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Medicine

体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

具体的に達するように設計正確かつ制御された濃度セボフルランやイソフルランの in vitroの上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するために、小説をテストする簡単なプロトコルについて述べる急性呼吸窮迫症候群の治療。

Abstract

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) は、障害者の肺胞液クリアランスと重度の炎症びまん性肺胞損傷の症候群です。集中治療室 (ICU) 患者の鎮静のイソフルラン、セボフルランなどのハロゲン化剤を使用することができますガス交換を改善、肺胞浮腫を軽減、ARDS の中に炎症を弱めます。ただし、連続的な鎮静治療または肺の損傷を防ぐために ICU での吸入剤の使用上のデータは欠けています。「生理学的」条件下での肺胞上皮細胞におけるハロゲン化剤の効果を検討する我々 は気液界面培養細胞に対する簡単なシステムを記述して正確な制御「空気」分数を提供するハロゲン化剤にそれらを公開し、これらのエージェントの「中」の濃度。セボフルランやイソフルラン麻酔器回路によって提供されるガスの連続的な流れを使用して正確な制御された分数にさらされるひと肺胞上皮不死化細胞とプレートで密閉気密室を開発しました。細胞は、24 時間 4% セボフルランとイソフルランの 1% にさらされました。ガス質量分析法は、媒体に溶解したハロゲン化剤の濃度を決定するため行われました。最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の濃度であった 251 mg/L と 25 mg/L。セボフルランとイソフルランの濃度を表す曲線は、時間をかけて、1 時間暴露後に達した高原と類似したコースを示した媒体に溶解しました。

このプロトコルは、セボフルランやイソフルラン体外ARDS の間に上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するためとの新規治療法をテストするための正確かつ制御された濃度に到達するために設計されました、症候群。

Introduction

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急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、びまん性肺胞損傷、肺浮腫、および hypoxemic の呼吸不全によって特徴付けられる臨床的な症候群です。ARDS は、集中治療室 (ICU) 入学の 10% 以上、機械換気を必要とする ICU 患者の約 25% を表し、それはまだ 35-451の病院の死亡率と、臨床医のための認識の下で挑戦です。強烈な研究にもかかわらず、ARDS の薬理学的治療または予防の同定は、日付に失敗しました。ARDS の死亡率に貢献する 2 つの主要な機能: 障害肺胞液クリアランス (AFC) (すなわち、遠位部の肺空域から肺胞浮腫液の変化の吸収) と重度の炎症2。以来、ARDS の死亡率は高いまま、現在の取り組みも一次予防; を含める必要があります。しかし、重要な課題は ARDS を発症する可能性は誰と誰が得を ARDS ができない場合のリスクの高い患者を識別します。

セボフルランやイソフルランなど、揮発性のハロゲン化麻酔薬は、手術室で全身麻酔を提供するために広く使用されます。世界中で全身麻酔と換気3、毎年主要な手術よりも 2 億 3000 万の患者が必要し、臨床転帰と医療利用4 術後肺合併症に悪影響.セボフルラン プロポ フォールではなく使用は、呼吸器外科と ARDS と術後肺合併症5などの有害事象の重要な減少の患者で改善された肺の炎症と関連付けられました。同様に、イソフルランによる前処理は、ARDS67の実験動物モデルで血行動態、酸素、呼吸力学に対する保護効果を持っていた。肺合併症と同様の減少が最近、吸入麻酔剤を示すメタ分析で観察されている非心臓手術の転帰に吸入剤の影響に対処するため、さらなる研究が保証されているが-として静脈麻酔に反対-8心臓手術死亡率の削減に大幅に関連付けられています。

防止したり、肺の損傷を治療する ICU 患者の鎮静のため揮発性剤の使用に関する特定のプロスペクティブなデータは欠けています。ただし、いくつかの試験は今の ICU 患者の鎮静とセボフルラン吸入麻酔の安全性をサポート、前臨床研究は、吸入セボフルランとイソフルラン7,9ガス交換を改善、軽減に示されています。肺胞浮腫と ARDS の実験モデルでの減衰の炎症。また、イソフルラン タイト結合タンパク質の11の変調による歯槽毛管障壁の整合性を維持するのに対し、セボフルランはタイプ II の上皮細胞のダメージ10を軽減します。しかし、さらなる研究がどの程度吸入セボフルランとイソフルラン吸入から臓器保護の実験的証拠を人間に翻訳できることを確認する必要です。最初単一施設無作為化制御-試験 (RCT) 私たちのグループから発見 ARDS 患者における吸入セボフルランの早期使用は改良された酸素処理、いくつかのプロ炎症性マーカー、および減らされた肺上皮の減らされたレベルと関連付けられています。損傷、プラズマと肺胞液12で高度の glycation の最終製品 (sRAGE) の受容体の可溶性のレベルにより評価しました。

一緒に取られて、肺障害に対するセボフルランとイソフルランの有益な効果は、複数の生物学的経路または肺胞液クリアランス (AFC)、上皮損傷、すなわち怒り経路に依存している機能のプロセスを指すことが核因子 (NF) の転流-B とマクロファージ活性化。また、セボフルランが怒り蛋白質自体の表現に影響を与えます。並進運動のメカニズムの理解を提供する実験的モデルを考案した当社の調査チームなどによる前の調査は、ARDS の中に肺胞の炎症や肺上皮傷害/修理の怒りの極めて重要な役割をサポートするのでセボフルラン肺傷害と修復13,14,15。HAELVi (人間の肺胞上皮レンチ末梢肺の空気血液関門を研究に特化した新規ひと肺胞上皮プライマリ細胞ラインでセボフルランとイソフルランの生体外で影響を調べた不死化)、機能のタイトな接合16を含む型肺胞のような特性を持つ。

生体外で調査の設計を準備中 (など「吸入」セボフルランやイソフルランへの暴露と気液界面における肺胞上皮細胞の培養、わかったから以前に発表された研究セボフルランの分数は、「空気」インターフェイス17,18,19標準的なモニター (臨床設定で使用されるものに似ています) を使用してのみ評価されている.ハロゲン化剤濃度は通常最小肺胞内濃度 (MAC) 値に従って選ばれた (例えば、ヒト、セボフルラン、0.5、1.1、および 2.2 vol %、0.25、0.5、および 1 の MAC を表すそれぞれのイソフルラン、0.6、0.8 と0.25、0.5、および 1 の MAC をそれぞれ表す 1.3 vol %)20。確かに、セボフルランとイソフルラン吸入濃度決して行った従って実験モデル/楽器の前の有効性を制限すること自体は、培養液中で。また、ほとんどの実験は、空気のミックス含むセボフルランは内部フラッシュされていた後に封印された嫌気性の jar を使用しました。私たちの目標は、「生理」の条件下で肺胞上皮細胞を研究することだったと、そのような嫌気状態が最適ではないかもしれない、長い実験期間と互換性がないだろうと考えました。したがって、我々 は気液界面培養細胞に独自のシステムを開発、精密制御された「空気」分数とこれらのエージェント「中濃度を提供すること目的とハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) にそれらを公開。我々 の意見で文学にまで報告されていないが、この実験の手順はセボフルランとイソフルランのさらなる生体外で調査する前に必須です。

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Protocol

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1. 肺胞上皮細胞 (hAELVi) の文化

  1. 融解
    1. 栽培に使えるひと肺胞上皮 (huAEC) 15 mL プラスチック チューブ中の 4 mL をピペットし、予熱した水浴 (37 ° C) のバイアルをすばやく解凍します。
    2. 解凍の細胞懸濁液を 5 分間 200 x g でチューブを遠心分離する前に培地 4 mL を含む 15 mL プラスチック チューブに転送します。
    3. 上清を吸引し、5 mL の培地で細胞ペレットを再懸濁します。その後、T25 フラスコにセルを転送します。
    4. 標準条件 (5% CO2、湿度 95% の空気、37 ° C) の下で細胞を養う
  2. 分割
    1. 顕微鏡で細胞の状態を確認します。セルが 80-90% の合流は、以下手順を実行を通じて 1.2.10 1.2.2 セルを分割します。
    2. 滅菌ピペットで細胞の培養メディアを吸い出しなさい。
    3. 4 mL のダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で一度セルを洗浄し、吸引、DPBS。
    4. セル開始; をデタッチするまで、3 分の 37 ° C で培養する前にセルに 1 mL のトリプシン/EDTA 溶液 (TE) を追加します。顕微鏡下で剥離を確認します。
    5. 2 ml の培養液中の細胞を再懸濁し、5 分の 200 x g で細胞を遠心分離します。上清を吸引し、培地 3 mL で再び細胞ペレットを再懸濁します。
    6. トリパン ブルー色素排除試金を使用して、細胞の生存を確認します。細胞懸濁液の 30 μ l をとり、トリパン ブルー チューブでの 0.4% 溶液 30 μ l を追加します。その後、3-5 回は 100 μ l ピペットを使用して、ソリューションを効果的にミックスします。ソリューションの 10 μ l をとり、検定の coverslip の下に置きます。
    7. 検定の分野で実行可能なセルの合計数と死細胞数の両方を (青) カウントします。計算式を使用して細胞生存率 [%]: 細胞生存率 = 100-(100/総細胞数 x の死んだ細胞の数)
    8. 新しい細胞培養 T25 フラスコまたは 6 ウェル プレートに再懸濁細胞ペレットの因数を転送します。T25 フラスコ内で培地 5 mL または 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 mL の合計を達成するために細胞に培地を追加します。
    9. 標準条件 (5% CO2、湿度 95% の空気、37 ° C) の下でインキュベーターで細胞を養う
    10. 細胞が完全に合流されたら、彼らは実験のため準備ができています。

2. 気密室の準備

注: の気密室の工事計画図 1.に描かれています。

  1. 6.5 L の容量を持つ気密ポリプロピレン ボックスを使用します。長さ、幅、および高さが 30 x 20 x 15.5 cm、それぞれです。角が丸いためボックスのボリューム、理論量よりも低いのでご了承ください。
  2. 横方向の壁の下側に 2.5 cm の直径の穴をドリルします。
  3. 緑のマーク、ガス空気混合物の入力パイプとして機能し、シリコン シールとコルゲート チューブを挿入します。
  4. 反対側壁の上にある目の 2.5 cm 径の穴をドリルします。
  5. 赤いマークが別のコルゲート チューブを挿入し、ガス空気混合物の出力管として使用し、シリコン シール、木炭のフィルターで接続します。
  6. ボックスの平均の壁の中央にタイトな 4 mm 径の穴をドリルします。
  7. 回転男性ルアーロック、ガス分析計に接続されますと、シリコン シールとマニホールドに接続されている短い点滴チューブを挿入します。
  8. 気密室内デジタル温度計/湿度計を配置します。

3. ハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) に肺胞上皮細胞を公開します。

メモ: デバイスの略図図 2.で描かれています。

注意: 動物の研究が胎児への害や障害不妊治療の証拠は認められなかった、帝王の中に非常に小規模な研究は母親あるいは胎児に任意の厄介な効果を示さなかったが、使用の安全性ハロゲン化剤 (例えば、セボフルランやイソフルラン) 分娩が日付に示されていません。さらに、人間妊娠中に制御データを収集しません。そのため、妊娠中は強く落胆する必要があります一方、セボフルランやイソフルランを用いた実験を実行しています。

  1. 研究室のレンジフードの下で働きます。
  2. 二酸化炭素 (CO2) による亜酸化窒素のガス管線を切り替える麻酔器回路をカスタマイズします。
  3. グリーン マーク、コルゲート管の気密室をカスタマイズされた麻酔器回路に差し込みます。麻酔器とおよそ 37 ° C に流れ混合ガスを暖めるための気密室の間のパイプに温水加湿器 (ICU の人工呼吸器の使用など) を挿入します。
  4. 暖房を提供するホット プレート上の気密室をインストール プレート温度 37 ° C
  5. 置くの気密に hAELVI 細胞チャンバーし、蓋をシール 6、よくプレートを含みます。
  6. CO2の 5% と 95% 加湿空気の定義された、標準的な条件をすぐに取得する (すなわち空気と CO2の混合物) ガス流量を調節します。
  7. ハロゲン化剤の蒸発器を開き、必要な割合を選択 (本研究では、テスト セボフルランとイソフルランの濃度 4% と 1% それぞれ)。
  8. 画面に外部ガス分析装置による測定と表示されているガスの混合物およびセボフルランやイソフルラン濃度の構成に注意してください。
  9. 目標値が達成されれば、1 L/分に新鮮ガス流量を減らします。
  10. 気密室は、実験のため必要な限りこのガス流量を維持できます。

4. セボフルランやイソフルラン クロマトグラフィーを測定します。

  1. 試料の調製
    1. 異なる時点で非常に簡単に開く研究サンプルを出す商工会議所 (現在の研究では、我々 使用 6 ウェル プレート) 蓋を閉じます。他のサンプルはそのままに。その後、マルチ ボリュームの調節可能なマイクロ ピペットで各サンプルに含まれている培地 1 mL を吸引します。
    2. 媒体をテフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みすべき 10 mL ヘッド スペース クロマトグラフィー バイアルに入れ。あなたはすぐにそれらを使わない場合は、-20 ° C でクロマトグラフィー バイアルをフリーズします。
    3. 原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。
    4. セボフルランとイソフルラン吸入 50、500、5000 mg/L 超純水水/ジメチル sulfoxyde での作業ソリューションを準備 (50/50; v/v)。社内標準化の作業ソリューションはメタノールで 100 mg/L で固定されます。
  2. 細胞試料の分析
    注: 抽出プロシージャはガス ・ クロマトグラフィーと質量ボルドーから以前に検証済みのメソッドに基づいてください。1感性と特異性の同じパラメーターを使用します。セボフルランおよびクロロホルム (IS) がこのプロトコルで使用されていた、イソフルランは多重解析手法に関連付けられていた。簡単に言えば、質量獲得のため純粋なソリューション注射後メソッドが開発されました。その後、m/z は参照基準と文献データを確認しました。3 m/z は (IS) を除く各検体に選ばれた: 定量化 (最も豊富なおよびより高い)、豊かさが定量化, 曲線下の領域を統合することにより求めた 1 m/z と確認のため 2 m/z。3 m/z を使用すると、検体が特定すべて m/z 同じの保持時間があったのでと同様、全額 m/z (イオンの確認定量化の相対的な) 純粋な規格で、すべてのサンプルで同じであったので。この買収のモードでは、検体識別でき, 特異性の定量化します。
    1. 0.5 400 の濃度範囲で検 8 ポイントを構築 mg/L と複数品質コントロール (0.5、1、5、10、20、75、200、および 400 mg/L)。
      メモ: 各校正を検証するため、4 つの品質コントロールに用い: 定量の下限 (C1 = 0.5 mg/L)、2 つの中間レベル (C2 = 20 mg/L と C3 = 75 mg/L) および最終的なレベル (400 mg/L で C4; 数量の上位レベル)。行列を避けるために培養細胞マトリックスのすべての基準とコントロールを行った各検量線の培養細胞と内部標準との干渉がなかったことを検証するため空白の行列を行った。
    2. 原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。その後、50、500、5000 mg/L の純水で混合セボフルラン/イソフルランの作業ソリューションを準備/ジメチル sulfoxyde (50/50; v/v)。実用的なソリューションが 100 mg/L メタノールで希釈しました。
    3. 較正曲線とコントロール細胞試料 1 mL には (100 mg/L) の 50 μ L スパイキングによるサンプルを準備します。
    4. 飽和塩化ナトリウム水溶液 10 mL ヘッド チューブ、テフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みの 200 μ L を試料溶液を準備します。
  3. ガス ・ クロマトグラフィーと質量分析法
    1. サンプル分析、ガス ・ クロマトグラフィー、質量検出法と相まってのヘッド スペース注射を使用します。
    2. ヒーター シェーカー 80 ° C で 10 分間のヘッド チューブを運ぶ。撤回し、ガスクロマト グラフにガス試料 1.5 mL を注入します。クロマトグラフィーの実行の開始時に 100 mL/分 2 分間でスプリット流れ 260 ° C でインジェクターのパラメーターを設定します。
    3. キャリア モードに設定されている圧をスプリット/スプリットレス注入器を使用します。最初、0.15 分 40 kPa でガス圧を保持します。その後、5 分の 300 kPa の圧力に 16 kPa/分の速度を設定する前に 125 kPa/分で 150 kpa 率プログラム圧を上げてください。
    4. 同時注入には 60 ° C、1 分および増加のオーブンの温度 140 ° C の温度が 20 ° C/分の速度に達するまでが始まります。その後、250 ° C を達成するまで温度が再び上昇します。実行の合計時間は 7 分です。
    5. 溶融シリカ毛細管カラム (30 m × 1.4 μ m、0.25 mm ID) を利用したクロマトグラフィー分離を行います。単一イオン監視 (SIM) の状態で大量の実験を実行し、115 と 87 (イオン イオン定量 m z 181、およびイオン資格 m/z 151 と 51 m/z 149 セボフルランの 2.30 分の保持時間 (RT) で同時に (イオン定量) m/z を監視資格) RT 2.8 min, と RT 3.70 分でクロロホルム 83 (イオン定量) の m を z にイソフルランの。
    6. 重量二次フィットを使用してはの面積比によって細胞培養におけるイソフルランとセボフルランの濃度を決定します。セボフルランとイソフルランの定量化 (LLOQ) の下限は 0.5 mg/L と定量化 (ULOQ) の上限は 400 mg/L でした。

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Representative Results

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セボフルランとイソフルランは、時間の経過と共に媒体に溶解、濃度は表 1表 2にそれぞれ報告しました。

媒体におけるセボフルランとイソフルラン吸入濃度のコースは時間をかけて同様であった。ハロゲン化剤の必要な濃度が設定された直後後は、最初の 1 時間濃度が上昇しました。高原はハロゲン化エージェントの管理を停止するまでに保持する、その後、達されました。管理の中断後の濃度低下 1 時間 (図 3)。

最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の平均濃度が 251 mg/L と 25 mg/L、それぞれ。別の実験の間に有意な差が見つかりませんでした。

Figure 1
図 1: 気密室の建設計画この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: デバイスの図この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: セボフルランの濃度 (n = 5) およびイソフルラン (n = 5) 時間をかけてしますA)時間をかけてハロゲン化剤の濃度。値が表される mg/l. 値は平均との SEM で表されますB)各実験のための時間をかけてハロゲン化剤の濃度。値は MG/L で表されますC)ガス分析計で測定した気密室で時間をかけてハロゲン化のエージェントの割合。値はパーセンテージで表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

時間 培地でセボフルランの濃度 セボフルランの割合
(mg/L) 気密室で
中央値 IC (%)
5 分 27 [19-31] 4.6
30 分 152 [142-152] 4.1
1 h 251 [243-332] 4.1
4 h 259 [256-271] 4.2
8 h 265 [237-280] 4.2
24 h (停止) 218 [196-247] 4.3
停止 + 5 分 237 [214-241] 0
停止 + 30 分 92 [91-104] 0
停止 + 1 h 57 [42-58] 0

表 1:低濃度セボフルラン時間の経過中に溶解します。数値データは、濃度の四分位範囲の中央値とは、分数の割合として表されます。(四分位幅) のデュラセル

時間 媒体のイソフルレン麻酔の濃度 イソフルランの割合
(mg/L) 気密室で
中央値 IC (%)
5 分 2 [2-2.5] 0.8
30 分 16 [4-18] 1.3
1 h 22 [18-27] 0.9
4 h 30 [25-31] 1.4
8 h 22 [15-26] 1.2
24 h (停止) 26 [23-27] 1.1
停止 + 5 分 19 [12-25] 0
停止 + 30 分 4 [4-4] 0
停止 + 1 h 1 [0.8 - 1] 0

表 2:イソフルランの時間をかけて中に溶解します。数値データは、濃度の四分位範囲の中央値とは、分数の割合として表されます。(四分位幅) のデュラセル

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Discussion

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提案プロトコルでは、セボフルランやイソフルランなどのハロゲン化麻酔薬の正確な割合に細胞を公開する簡単な方法について説明します。さらに、我々 はここで報告-初めて-セボフルランとイソフルラン吸入自体培養液中の濃度とガス留分の厳密な相関。この基本的なステップは今、私たち人間の肺胞上皮細胞の培養単分子膜ハロゲン化剤の効果を研究する私たちの気密室を安全に使用することができます。

現在、肺胞細胞セボフルランの影響を研究するほとんどの研究チームは、最初ハロゲン系のガスで飽和し、シールは、jar ファイルを使用します。この場合、セボフルランが代謝され、する揮発性の割合が低下する線形時間をかけて不安定なガス濃度につながるそれを推測することができます。ただし、セボフルランのガス留分と培養液中の濃度との相関が明らかに文献で報告されません。通常、これらの実験で使用されるセボフルランの濃度、ガス留分と MAC との間の単純な関係に基づいて選択します。MAC は 1965 年に導入され、モーター応答 (動き) を防ぐために必要な肺の水蒸気の濃度は、手術の刺激 (痛み)22の応答における被験者の 50%。MAC を使用して、強度、または麻酔蒸気の効力を比較できます。ICU 患者における MAC FeSevo と臨床リッチモンド評価興奮鎮静スケール (RASS)23に相関しています。日常臨床で有用な指標ですが、このパラメーターの妥当性は、体外実験的研究.の設定で決して検討されています。我々 のプロトコルで我々 はガス留分に含まれるセボフルランと媒体に溶解セボフルランの正確な相関を決定中のクロマトグラフィー分析を使用しています。この方法では、揮発性エージェントの特定の効果は媒体の実際の濃度によるとではなく臨床効果の近似に基づきます。この重要な要素には、濃度の異なる吸入剤の効果を比較するために媒体で育つセルの正確なハロゲン化剤濃度の特定の影響の研究ことができます。さらに、気密室は非常に使いやすいので、この方法により複製精度で実験する研究者です。

実験研究でガス留分と MAC との間の相関関係の使用を妨げることがあります別の重要なポイントは、ハロゲン化エージェントでは、血液 (血液/ガス分配係数で 37 ° C = 0.63 セボフルランをする) の難溶。セボフルランの最小限の量は、気胞の圧力の前に血で分解する動脈内の圧力と平衡実現を義務づけられています。したがって、全身麻酔導入時セボフルランの肺胞 (呼気) 濃度 (AF、肺胞の一部) は急速に触発された濃度 (FI、触発分数) 周り増加します。体外培養条件ではそのようなメカニズムは許可しないし、通常細胞媒体は主に水溶液で構成されます。さらに、水道・ ガス (37 ° C = 0.36 セボフルランで分配係数) の溶解度係数は血とクロマトグラフィー分析の重要性の基礎となるガスより低い。

さらに、密封瓶を使用すると、jar ファイル内の大気中の酸素は二酸化炭素の同時生成と細胞によって吸収されます。この効果は、おそらく些細な一言で言えば実験手順、実験期間が長く、酸素を奪われる細胞は嫌気性の新陳代謝; に切り替えるだろう新陳代謝のこの変更は、実験的解析では、バイアスのある程度を引き起こす可能性があります。密封の瓶では、当社の気密室を使用する場合と対照をなして、対象レベルを維持するために時間をかけて酸素やハロゲン化剤フロー、調整できます。プロトコルのこの主要な特性したがって長い時間の期間 (例えば、 1 つ以上の日) のための in vitro実験の設計ができ、肺上皮障害に関与する細胞のメカニズムを研究するツール興味深いことと修復、特にハロゲン化剤が使用されてとき。確かに、肺細胞や肺胞損傷組織に及ぼす吸入麻酔薬のまま非常に心強い結果12を示すと思われるがこの代替療法まで不十分な調査。

ただし、この手法には制限があります。まず、麻酔器回路は酸素、炭酸ガスを提供するために必要なエージェント気体をハロゲン化します。このようなデバイスを使用して流量を設定し、時間をかけて安定した濃度を維持するために必須です。第二に、クロマトグラフィー分析の前に媒体をサンプルの気密室が簡単に開くと、ガス濃度の一時的な減少を誘発します。麻酔器回路を使用して、ガスの流れは予想される濃度はガス分析計再び達成するまでその後増加しました。第三に、事前先行研究に基づいて選ばれたそれぞれのハロゲン化エージェントの 1 つだけの一部のための媒体の濃度を測定しました。第四に、肺胞上皮細胞の成長、細胞用培地を安定させるには、5% の濃度の炭酸ガスを使用する必要があります。確かに、麻酔器の回路はこのような二酸化炭素濃度ではありません。したがって、麻酔器の回路は、亜酸化窒素の代わりに二酸化炭素ガスの流れの接続を許可するようにカスタマイズする必要があります。このような接続は実験研究の設定でのみ使用される必要があります、慎重にならない接続実験後。さらに、人間のすべてのリスクを避けるために、このプロトコルを実行して臨床麻酔に専用機械を使用しないこと、献身的な麻酔器回路を使用する研究者を招待します。

この手法の主な利点は、比較的安価な研究者が前に気密室を決して操作するときも、採用する非常に簡単であります。また、我々 のプロトコルとセボフルランとイソフルラン吸入濃度の結果、再現性のある、実験的研究のための主要な品質基準を表します。さらに、desflurane など、その他の揮発性ハロゲン化剤の研究体制が許可されます。確かに、この場合ガス蒸発装置の種類の簡単な変更を十分でしょう。同様に、私たちのシステムはセボフルランやイソフルラン水、血や油などの異なる溶解性と媒体の任意のタイプの溶存濃度を研究する手段を提供可能性があります。

実験は、セボフルランとイソフルラン吸入が怒りを介する経路を介して肺損傷、炎症、そして AFC に有益な効果を出すことがあります仮説をテストするために設計された大規模なプロジェクトの一部である基本的な手順を表します。人間の肺胞上皮細胞の初代培養は上皮流体輸送、チャネル固有の流体輸送 (例えば、薬理学的対立を使用して)、上皮傍細胞の解明の研究に使用します。透水性、傷の修復、細胞遊走、増殖、(セボフルランやイソフルラン) ハロゲン化麻酔剤の有無に単独で、または cytomix (肺胞損傷のモデルを生体外で)24と組み合わせる。

結論としては、このプロトコルに正確かつ制御された濃度セボフルランやイソフルラン体外ARDS の間に上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するために、小説をテストするのに到達する設計されましたこの頻繁に生命にかかわる症候群の治療。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

著者認めるオーベルニュ地方議会 (「プログラム ヌーボー Chercheur デ ラ地方オーヴェルニュ」2013) とフランス語アジャンス ナシオナル デ ラ抜き方向ジェネラル ・ デ ・ L'Offre ・ デ ・球種 ("プログラム ・ デ ・凝った Translationnelle en 健康"ANR-13-PRTS-0010) 補助金のため。資金提供者には、研究デザイン、実施、解析、やこの記事の準備の影響はなかった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

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References

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<em>体外</em>培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法
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