Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Método de controle de concentrações de Gases halogenados em culturas de células epiteliais alveolares

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Descreveremos um protocolo fácil projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro a fim de melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial e para testar o romance terapias para a síndrome respiratória aguda.

Abstract

Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome de lesão alveolar difusa com afastamento fluido alveolar deficiente e inflamação grave. O uso de agentes halogenados, tais como o sevoflurano ou isoflurano, para a sedação de pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI) pode melhorar a troca gasosa, reduzir o edema alveolar e atenuar a inflamação durante a SDRA. No entanto, dados sobre o uso de agentes inalatórios para sedação contínua na UTI para tratar ou prevenir danos nos pulmões é carente. Para estudar os efeitos dos agentes halogenados em pilhas epithelial alveolares em condições "fisiológicas", descrevemos um sistema fácil para células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados para fornecer fracções de precisão controlada "ar" e concentrações de "médio" para esses agentes. Desenvolvemos uma câmara hermética selada em que placas com células humanas de imortalizado epiteliais alveolares podem ser expostas a uma fração precisa, controlada de sevoflurano ou isoflurano usando um fluxo de gás contínua fornecido por um circuito de máquina anestésica. As células foram expostas a 4% de sevoflurano e 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometria de massa de gás foi realizada para determinar a concentração de agentes halogenados dissolvido no meio. Após a primeira hora, as concentrações de sevoflurano e isoflurano no meio foram 251 mg/L e 25 mg/L, respectivamente. As curvas que representam as concentrações de sevoflurano e isoflurano dissolvido no meio mostrou cursos semelhantes ao longo do tempo, com um patamar alcançado em uma hora após a exposição.

Este protocolo foi projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial durante a SDRA e testar novas terapias para o Síndrome.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome clínica caracterizada por lesão alveolar difusa, edema pulmonar e insuficiência respiratória hypoxemic. Embora a SDRA representa mais de 10% das admissões de unidade de terapia intensiva (UTI) e quase 25% dos pacientes de UTI que requerem ventilação mecânica, é ainda um desafio sob-reconhecido para os clínicos, com uma taxa de mortalidade do hospital de 35-45%1. Apesar de intensas pesquisas, a identificação de uma terapia farmacológica eficaz de SDRA ou prevenção falhou até à data. Dois principais recursos contribuem para a mortalidade na SDRA: prejudicada afastamento fluido alveolar (AFC) (ou seja, a reabsorção alterada do fluido de edema alveolar de espaços aéreos do pulmão distal) e inflamação grave2. Desde que a mortalidade de SDRA permanece elevada, iniciativas em curso também devem incluir a prevenção primária; no entanto, é um desafio-chave para identificar pacientes em risco, em que Sara é provável desenvolver e quem se beneficiaria se SDRA foram impedidas.

Anestésicos halogenados voláteis, tais como o sevoflurano e isoflurano, são amplamente utilizados para fornecer anestesia geral na sala de cirurgia. Em todo o mundo, mais de 230 milhões pacientes submetidos à cirurgia de grande porte cada ano exigem anestesia geral e ventilação mecânica3, e complicações pulmonares pós-operatórias afetam adversamente os resultados clínicos e saúde utilização4 . O uso do sevoflurano em vez de propofol foi associado com inflamação pulmonar melhorou em pacientes submetidos à cirurgia torácica e diminuições significativas em eventos adversos, tais como a SDRA e complicações pulmonares pós-operatórias5. Da mesma forma, o pré-tratamento com isoflurano tinha efeitos protectores na mecânica respiratória, oxigenação e hemodinâmica em modelos animais experimentais de SDRA6,7. Embora mais estudos são garantidos para abordar o impacto de agentes inalatórios em resultados na cirurgia antiagregantes, uma diminuição semelhante de complicações pulmonares tem sido observada recentemente em uma meta-análise, demonstrando que inalou agentes anestésicos — como opôs-se à anestesia intravenosa — são significativamente associados com uma redução na mortalidade para cirurgia cardíaca8.

Está faltando dados prospectivos específicos sobre o uso de agentes voláteis para a sedação de pacientes de UTI para prevenir ou tratar a lesão pulmonar. No entanto, vários ensaios agora oferecem suporte a eficácia e segurança de sevoflurano inalado para a sedação de pacientes de UTI, e estudos pré-clínicos têm demonstrado que inalatórios sevoflurano e isoflurano7,9 melhorar a troca gasosa, reduzir edema alveolar e atenua inflamação em modelos experimentais de SDRA. Além disso, sevoflurano atenua tipo II células epiteliais danos10, Considerando que o isoflurano mantém a integridade da barreira alveolar-capilar através da modulação da junção apertada proteína11. No entanto, mais estudos são necessários para verificar em que medida as evidências experimentais de proteção de órgão de inalatórios sevoflurano e isoflurano poderiam ser traduzida como seres humanos. Um primeiro single-centro controlado-randomizado (ECR) do nosso grupo encontrou que o uso precoce de sevoflurano inalado em pacientes com SDRA foi associado com oxigenação melhorada, redução dos níveis de alguns marcadores pró-inflamatórios e reduzida pulmonar epitelial danificar, avaliada pelos níveis da forma solúvel do receptor para final-produtos de glicação avançada (sRAGE) no plasma e alveolar fluido12.

Tomados em conjunto, os efeitos benéficos do sevoflurano e isoflurano na lesão pulmonar poderiam apontar para vários caminhos biológicos ou processos funcionais que dependem da via de raiva, ou seja, liberação de fluido alveolar (AFC), lesão epitelial, translocação do fator nuclear (NF)-κB e ativação de macrófagos. Além disso, sevoflurano pode influenciar a expressão da proteína raiva em si. Desde a pesquisa anterior, nossa equipe de pesquisa e outros suporta papéis pivotal para raiva na inflamação alveolar e pulmão, reparação de lesão epitelial durante a SDRA, projetamos um modelo experimental para fornecer uma compreensão translação dos mecanismos de sevoflurano em pulmão lesão e reparação13,14,15. Os efeitos em vitro de sevoflurano e isoflurano foram investigados em uma linha de romance humano alveolar primária célula epitelial especificamente projetada para estudar a barreira sangue-ar do pulmão periférico, hAELVi (humana Alveolar LentiVirus epiteliais imortalizado), com tipo alveolar-como características incluindo junções apertadas funcional16.

Enquanto preparava o design de nossas investigações em vitro (por exemplo, culturas de células epiteliais alveolares na interface ar-líquido, com a exposição "inalado" sevoflurano ou isoflurano, entendemos anteriormente publicados estudos que frações de sevoflurano só foram avaliadas no "ar" interface17,18,19 usando monitores padrão (semelhantes aos usados em um ambiente clínico). Agente halogenado concentrações geralmente foram escolhidas de acordo com os valores de concentração alveolar mínima (MAC) (por exemplo, em humanos, para sevoflurano, 0.5, 1.1 e 2.2 vol %, representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, e vol 1,3% representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente)20. Com efeito, concentrações de sevoflurano e isoflurano nunca foram investigadas em meio de cultura em si, limitando assim a validade de modelos/instrumentos experimentais anteriores. Além disso, a maioria dos experimentos usado um frasco anaeróbio que foi selado depois o sevoflurano contendo mistura de ar tinha sido liberado dentro. Como nosso objetivo era estudar células epiteliais alveolares em condições "fisiológicas", acreditamos que tal um estado anaeróbico pode não ser ideal e não seria compatível com durações de tempo experimentais. Portanto, desenvolvemos nosso próprio sistema de células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados (sevoflurano e isoflurano) com o objectivo de proporcionar precisão controlada "ar" fracções e concentrações "médio" para esses agentes. Em nossa opinião, esta etapa experimental, que não foi relatada até agora na literatura, é obrigatória antes de qualquer em vitro investigações de sevoflurano e isoflurano.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. cultura de células epiteliais alveolares (hAELVi)

  1. Descongelamento
    1. Pipetar 4 mL de meio de cultivo prontos para uso humano alveolar epitelial (huAEC) em um tubo plástico de 15 mL e descongelar rapidamente o frasco num banho de água pré-aquecida (37 ° C).
    2. Transferi a suspensão de células descongeladas para um tubo de plástico de 15 mL contendo 4 mL de meio de antes da centrifugação do tubo a 200 x g por 5 min.
    3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de cultivo. Em seguida, transferi as células para um balão de T25.
    4. Cultivar as células em condições padrão (5% de CO2, 95% úmido ar, 37 ° C)
  2. Divisão
    1. Verificar o status das células ao microscópio. Quando as células são 80-90% de confluencia, dividi as células, as seguintes etapas 1.2.2 através de 1.2.10.
    2. Aspire os meios de cultivo das células com uma pipeta estéril.
    3. Lavar as células uma vez com 4 mL de Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) e aspire o DPBS.
    4. Adicionar 1 mL de solução de tripsina/EDTA (TE) para as células antes da incubação a 37 ° C por 3 min, até que as células começam a se separar; Verifique se há desprendimento sob um microscópio.
    5. Ressuspender as células com 2 mL de meio de cultura e centrifugar as células a 200 x g por 5 min. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células novamente com 3 mL de meio de cultivo.
    6. Use o ensaio de exclusão do corante azul de Tripan para determinar a viabilidade das células. Pegue 30 µ l de suspensão de células e adicionar 30 µ l de uma solução 0,4% de trypan azul em um tubo. Depois disso, efetivamente misture a solução de 3 - 5 vezes utilizando uma pipeta de 100 µ l. Pegue 10 µ l da solução e colocá-lo sob a lamela do hemocytometer.
    7. Tanto o número total de células viáveis e contam o número de células mortas (azul) nas áreas do hemocytometer. Em seguida, calcular a viabilidade celular [%] usando a equação: viabilidade celular = 100 – (número 100 / total de células x número de células mortas)
    8. Transferi a alíquota com o centrifugado ressuspensão para um balão de T25 de cultura celular novo ou um 6-placa. Adicione o meio de cultivo para as células para alcançar um total de 5 mL de meio de cultivo no frasco T25, ou 1 mL para cada poço da placa bem-6.
    9. Cultivar as células em uma incubadora em condições padrão (5% de CO2, 95% úmido ar, 37 ° C)
    10. Uma vez que as células estão completamente confluentes, eles estão prontos para o experimento.

2. preparação de uma câmara estanque

Nota: O plano de construção para a câmara hermética está representado na Figura 1.

  1. Use uma caixa hermética de polipropileno com capacidade de 6,5 L. O comprimento, largura e altura são 30 x 20 x 15,5 cm, respectivamente. Por favor note, o volume da caixa é inferior ao volume teórico devido os cantos arredondados.
  2. Faça um furo de diâmetro de 2,5 cm na parte inferior da parede lateral.
  3. Inserir um tubo corrugado com uma marca verde, que servirá como o tubo de entrada de mistura gás-ar e selá-lo com silicone.
  4. Faça um furo de diâmetro segundo 2,5 cm na parte superior da parede lateral oposta.
  5. Inserir outro tubo corrugado com uma marca vermelha e conectá-lo com um filtro de carvão, que servirá como o tubo de saída de mistura gás-ar e selá-lo com silicone.
  6. Faça um furo de diâmetro 4mm apertado no centro da parede média da caixa.
  7. Inserir tubos de infusão curta que é conectado a um tubo colector com um rotação luer-lock macho, que será conectado em um analisador de gás e selá-lo com silicone.
  8. Coloque um termômetro/higrômetro digital dentro da câmara estanque.

3. expor a células epiteliais alveolares para agentes halogenados (sevoflurano e isoflurano)

Nota: Um desenho esquemático do dispositivo é representado na Figura 2.

Atenção: Embora estudos em animais não revelaram nenhuma evidência de dano fetal ou perturbações da fertilidade, e um estudo muito pequeno durante cesarianas não mostrou qualquer efeito desfavorável sobre a mãe ou o feto, a segurança do uso de derivados halogenados agentes (por exemplo, sevoflurano ou isoflurano) durante o trabalho de parto não foi demonstrado até à data. Além disso, foram coletados dados não controlados durante a gravidez humana. Portanto, realizando experimentos utilizando sevoflurano ou isoflurano enquanto grávida deve ser fortemente desencorajada.

  1. Trabalhar sob um exaustor de laboratório.
  2. Personalize um circuito anestésico máquina para alternar a linha de gás de óxido nitroso, dióxido de carbono (CO2).
  3. Conecte a câmara estanque com o tubo ondulado verde-marcado o circuito da máquina anestésica personalizado. Inserir o tubo entre a máquina de anestesia e a câmara estanque para aquecer a mistura de fluxo de gás para cerca de 37 ° C com um umidificador aquecido (tais como aqueles usados em ventiladores de ICU)
  4. Instalar a câmara estanque em uma chapa quente, proporcionando um aquecimento da placa a temperatura de 37° C.
  5. Coloca o 6-placa contendo as células de hAELVI para a prova de ar câmara e feche a tampa.
  6. Regule as taxas de fluxo de gás (ou seja, a mistura de ar e CO2) para obter rapidamente as condições padrão, definidas como 5% de CO2 e 95% de ar umidificado.
  7. Abra o evaporador agente halogenados e escolha a porcentagem desejada (no presente estudo, as concentrações testadas de sevoflurano e isoflurano foram 4% e 1%, respectivamente).
  8. Observe a composição da mistura e o sevoflurano, isoflurano concentração do gás como medido por um analisador de gás externo e exibido na tela.
  9. Uma vez que os valores-alvo são alcançados, reduza a taxa de fluxo de gás fresco a 1 L/min.
  10. A câmara estanque pode ser mantida com esta taxa de fluxo de gás, enquanto necessário para o experimento.

4. medir o sevoflurano ou isoflurano por cromatografia

  1. Preparação de amostras
    1. Nos pontos de tempo diferente, muito brevemente abrir a câmara para tirar as amostras estudadas (no presente estudo, nós usamos uma placa-6) e feche a tampa. Mantenha as outras amostras na caixa. Em seguida, Aspire 1 mL do meio de contido em cada amostra com uma micropipeta ajustável de vários volume.
    2. Colocar o médio em 10 mL frascos de cromatografia por "headspace", que devem ser apertados hermeticamente com uma tampa de Teflon-selado. Congele os frascos de cromatografia-20 ° C, se você não usá-los imediatamente.
    3. Prepare uma solução stock de sevoflurano e outra solução stock de isoflurano, ambos a 50 g/L em metanol. Simultaneamente, prepare uma solução stock de clorofórmio (padrão interno, IS) a 2 g/L em metanol. Armazenar todas as soluções-padrão a-20 ° C.
    4. Preparar soluções de trabalho de sevoflurano e isoflurano em 50, 500 e 5000 mg/L em água ultrapura/dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Para padronização interna, a solução é fixada em 100 mg/L de metanol.
  2. Análise de amostras celulares
    Nota: O procedimento de extração se baseia o método de cromatografia gasosa e espectrometria de massa de Bourdeaux et al previamente validado 1 e usa os mesmos parâmetros de sensibilidade e especificidade. Sevoflurano e clorofórmio (IS) foram utilizados no presente protocolo, e isoflurano foi associado com o método analítico Multiparamétrico. Brevemente, para aquisição de espectrometria de massa, o método foi desenvolvido após a injeção de solução pura. Em seguida, m/z foi confirmado com padrões de referência e dados da literatura. M/z três foram selecionados para cada analito (exceto si): um m/z para quantificação (o maior e o mais abundante), para o qual abundância foi calculada através da integração da área sob a curva para quantificação e dois m/z para confirmação. Usando três m/z, analitos poderiam ser especificamente identificados porque todos m/z tinha o mesmo tempo de retenção, bem como porque todos os valores de m/z (parente do íon confirmação vs quantificação) eram os mesmos na norma pura e em todas as amostras. Com este modo de aquisição, analitos poderiam ser identificados e quantificados com boa especificidade.
    1. Construir uma curvas de 8 pontos de calibração com as gamas de concentração de 0,5-400 mg/L e a qualidade de Múltiplo controles (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 e 400 mg/L).
      Nota: Para validar cada calibração, quatro controles de qualidade foram usado: o limite inferior de quantificação (C1 = 0,5 mg/L), dois intermediários níveis (C2 = 20 mg/L e C3 = 75 mg/L) e o nível final (C4 a 400 mg/L; nível superior de quantificação). Todas as normas e controles foram analisados em matrizes de células cultivadas para evitar o efeito de matriz. Para cada curva de calibração, uma matriz em branco foi analisada para validar que não havia nenhuma interferência com as normas internas e celulares culturas.
    2. Prepare uma solução stock de sevoflurano e outra solução stock de isoflurano, ambos a 50 g/L em metanol. Simultaneamente, prepare uma solução stock de clorofórmio (padrão interno, IS) a 2 g/L em metanol. Armazenar todas as soluções-padrão a-20 ° C. Então, prepare-se soluções de trabalho de sevoflurano/isoflurano misturado em 50, 500 e 5000 mg/L em água ultrapura / dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Para IS, a solução é diluída em 100 mg/L de metanol.
    3. Para as curvas de calibração e controles, prepare as amostras por cravação 50 µ l de IS (100 mg/L) em 1 mL de matrizes de amostra celular.
    4. Prepare soluções de amostra com 200 µ l de solução de água saturada de cloreto de sódio em um tubo de headspace de 10 mL, hermeticamente apertada com uma tampa de Teflon-selado.
  3. Cromatografia gasosa e espectrometria de massa
    1. Para análises, use injeções de headspace em uma cromatografia, juntamente com o método de deteção de massa.
    2. Carrega tubos de headspace para 10 min a 80 ° C com um misturador aquecedor. Em seguida, retirar e injetar 1,5 mL da amostra do gás no cromatógrafo a gás. Defina o parâmetro do injector a 260 ° C, com um fluxo dividido em 100 mL/min por 2 min no início da execução de cromatografia.
    3. Use o injector Split/splitless com uma pressão de modo programado do portador. Em primeiro lugar, manter a pressão do gás a 40 kPa para 0,15 min. Em seguida, aumente a pressão de programa de taxa de 150 kPa em 125 kPa/min antes de definir uma taxa de 16min/kPa a 300 kPa pressão por 5 min.
    4. Acesso simultâneo para a injeção, começar com uma temperatura de 60 ° C, durante 1 min e aumento do forno até atingir uma temperatura de 140 ° C a uma taxa de 20 ° C/min. Em seguida, aumente novamente a temperatura até 250 ° C seja alcançado. O tempo total da corrida é de 7 min.
    5. Realizar a separação cromatografia usando uma coluna capilar de sílica fundida (30 m x 1,4 µm, 0.25 mm ID). Realizar experimentos em massa com um único íon de monitoramento de condição (SIM) e monitorar a quantificação de íon m/z 181 e íon qualificações m/z 151 e 51 simultaneamente a um tempo de retenção (RT) de 2,30 min para sevoflurano, m/z 149 (quantificação do íon), m/z 115 e 87 (íon qualificações) de isoflurano em RT 2.8 min e m/z 83 (quantificação de íons) de clorofórmio no RT 3.70 min.
    6. Determine as concentrações de sevoflurano e isoflurano na cultura de pilha por seus rácios área do IS usando um ajuste quadrático de peso. Limite inferior de quantificação (LLOQ) para o sevoflurano e isoflurano foi de 0,5 mg/L e o limite superior de quantificação (ULOQ) foi de 400 mg/L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

As concentrações do sevoflurano e isoflurano, que dissolveu a médio ao longo do tempo, são relatadas na tabela 1 e tabela 2, respectivamente.

Os cursos das concentrações no meio de sevoflurano e isoflurano foram semelhantes ao longo do tempo. Imediatamente após a concentração necessária de agente halogenado foi definida, concentrações levantou-se durante a primeira hora. Então foi alcançado um platô, que persistiu até a administração do agente halogenado foi interrompida. Após a interrupção da administração, as concentrações diminuíram em uma hora (Figura 3).

Após a primeira hora, as concentrações de mediana de sevoflurano e isoflurano no meio foram 251 mg/L e 25 mg/L, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as diferentes experiências.

Figure 1
Figura 1: plano de construção da câmara estanque Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de desenho do dispositivo Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: concentração de sevoflurano (n = 5) e isoflurano (n = 5) ao longo do tempo. A) concentração de agente halogenado ao longo do tempo. Os valores são expressos em mg/L. valores são expressos em média e SEM. B) concentração de agente halogenado ao longo do tempo para cada experimento. Valor são expressos em mg/L. C) fração do agente halogenado ao longo do tempo na câmara estanque ao ar medido pelo analisador do gás. Valores são expressos em percentagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tempo Concentração de sevoflurano em meio de Fração de sevoflurano
(mg/L) na câmara estanque
Median IC (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251. [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (parar) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 min 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stop + 1h 57 [42 - 58] 0

Tabela 1: Concentrações de sevoflurano dissolvido em meio ao longo do tempo. Dados numéricos são expressos como um valor mediano com intervalo interquartil para a concentração e a porcentagem para a fração. IQR (para intervalo interquartil)

Tempo Concentração de isoflurano no meio Fração de isoflurano
(mg/L) na câmara estanque
Median IC (%)
5min 2 [2 - 2,5] 0.8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0.9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (parar) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5min 19 [12 - 25] 0
Stop + 30min 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabela 2: Concentrações de isoflurano dissolvido em meio ao longo do tempo. Dados numéricos são expressos como um valor mediano com intervalo interquartil para a concentração e a porcentagem para a fração. IQR (para intervalo interquartil)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nosso protocolo descreve um método fácil para expor as células para uma fração precisa de um agente anestésico halogenado, tais como o sevoflurano ou isoflurano. Além disso, nós relatamos aqui — pela primeira vez — uma rigorosa correlação entre a fração do gás e da concentração de sevoflurano e isoflurano dentro do próprio meio de cultura. Este passo fundamental agora nos permite usar com segurança a nossa câmara estanque para estudar os efeitos destes agentes halogenados em uma cultura monocamadas de células epiteliais alveolares humanas.

Atualmente, a maioria das equipes de pesquisa estudando os efeitos do sevoflurano em células alveolares usar um frasco que é primeiro saturado com gás halogenados e selado. Neste caso, sevoflurano pode ser metabolizado, e pode-se especular que a fração de agente volátil pode diminuir linearmente ao longo do tempo, levando a uma concentração de gás instável. No entanto, a correlação entre a fração de gás de sevoflurano e sua concentração no meio de cultura não é claramente relatada na literatura. Normalmente, a concentração de sevoflurano usado nesses experimentos é escolhida com base em uma relação simples entre a fração de gás e o Mac. MAC foi introduzido em 1965 e é a concentração de um vapor nos pulmões que é necessário para evitar uma resposta motora (movimento) em 50% dos indivíduos em resposta a um estímulo cirúrgico (dor)22. MAC é usado para comparar a força ou potência, de vapores anestésicos. Em pacientes de UTI, MAC é correlacionada com a FeSevo e a clínica de Richmond avaliação escala de agitação-sedação (RASS)23. Embora seja um indicador útil na prática clínica diária, a relevância deste parâmetro nunca foi investigada no cenário do experimental em vitro pesquisa. Em nosso protocolo, utilizando análises de cromatografia de médio porte, determinamos a exata correlação entre o sevoflurano contido na fração de gás e o sevoflurano dissolvido no meio de. Com esse método, o efeito específico de um agente volátil é expressa de acordo com a concentração real no meio em vez de basear a aproximação de um efeito clínico. Este importante elemento permite que o estudo do efeito específico de uma concentração precisa de um agente halogenado em células de cultivo em um meio, a fim de comparar os efeitos de diferentes concentrações de agentes inalatórios. Além disso, como a câmara estanque é muito fácil de usar, esse método permite que os pesquisadores replicar a experiência com precisão.

Outro ponto importante que pode impedir o uso da correlação entre a fração de gás e MAC na pesquisa experimental é que um agente halogenado tem baixa solubilidade no sangue (coeficiente de partição sangue/gás em 37 ° C = 0,63 para 0,69 para sevoflurano). Uma quantidade mínima de sevoflurano é obrigatória dissolver no sangue antes a pressão nos alvéolos alcança o equilíbrio com a pressão na arterial. Assim, durante a indução da anestesia, a concentração (end-tidal) alveolar (AF, fração alveolar) de sevoflurano aumenta rapidamente em torno da concentração inspirada (FI, inspirou fração). No entanto, em vitro as condições de cultura não permitem tais mecanismos e meios habituais célula consistem principalmente em soluções aquosas. Além disso, o coeficiente de solubilidade entre água/gás (coeficiente de partição em 37 ° C = 0,36 para sevoflurano) é menor do que entre o sangue e o gás, subjacentes a importância fundamental da realização de análises de cromatografia.

Além disso, quando um frasco selado é usado, o oxigênio atmosférico no frasco é absorvido pelas células com a geração simultânea de dióxido de carbono. Este efeito é provavelmente insignificantes procedimentos experimentais em breve, mas para mais experimentais durações, as células que são privadas de oxigênio seriam mudar para um metabolismo anaeróbico; Esta mudança no metabolismo pode induzir um certo grau de polarização em análises experimentais. Em contraste com o frasco selado, quando usando nossa câmara estanque, tanto o oxigênio e o agente halogenado fluxos são ajustáveis ao longo do tempo para manter o nível do alvo. Esta característica importante do nosso protocolo, portanto, permite o desenho de experimentos em vitro por longos períodos de tempo (por exemplo, mais de um dia), tornando-se uma interessante ferramenta para estudar os mecanismos celulares envolvidos na lesão epitelial pulmonar e reparação ao longo do tempo, especialmente quando os agentes halogenados são utilizados. Com efeito, os efeitos de agentes anestésicos inalatórios em células pulmonares ou tecido durante lesão alveolar continuam mal investigados até à data, enquanto esta terapia alternativa parece mostrar muito encorajadores resultados12.

No entanto, existem limitações para esta técnica. Primeiro, um circuito de máquina anestésica é necessária para fornecer oxigênio, dióxido de carbono e halogenados agente fluxos de gás. Usar esse dispositivo é obrigatório para definir a taxa de fluxo e manter concentrações estáveis ao longo do tempo. Segundo, para experimentar o meio antes de análises de cromatografia, a câmara estanque é brevemente aberta, que induz uma diminuição transitória nas concentrações de gás. Como nós usamos um circuito da máquina anestésica, fluxos de gás posteriormente aumentam até se concentrações esperadas novamente sobre o analisador de gases. Em terceiro lugar, medimos a concentração no meio por apenas uma fração de cada agente halogenado, escolhido a priori baseada em estudo anterior. Em quarto lugar, para estabilizar o meio de celular para o crescimento das células epiteliais alveolares, precisamos usar o dióxido de carbono em uma concentração de 5%. Com efeito, nenhum circuito anestésico máquina fornece uma concentração de dióxido de carbono. Portanto, o circuito da máquina anestésica precisa ser personalizado para permitir a conexão de fluxo de gás de dióxido de carbono no lugar de óxido nitroso. Tal uma conexão deve ser usado exclusivamente no cenário de pesquisa experimental e cautelosamente deve ser desligado após cada experimento. Além disso, para evitar qualquer risco para os seres humanos, nós convidamos pesquisadores usar um circuito dedicado máquina anestésica para realizar este protocolo e não usar uma máquina dedicada a anestesia clínica.

As principais vantagens desta técnica são que é relativamente barato e muito fácil de adotar, mesmo quando os pesquisadores nunca manipularam uma câmara hermética de antes. Além disso, com nosso protocolo, os resultados das concentrações de sevoflurano e isoflurano dissolvidos são reprodutíveis, que representa um critério de grande qualidade para pesquisa experimental. Além disso, nosso sistema pode permitir para o estudo de outros agentes halogenados voláteis, tais como o desflurano. Na verdade, uma simples mudança do tipo de dispositivo de evaporador de gás seria suficiente nesse caso. Da mesma forma, nosso sistema pode fornecer um meio para estudar as concentrações de sevoflurano ou isoflurano dissolvido em qualquer tipo de meio com diferentes solubilidades, tais como água, sangue ou óleo.

Nosso experimento representa um passo fundamental que faz parte de um projeto maior, projetado para testar a hipótese de que o sevoflurano e isoflurano podem exercer efeitos benéficos na lesão pulmonar, inflamação e AFC através de vias mediadas por raiva. Uma cultura primária de células epiteliais alveolares humanas será usada para investigações mecanicistas de fluido transporte transepitelial, específicos do canal transporte de fluidos (por exemplo, usando o antagonismo farmacológico), paracellular epitelial permeabilidade, reparação da ferida, migração celular e proliferação, com ou sem um agente anestésico halogenado (sevoflurano ou isoflurano), sozinho ou combinado com cytomix (em vitro modelo de lesão alveolar)24.

Em conclusão, este protocolo foi projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial durante a SDRA e testar o romance terapias para esta síndrome frequente e fatal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o Conselho Regional de Auvergne ("programa Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) e a francesa Agence Nationale de la Recherche e a direção Générale de L'Offre de Soins ("programa de Translationnelle de Recherche en Santé" ANR-13-PRTS-0010) para as bolsas. Os financiadores não influenciaram na concepção do estudo, conduta e análise ou na preparação deste artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>In Vitro</em> Método de controle de concentrações de Gases halogenados em culturas de células epiteliais alveolares
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter