentellen Forschung verwendet werden und sollte vorsichtig nach jedem Experiment ausgesteckt werden. Darüber hinaus laden wir um jedes Risiko für den Menschen zu vermeiden, Forscher, eine hingebungsvolle Narkose Maschine Schaltung verwenden Sie dieses Protokoll ausführen und nicht mit einer Maschine, die klinische Anästhesie gewidmet.

Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind, dass es ist relativ billig und sehr einfach zu übernehmen, auch wenn Forscher nie eine Luftdichte Kammer vor manipuliert haben. Darüber hinaus sind mit unserem Protokoll, die Ergebnisse der gelösten Sevofluran und Isofluran Konzentrationen reproduzierbar, die repräsentiert einen wichtigen Qualitätskriterium für die experimentelle Forschung. Darüber hinaus kann unser System für das Studium der anderen flüchtigen halogenierten Substanzen wie Desfluran ermöglichen. In der Tat wäre in diesem Fall eine einfache Änderung der Art des Gases Verdampfer Gerät ausreichend. Ebenso konnte unser System bieten ein Mittel, um die Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran aufgelöst in jeder Art von Medium mit verschiedenen Solubilities, wie Wasser, Blut oder Öl zu studieren.

Unser Experiment stellt einen grundlegenden Schritt, die Teil eines größeren Projekts entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass Sevofluran und Isofluran positive Auswirkungen auf die Lunge Verletzungen, Entzündungen und AFC durch Wut-vermittelten Signalwege ausüben können. Mechanistische Untersuchungen berührt Flüssigkeit Transportmittel, kanalspezifische fluidtransport (z. B. mit pharmakologischer Antagonismus), epitheliale parazellulär dient eine Primärkultur der menschlichen alveolären Epithelzellen Durchlässigkeit, Wunde Reparatur, Zellmigration und Verbreitung, mit oder ohne einem halogenierten Anästhetikum (Sevofluran oder Isofluran), allein oder in Kombination mit Cytomix (in-vitro- Modell der alveolären Verletzungen)24.

Zusammenfassend war dieses Protokoll speziell entwickelt, um präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in-vitro- besseres Verständnis der Mechanismen, die in epithelialen Lungenschädigung bei ARDS und Roman testen zu erreichen Therapien für dieses häufige und lebensbedrohliche Syndrom.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen Regionalrats Auvergne ("Programm Nouveau Chercheur De La Région Auvergne" 2013) und der französischen Agence Nationale De La Recherche und die Richtung Générale de L'Offre de Soins ("Programme de Recherche Translationnelle de Santé" ANR-13-PRTs-0010) für die Stipendien. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss im Studiendesign, Durchführung und Analyse oder bei der Erstellung dieses Artikels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

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<em>In-vitro-</em> Methode zur Kontrolle Konzentrationen Halogenkohlenwasserstoffe in kultivierten alveolären Epithelzellen
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Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

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