Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Vitro Denetim konsantrasyonları kültürlü alveoler epitel hücrelerdeki halojenlenmiş gazların yöntemi

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Biz sevoflurane veya isoflurane vitro kesin ve kontrollü konsantrasyonları mekanizmaları epitel akciğer yaralanmalara dahil anlayışımızı geliştirmek ve Roman sınamak için ulaşmak için özel olarak tasarlanmış kolay bir iletişim kuralı tanımlamak Akut Respiratuar distress sendromu için terapiler.

Abstract

Akut Respiratuar distress Sendromu (ARDS) Engelli alveoler sıvı temizlik ve şiddetli inflamasyon ile yaygın alveoler yaralanma sendromu var. Sevoflurane veya isoflurane, gibi halojenlenmiş ajanlar kullanımı yoğun bakım ünitesi (ICU) hastaların sedasyon için gaz değişimi geliştirmek, alveoler ödem azaltmak ve enflamasyon sırasında ARDS azalt. Ancak, inhale ajanlar kullanımı sürekli sedasyon bakımda tedavi etmek ya da akciğer hasarı önlemek için veri eksik. Halojenli ajanların etkileri "fizyolojik" koşullar altında alveoler epitel hücreleri üzerinde çalışmaya, kültür hücrelere hava-sıvı arayüzü kolay bir sistem tarif ve hassas kontrollü "hava" kesirler sağlamak için halojenlenmiş acentelere tanıttığını ve Bu aracılar için "Orta" konsantrasyonları. Hangi insan alveoler epitel ölümsüzleştirdi hücreleri ile plakalar sevoflurane veya bir anestezik makine devre tarafından sağlanan bir sürekli gaz akışı kullanarak isoflurane kesin, kontrollü bir kısmını maruz olabilir kapalı bir hava geçirmez odası geliştirdik. Hücreleri sevoflurane % 4'ü ve isoflurane % 1'için 24 saat boyunca maruz kalmışlar. Gaz kütle spektrometresi ortamda çözünmüş halojenlenmiş ajanların konsantrasyonu belirlemek için gerçekleştirildi. Sonraki ilk saat, sevoflurane ve orta isoflurane konsantrasyonları 251 mg/L 25 mg/L, idi. Sevoflurane ve isoflurane konsantrasyonları temsil eden eğrileri maruz kaldıktan sonra bir saatte ulaştı bir plato ile zaman içinde benzer dersler gösterdi ortamda çözünmüş.

Bu iletişim kuralı sevoflurane veya isoflurane vitro mekanizmaları epitel akciğer hasarı ARDS sırasında katılan anlayışımızı geliştirmek ve yeni tedaviler için sınamak için hassas ve kontrollü konsantrasyonları ulaşmak için özel olarak tasarlanmıştır sendromu.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut Respiratuar distress Sendromu (ARDS) yaygın alveoler yaralanma, akciğer ödemi ve hypoxemic solunum yetmezliği ile karakterize klinik bir sendrom var. Yoğun bakım ünitesi (ICU) kabul fazla % 10 ve mekanik havalandırma gerektiren ICU hastaların yaklaşık % 25 ARDS temsil eder, hala 35-%451bir hastane ölüm oranı ile klinisyenler için altında tanınan bir sorun olsa da. Yoğun araştırma rağmen bugüne kadar bir etkili ARDS farmakolojik tedavi veya önleme başarısız oldu. İki yeni özellikler katkıda ARDS mortalite için: Engelliler alveoler sıvı izni (AFC) (Yani, alveoler ödem sıvısı distal akciğer hava sahaları üzerinden değişmiş rezorpsiyonu) ve şiddetli inflamasyon2. ARDS ölüm oranı yüksek kalır beri geçerli girişimler de birincil korunma içermelidir; Ancak, önemli bir sorun risk altındaki hastalarda ARDS geliştirmek için büyük olasılıkla olduğunu ve ARDS ve eğer kim yararlanacak belirlemektir.

Sevoflurane ve isoflurane, gibi uçucu halojenlenmiş anestezikler ameliyathanede genel anestezi sağlamak için yaygın olarak kullanılır. Dünya çapında, her yıl önemli bir ameliyat geçiren 230 milyondan fazla hasta genel anestezi ve mekanik havalandırma3gerektirir ve pulmoner komplikasyonlar Ģunları klinik sonuçlar ve sağlık kullanımı4 olumsuz . Sevoflurane propofol yerine kullanımı Gelişmiş akciğer iltihabı göğüs cerrahisi ve ARDS ve pulmoner komplikasyonlar Ģunları5gibi olumsuz olayların önemli düşüşler uygulanan hastalarda ile ilişkili idi. Benzer şekilde, Önarıtma isoflurane ile solunum mekaniği, oksijen ve hemodinami koruyucu etkileri ARDS6,7' nin deneysel hayvan modellerinde vardı. Her ne kadar daha fazla çalışmaları inhale ajanlar noncardiac cerrahi sonuçlar üzerine etkisini gidermek için garanti altındadır, pulmoner komplikasyonlara benzer bir düşüş bir meta-bu inhale anestezik ajanların gösteren analizi, son zamanlarda gözlenmiştir — olarak intravenöz anestezi için karşı — önemli ölçüde mortalite kalp cerrahisi8için bir azalma ile ilişkili olan.

Uçucu ajanlar kullanımı önlemek veya tedavi akciğer hasarı ICU hastaların sedasyon için hakkında belirli olası veri eksik. Ancak, çeşitli denemeler şimdi etkinlik ve inhale sevoflurane Emanet ICU hastalar sedasyon için destekler ve preklinik çalışmalar göstermiştir inhale sevoflurane ve isoflurane7,9 gaz değişimi geliştirmek, azaltmak alveoler ödem ve ARDS deneysel modelleri attenuate iltihabı. Ayrıca, İsoflurane modülasyon sıkı kavşak protein11aracılığıyla alveoler-kılcal bariyer bütünlüğünü korur, ancak sevoflurane tip II epitel hücre hasarı10, azaltıcı etkendir. Ancak, daha fazla çalışmaları ne ölçüde organ koruma inhale sevoflurane ve isoflurane deneysel kanıt insanlar için tercüme olabilir doğrulamak için ihtiyaç vardır. İlk tek-merkezi kontrollü-randomize (RCT) bizim grup hastalarda ARDS inhale sevoflurane erken kullanımı geliştirilmiş oksijenlenme, düşük düzeyde bazı pro-inflamatuar işaretleri ve azaltılmış akciğer epitel ile ilişkili bulundu , plazma ve alveoler sıvı12' çözünür formun gelişmiş glikasyondan son-ürünleri (sRAGE) için reseptör düzeyleri tarafından değerlendirildi zarar.

Birlikte ele alındığında, sevoflurane ve isoflurane yararlı etkileri akciğer yaralanma üzerinde birden fazla biyolojik yollar veya öfke yolu üzerinde bağımlı olan fonksiyonel işlemleri yani alveoler sıvı izni (AFC), epitel yaralanma işaret edebilir, Nükleer faktör (NF) translocation-κB ve makrofaj harekete geçirmek. Buna ek olarak, sevoflurane ifade öfke protein etkileyebilir. Araştırma ekibimiz ve diğerleri tarafından önceki araştırma çok önemli roller için öfke alveoler inflamasyon ve akciğer epitel yaralanma/onarım sırasında ARDS destekler beri biz mekanizmaları translasyonel bir anlayış sağlamak için deneysel bir model tasarlanmıştır Sevoflurane akciğer hasarı ve onarım13,14,15dakika sonra. HAELVi (insan alveoler epitel LentiVirus periferik akciğerin hava-kan bariyerini eğitim için özel olarak tasarlanmış bir roman insan alveoler epitel birincil hücre çizgide sevoflurane ve isoflurane vitro etkileri incelenmiş , fonksiyonel sıkı kavşak16dahil olmak üzere alveoler tip ben gibi özellikleri ile ölümsüzleşmiş).

Bizim vitro araştırmalar tasarım hazırlanırken (Örneğin, "inhale" sevoflurane veya isoflurane maruz kalma ile hava-sıvı arayüzey, alveoler epitel hücreleri kültürleri, anladık üzerinden daha önce yayınlanan bu çalışmalar sevoflurane kesirler yalnızca standart monitör (bir klinik ortamda kullanılanlara benzer) kullanma "hava" arabirimi17,18,19 değerlendirildi. Halojenli Ajan konsantrasyonları genellikle en az alveoler konsantrasyon (MAC) değerlerine göre seçildi (Örneğin, insanlarda, sevoflurane için 0.5, 1.1 ve 2.2 vol % 0.25, 0.5 ve 1 MAC, temsil eden, isoflurane, 0,6, 0.8, için sırasıyla; ve 1.3 vol % 0.25, 0.5 ve 1 MAC, sırasıyla temsil eden)20. Gerçekten de, sevoflurane ve isoflurane konsantrasyonları asla kültür böylece önceki deneysel modeller/aletler geçerliliğini sınırlayıcı ortamda kendisi, araştırdı. Ayrıca, çoğu deneyler hava karışımı içeren sevoflurane içinde oraya atılıp sifon çekilmiş sonra mühürlü bir anaerobik kavanoz kullanılır. Amacımız alveoler epitel hücreleri "fizyolojik" koşullar altında çalışmaya olduğu gibi anaerobik bir duruma en uygun olmayabilir ve uzun deneysel süreleri ile uyumlu olmaz inanıyordu. Bu nedenle, bizim sistemimizde kültür hücreleri vasıl hava-sıvı arayüzey için geliştirilen ve acentelere halojenli (sevoflurane ve isoflurane) hassas kontrollü "hava" kesirler ve bu aracılar için "Orta" konsantrasyonu sağlamak amacı ile karşılaşmazlar. Bize göre bugüne kadar literatürde bildirilmiştir değil, bu deneysel adım önce herhangi bir ilave vitro araştırmalar sevoflurane ve isoflurane zorunludur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. kültür alveoler epitel hücresi (hAELVi)

  1. Çözdürme
    1. Ekimi kullanıma hazır insan alveoler epitel (huAEC) orta 15 mL plastik tüp içinde 4 mL pipet ve hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış su banyosu (37 ° C) şişede çözülme.
    2. Çözdürülen hücre süspansiyon orta 4 mL tüp 200 x g 5 min için de centrifuging önce içeren bir 15 mL plastik tüp aktarın.
    3. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet yetiştirme ortamının 5 mL ile resuspend. Ardından hücreleri bir T25 şişesi aktarın.
    4. Hücreleri (%5 CO2, % 95'i nemlendirilmelidir hava, 37 ° C) standart koşullar altında yetiştirmek
  2. Bölme
    1. Hücrelerin mikroskobik durumunu. Hücrelerin % 80-90 birleşmesi olduğunuzda, aşağıdaki adımları 1.2.2 1.2.10 aracılığıyla hücreleri bölün.
    2. Yetiştirme ortamı steril bir pipet içeren hücrelerin Aspire edin.
    3. 4 mL, Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) bir kez hücrelerle yıkama ve DPBS Aspire edin.
    4. 1 mL tripsin/EDTA çözeltisi (TE) hücreleri ayırmak başlayana kadar 3 dk 37 ° C'de kuluçka önce hücreleri ekleyin; dekolmanı mikroskop altında olup olmadığını denetleyin.
    5. Kültür Orta 2 mL içeren hücreleri resuspend ve hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. Daha sonra süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet ekimi orta 3 mL ile tekrar resuspend.
    6. Trypan mavi boya dışlama tahlil hücrelerin canlılık belirlemek için kullanın. Hücre süspansiyon 30 µl alıp trypan bir tüp içinde mavi bir % 0,4 çözüm 30 µl ekleyin. Bundan sonra etkili bir şekilde 3 - 5 defa 100 µl pipet kullanarak çözüm mix. Çözüm 10 µl alıp hemasitometre coverslip altında.
    7. Ölü hücreleri ve hücrelerin toplam sayısı (mavi) hemasitometre alanlarında saymak. Sonra denklemi kullanarak hücre canlılığı [%] hesaplamak: hücre canlılığı = 100-(100 / toplam sayısı x ölü hücreleri sayısı)
    8. Aliquot resuspended hücre Pelet ile yeni bir hücre kültür T25 şişesi veya 6 iyi tabakta aktarın. T25 şişeye yetiştirme ortamının 5 mL veya 1 mL 6 şey plaka her şey için toplam elde etmek için hücrelere ekimi orta ekleyin.
    9. Kuluçka (%5 CO2, % 95'i nemlendirilmelidir hava, 37 ° C) standart koşullar altında hücrelerde yetiştirmek
    10. Hücreleri tamamen konfluent, onlar deneme için hazırız.

2. hava geçirmez bir odası hazırlanması

Not: resim 1'. hava geçirmez odası için inşaat planı tasvir edilir

  1. 6.5 l kapasiteli bir hermetik Polipropilen kutusunu kullanın Uzunluk, genişlik ve yükseklik 30 x 20 x 15,5 cm, sırasıyla vardır. Lütfen dikkat, kutu hacmi nedeniyle köşeleri yuvarlatılmış teorik ses daha düşüktür.
  2. Lateral duvarının alt tarafında 2.5 cm çapında delik.
  3. Oluklu bir tüp gaz-hava karışımı giriş borusu hizmet ve silikon ile mühür bir yeşil işareti ile ekleyin.
  4. Bir ikinci 2.5 cm çapında ters yan duvarın üst tarafında delik.
  5. Kırmızı bir işareti ile başka bir oluklu tüp takın ve gaz-hava karışımı çıkış borusu hizmet ve silikon ile mühür bir kömür filtre ile takın.
  6. Bir sıkı 4 mm çapı ortalama duvar kutusunun ortasındaki delik.
  7. Bağlı kısa infüzyon boru bir manifold bir dönen erkek radarı-bir gaz çözümleyicisine takılı ve silikon ile mühür kilidi ile ekleyin.
  8. Dijital termometre/Higrometre hava geçirmez odası yerleştirin.

3. (Sevoflurane ve Isoflurane) halojenli acentelere alveoler epitel hücreleri göstermek

Not: cihaz çizim bir şematik resim 2'. tasvir edilir

Dikkat: her ne kadar hayvan çalışmaları fetal zarar veya zarar görür doğurganlık bulgusuna indirdik ve çok küçük bir çalışma sırasında cesarean bölüm anne veya fetus uygunsuz herhangi bir etkisi yoktu, kullanarak emanet ajanlar (Örneğin, halojenliler Sevoflurane veya isoflurane) emek ve teslim sırasında bugüne kadar kanıtlanmıştır değil. Ayrıca, kontrollü veri insan gebelik sırasında toplanmıştır. Bu nedenle, hamile şiddetle discouraged olmalıdır sevoflurane veya isoflurane kullanarak deneyler yapmak.

  1. Bir laboratuvar extractor başlık altında çalışır.
  2. Nitröz oksit gaz hattı tarafından karbondioksit (CO2) geçiş yapmak için bir anestezik makine devre özelleştirin.
  3. Hava geçirmez odası yeşil işaretli, oluklu boru ile özelleştirilmiş anestezik makine devre takın. Anestezik makine ve gaz akışı karışımı yaklaşık 37 ° c sıcak hava geçirmez odası arasında boru ısıtmalı bir nemlendirici (örneğin, ICU vantilatörler) takın
  4. Hava geçirmez odası bir ısıtma sağlayan bir sıcak plaka üzerinde yüklemek plaka 37° c sıcaklık
  5. 6 iyi-plaka içeren hava geçirmez hAELVI hücrelere odası ve kapağı mühür koymak.
  6. Gaz akış oranları (Yani, hava ve CO2karışımı) hızlı bir şekilde CO%2 5 ve oksijen hava % 95'i tanımlanan standart koşullar elde etmek için düzenler.
  7. Halojenli Ajan evaporatör açın ve istediğiniz yüzdeyi seçin (Bu da çalışmanın, sevoflurane ve isoflurane test konsantrasyonları % %4 1 idi).
  8. Gaz karışımı ve sevoflurane veya isoflurane konsantrasyon olarak bir dış gaz analizörü göre ölçülen ve görüntülenen ekrandaki bileşimi unutmayın.
  9. Bir kez hedef değerleri elde, 1 L/dak için taze gaz akış oranını azaltmak.
  10. Hava geçirmez odası deney için gerekli olduğu sürece bu gaz akış hızı ile korunabilir.

4. Sevoflurane veya Isoflurane Kromatografi tarafından ölçmek

  1. Örnekleri hazırlanması
    1. Farklı zaman noktalarda, çok kısa bir süre okudu örneği odası açmak (Bu da çalışmanın, 6 şey plaka kullanılır) ve kapağını kapatın. Diğer örnekleri kutuda tutun. Sonra her örnek bir çok hacimli ayarlanabilir micropipette ile yer alan orta 1 mL Aspire edin.
    2. Orta hermetik sıkı bir Teflon sızdırmaz kap ile vidalı 10 mL headspace Kromatografi tüpleri içine koymak. Hemen onları kullanmayın Kromatografi şişeleri-20 ° C'de dondurmak.
    3. Sevoflurane hisse senedi bir çözüm ve başka bir hisse senedi çözüm isoflurane, 50 g/L metanol içinde de hazır olun. Aynı anda, kloroform (dahili standart, IS) adlı 2 g/L metanol içinde stok çözeltisi hazırlamak. Tüm standart çözümler-20 ° C'de depolayın
    4. Sevoflurane ve isoflurane 50, 500 ve 5000 mg/L Ultrasaf Su/dimetil sulfoxyde içinde çalışma çözümleri hazırlamak (50/50; v/v). İç standardizasyon çalışma çözüm 100 mg/L metanol içinde yönü sabittir.
  2. Analiz hücresel örnekleri
    Not: Çıkarma yordamı gaz kromatografi ve kütle spektrometresi Bordo ve ark. üzerinden önceden doğrulanmış yöntemini temel alır 1 ve duyarlılık ve özgüllük aynı parametrelerini kullanır. Sevoflurane ve kloroform (IS) Bu protokol için kullanıldı ve isoflurane multiparametric analitik yöntem ile ilişkili olduğu. Kısaca, kütle spektrometresi edinmesinin saf çözüm enjeksiyon sonra yöntem geliştirilmiştir. O zaman, m/z kullanılan standartlar ve edebiyat veri ile doğrulandı. Üç m/z (IS) hariç her analit için seçildi: bir m/z için hangi için bereket miktar için eğri altındaki alan entegre ederek hesaplanan miktar (en bol ve üstü) ve iki m/z onay. Üç m/z kullanarak, analitler özellikle tüm m/z aynı tutma zamanı olduğu için hem de tüm m/z tutarlar (iyon onay vs miktar akrabası) saf standart ve tüm örneklerini aynı olduğu için belirlenmiştir. Bu satın alma modu ile analitler tespit olabilir ve iyi özgüllük ile sayılabilir.
    1. Konsantrasyon aralığı 0.5-400 olan bir kalibrasyon 8 köşeli eğriler oluşturmak mg/L ve birden fazla kalite kontrolleri (0.5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 ve 400 mg/L).
      Not: dört kalite kontrolleri her kalibrasyon doğrulamak için kullanıldı: miktar alt sınırı (C1 = 0,5 mg/L), iki orta düzeyde (C2 = 20 mg/L ve C3 = 75 mg/L) ve son seviyesi (400 mg/L C4; miktar üst düzey). Tüm standartları ve denetimleri matris efekti önlemek için kültürlü hücre matrisler içinde analiz edildi. Her kalibrasyon eğrisi için boş bir matris kültürlü hücresel ve iç standartları ile hiçbir girişim olduğunu doğrulamak için analiz edildi.
    2. Sevoflurane hisse senedi bir çözüm ve başka bir hisse senedi çözüm isoflurane, 50 g/L metanol içinde de hazır olun. Aynı anda, kloroform (dahili standart, IS) adlı 2 g/L metanol içinde stok çözeltisi hazırlamak. Tüm standart çözümler-20 ° C'de depolayın Sonra çalışma çözümleri, karışık sevoflurane/isoflurane 50, 500 ve 5000 mg/L Ultrasaf Su hazırlamak / dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Is için çalışma çözümü, 100 mg/L metanol içinde seyreltilmiş.
    3. Kalibrasyon eğrileri ve denetimler için örnekleri 1 mL hücresel örnek Matrislerin IS (100 mg/L) spiking 50 µL tarafından hazırlayın.
    4. Örnek çözümler ile doymuş sodyum klorür su çözüm hermetik sıkı bir Teflon sızdırmaz kap ile vidalı bir 10 mL headspace tüp 200 µL hazırlayın.
  3. Gaz Kromatografi ve kütle spektrometresi
    1. Örnek analizler için headspace enjeksiyonları kitle algılama yöntemi ile birleştiğinde bir gaz kromatografi kullanın.
    2. Headspace tüpler için 10 dk 80 ° C'de bir ısıtıcı shaker ile taşırlar. Sonra geri çekilin ve gaz örneği 1,5 mL gaz Kromatograf enjekte. Enjektör parametre 100 mL/dk 2 min için bir split akış ile 260 ° C'de Kromatografi Çalıştır başında ayarlayın.
    3. Split/splitless enjektör taşıyıcı modu programlanmış bir basınç ile uygulayın. İlk olarak, gaz basıncı 40 kPa 0.15 min için tutun. Daha sonra 125 kPa/dk 150 kPa oranı programı basınç oranı 16 kPa/dk 5 min için 300 kPa basınç ayarlamadan önce artırmak.
    4. Enjeksiyon için eşzamanlı başlatmak bir fırın sıcaklığı 60 ° c için 1 dk ve artış ile 140 ° C sıcaklık 20 ° C/dk hızında ulaşıncaya kadar. 250 ° C elde kadar sonra tekrar sıcaklık artışı. Toplam run 7 dk. zamanı.
    5. Erimiş silis kapiller sütun (30 m x 1.4 µm, 0,25 mm ID) kullanarak Kromatografi ayırma taşımak. Kitle deneyler (SIM) durumu izleme tek bir iyon ile gerçekleştirmek ve iyon miktar m/z 181 ve iyon nitelikleri m/z 151 ve 51 (iyon miktar), aynı anda için bir defada saklama (RT) 2.30 min sevoflurane, m/z 149 m/z 115 ve 87 (iyon izlemek Nitelikler) isoflurane RT 2.8 min ve m/z 83 (iyon miktar) için kloroform RT 3,70 dk için.
    6. Bu ikinci dereceden uygun bir ağırlık kullanarak IS kendi alan oranları tarafından sevoflurane ve hücre kültüründe isoflurane konsantrasyonları belirlemek. Miktar (LLOQ) sevoflurane ve isoflurane için alt sınır 0,5 mg/L ve miktar (ULOQ) üst sınırı 400 mg/l

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sevoflurane ve orta zaman içinde çözünmüş, isoflurane konsantrasyonları Tablo 1 ve Tablo 2, sırasıyla bildirdi.

Orta sevoflurane ve isoflurane konsantrasyonlarda derslerin zamanla benzerdi. Hemen halojenlenmiş Aracısı gerekli konsantrasyonu ayarladıktan sonra konsantrasyonları ilk saatten fazla yükseldi. Bir plato halojenlenmiş aracısının yönetim durdurulana kadar hangi kalıcı sonra ulaşıldı. Yönetim kesintisinden sonra bir saat içinde (Şekil 3) konsantrasyonları azalmıştır.

Sonraki ilk saat, sevoflurane ve orta isoflurane medyan konsantrasyonları 251 mg/L 25 mg/L, idi. Farklı deneyler arasında anlamlı bir fark bulunamadı.

Figure 1
Şekil 1: İnşaat planı hava geçirmez odası Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: cihaz çizim şematik Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sevoflurane konsantrasyonu (n = 5) ve isoflurane (n = 5) zaman içinde. A) halojenlenmiş Ajan konsantrasyon zaman içinde. Değerlerin ortalama ve SEM mg/l değerleri ifade edilir B) halojenlenmiş Ajan konsantrasyonu her deneme için zaman içinde. Değeri mg/l ifade edilen C) zamanla halojenlenmiş Ajan hava geçirmez odasında kısmını gaz Çözümleyicisi tarafından ölçülen. Değerleri yüzde olarak ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Zaman Sevoflurane orta yoğunlukta Sevoflurane kısmını
(mg/L) Hava geçirmez odasında
Medyan ŞA (%)
5 dk 27 [19 - 31] 4.6
30 dk 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (Durdur) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 dk 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 dk 92 [91 - 104] 0
Stop + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tablo 1: Orta zaman içinde çözünmüş sevoflurane konsantrasyonları. Sayısal veri interquartile aralığı konsantrasyonu için Ortalama bir değerle ve kesri için yüzde olarak ifade edilir. IQR (interquartile Aralık için)

Zaman İsoflurane orta yoğunlukta İsoflurane kısmını
(mg/L) Hava geçirmez odasında
Medyan ŞA (%)
5 dk 2 [2 - 2.5] 0.8
30 dk 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0,9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (Durdur) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5 dk 19 [12 - 25] 0
Stop + 30 dk 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tablo 2: Orta zaman içinde çözünmüş isoflurane konsantrasyonları. Sayısal veri interquartile aralığı konsantrasyonu için Ortalama bir değerle ve kesri için yüzde olarak ifade edilir. IQR (interquartile Aralık için)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bizim iletişim kuralı bir halojenlenmiş anestezik Ajan, sevoflurane veya isoflurane gibi hassas bir kısmını yapan hücreleri göstermek için kolay bir yöntem açıklanır. Ayrıca, biz burada rapor — ilk kez — gaz kesir ve sevoflurane ve kültür ortamı içinde isoflurane konsantrasyon arasında sıkı bir ilişki. Bu temel adım şimdi güvenli bir şekilde bizim hava geçirmez odası kültürlü monolayer insan alveoler epitel hücrelerinin içinde halojenlenmiş bu ajanların etkileri çalışma kullanmak için bize izin verir.

Şu anda, çoğu araştırma ekipleri sevoflurane alveoler hücrelerdeki etkileri okuyan ilk halojenlenmiş gaz ile doymuş ve daha sonra kapalı bir kavanoz kullanın. Bu durumda, sevoflurane metabolize ve bu geçici Ajan kısmını doğrusal olarak zaman içinde bir kararsız gaz toplama için önde gelen düşebilir spekülasyonlar. Ancak, sevoflurane gaz kısmını ve kültür orta onun konsantrasyonu arasında ilişki literatürde açıkça bildirilir. Genellikle, bu deneylerde kullanılan sevoflurane konsantrasyonu bağlı gaz kesir ve Mac arasında basit bir ilişki olarak seçilir MAC 1965 yılında piyasaya sürüldü ve motor yanıt (hareket) önlemek için gereken bir buhar akciğerlerde konsantrasyonu % 50 bir cerrahi uyarıcı (ağrı)22yanıt bireylerde '. MAC gücü veya potens anestezik buharlar karşılaştırmak için kullanılınır. ICU hastalarda, MAC FeSevo ve klinik Richmond değerlendirme ajitasyon-sedasyon ölçek (SEMUD'u)23ilişkilidir. Bu günlük klinik uygulamada yararlı bir göstergesi olmasına rağmen bu parametre alaka asla deneysel vitro araştırma. ayarında araştırmış Bizim iletişim kuralında, orta, kromatografi analizleri kullanarak gaz kesir içerdiği sevoflurane ve orta çözünmüş sevoflurane arasında hassas ilişki kararlı. Bu yöntemle uçucu bir ajan belirli etkisi orta gerçek konsantrasyon göre ifade yerine bir klinik etki yaklaşım üzerinde dayalı. Bu önemli bir unsur inhale ajanlar farklı konsantrasyonlarda etkileri karşılaştırmak üzere bir ortamda büyüyen hücreleri hassas yandan halojenlenmiş aracının belirli etkisini çalışma sağlar. Ayrıca, hava geçirmez odası çok kolay olduğu için bu yöntem ile hassas deneme çoğaltmak araştırmacılar sağlar.

Gaz kesir ve MAC arasında korelasyon deneysel araştırma kullanımı engel başka bir önemli nokta halojenlenmiş Ajan düşük çözünürlük kan (37 ° C = 0,63 0,69 sevoflurane için için kan/gaz bölümü katsayısı) olmasıdır. Sevoflurane en az bir miktar kan basıncı alveoller önce çözülmeye arter basıncı ile denge elde belirtilmelidir. Böylece, anestezi indüksiyon sırasında alveoler (son gelgit) konsantrasyonu (AF, alveolar fraksiyonu) sevoflurane (FI, ilham Kesir) ilham toplama hızlı artırır. Ancak, vitro kültür koşullar böyle mekanizmaları izin vermez ve her zamanki hücre medya esas olarak sulu çözümler oluşur. Ayrıca, su/gaz (37 ° C = 0,36 sevoflurane için bölüm katsayısı) arasındaki çözünürlük katsayısını kan ve gaz kromatografi analizleri yapmak kritik öneme sahip temel arasında daha düşük olduğunu.

Ayrıca, mühürlü bir kavanoz kullanıldığında, kavanozun içinde atmosferik oksijen karbon dioksit eşzamanlı nesil ile hücreleri tarafından emilir. Bu etki, muhtemelen önemsiz kısa deneysel prosedürler olmakla birlikte, artık bu deneysel süreler için oksijen yoksun hücreleri bir anaerobik metabolizma geçmek istiyorsunuz; Bu değişikliği metabolizma, belirli bir ölçüde deneysel analizlerde önyargı neden olabilir. Bizim Hava geçirmez odası kullanırken mühürlü kavanoz aksine, oksijen ve halojenlenmiş Ajan akar hedeflenen düzeyde tutmak için zaman içinde ayarlanabilir. Bu büyük özelliği bizim iletişim kuralı, bu nedenle vitro deneyler tasarımı uzun süreler için (Örneğin, birden fazla gün) sağlar., yapım o ilginç bir araç hücresel mekanizmaları akciğer epitel yaralanma ilgili çalışmaya ve onarım zamanla, özellikle ne zaman halojenlenmiş ajanlar kullanılır. Nitekim, bu alternatif tedavi çok cesaret verici sonuçlar12göstermek için görünüyor olsa da akciğer hücreleri veya doku alveoler yaralanma sırasında inhale anestezik ajanların etkisi bugüne kadar kötü incelenen kalır.

Ancak, bu teknik sınırlamalar vardır. İlk olarak, bir anestezik makine devre oksijen, karbondioksit, sağlamak için gereken ve Ajan gaz akışı halojenliler. Böyle bir cihaz kullanarak akış oranını ayarlamak ve zaman içinde kararlı konsantrasyonları korumak için zorunludur. İkincisi, kromatografi analizleri önce Orta örnek için hava geçirmez odası kısaca hangi gaz konsantrasyonları geçici bir düşüş neden olmaktadır açıldı. Biz bir anestezik makine devre kullanırken, beklenen konsantrasyonları tekrar gaz analizörü elde kadar gaz akışı bundan sonra artmıştır. Üçüncü olarak, konsantrasyon önceki çalışmaya dayanarak bir temanın seçilen halojenlenmiş her aracısının yalnızca bir kısmını ortamda ölçülen var. Dördüncü olarak, alveoler epitel hücrelerinin büyümesini hücre ortamına stabilize etmek, biz karbon dioksit % 5'lik bir konsantrasyonu kullanmanız gerekir. Gerçekten de, hiçbir anestezik makine devre karbon dioksit gibi bir konsantrasyon sağlar. Bu nedenle, anestezik makine devre karbon dioksit gaz akışı nitröz oksit yerine bağlanmasına izin vermek için özelleştirilmiş olması gerekir. Böyle bir bağlantı sadece deneysel araştırma ortamında kullanılması gerektiğini ve dikkatli bir şekilde her deneyden sonra takılı olmalıdır. Ayrıca, insanlar için herhangi bir riski önlemek için araştırmacılar bu iletişim kuralı gerçekleştirmek için ve bir makine için klinik anestezi adanmış kullanmamayı adamış anestezik makine devreyi kullanmaya davet ediyoruz.

Bu nispeten ucuz ve çok kolay kabul, hatta ne zaman araştırmacılar asla önce hava geçirmez bir odası manipüle bu teknik başlıca avantajları şunlardır. Ayrıca, bizim iletişim kuralıyla çözünmüş sevoflurane ve isoflurane konsantrasyonları sonuçlarını temsil eden bir büyük kalite ölçütü deneysel araştırmalar için tekrarlanabilir, bulunmaktadır. Buna ek olarak, sistemimiz diğer uçucu halojenlenmiş ajanlar, desflurane gibi bir çalışma için izin verebilir. Gerçekten de, gaz evaporatör aygıt türünü basit bir değişiklik bu durumda yeterli olur. Benzer şekilde, sistemimiz sevoflurane veya orta su, kan veya yağ gibi farklı solubilities ile her türlü içinde çözünmüş isoflurane konsantrasyonları çalışma için bir yol sağlayabilir.

Deneyimiz sevoflurane ve isoflurane öfke-aracılı yollar aracılığıyla akciğer hasarı, inflamasyon ve AFC yararlı etkileri uygulamayın hipotezi test etmek için tasarlanmış büyük bir projenin parçası olan temel bir adımı temsil etmektedir. Birincil bir kültür alveoler epitel hücrelerinin insan-ecek var olmak kullanılmış için transepithelial sıvı taşıma, kanal özel sıvı taşıma (farmakolojik husumet kullanarakÖrneğin, ), epitel paracellular Mekanik araştırmalar geçirgenliği, yara tamir, hücre göç ve nükleer silahların yayılmasına karşı veya halojenlenmiş anestezik Ajan (sevoflurane veya isoflurane), olmadan tek başına veya kombine ile cytomix (alveolar yaralanmavitro modeli)24.

Sonuç olarak, bu iletişim kuralını özellikle sevoflurane veya isoflurane vitro mekanizmaları epitel akciğer hasarı ARDS sırasında katılan anlayışımızı geliştirmek ve Roman sınamak için hassas ve kontrollü konsantrasyonları ulaşmak için tasarlanmış Bu sık ve yaşamı tehdit eden sendromu için terapiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar kabul Auvergne bölge Konseyi ("programı Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) ve Fransız Agence Nationale de la Recherche ve yön Générale de L'Offre de Soins ("programı de Recherche Translationnelle tr Santé" ANR-13-PRTS-0010) hibe için. Fon çalışma tasarım, davranış ve analiz veya bu makalenin hazırlanmasında hiçbir etkisi vardı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>Vitro</em> Denetim konsantrasyonları kültürlü alveoler epitel hücrelerdeki halojenlenmiş gazların yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter