I den här artikeln beskriver vi protokoll av protein uttryck, rening, kristallisering och struktur bestämning av N-terminala domänen för ryanodinreceptorn från diamondback moth (Plutella xylostella).
Utvecklingen av potenta och effektiva insektsmedel inriktning insekt ryanodine receptorer (RyRs) har varit av stort intresse i området i jordbruket skadedjursbekämpning. Hittills har flera diamide insekticider inriktning pest RyRs har kommersialiserats, som genererar omsättning om 2 miljarder US-dollar. Men förståelsen av verkningsmekanismen av RyR-targeting insekticider begränsas av bristen på strukturell information angående insekt RyR. Detta begränsar i sin tur förståelsen av insektsmedel resistensutveckling i skadedjur. Diamondback mal (DBM) är ett förödande skadedjur som förstör korsblommiga grödor i världen, som har också rapporterats att Visa motstånd mot diamide insekticider. Därför är det av stor praktisk betydelse att utveckla nya insekticider inriktning den DBM RyR, särskilt inriktning en region som skiljer sig från traditionella diamide bindningsstället. Här presenterar vi ett protokoll för att strukturellt karakterisera den N-terminala domänen av RyR från DBM. X-ray kristallstrukturen löstes genom molekylär ersätter en upplösning av 2.84 Å, som visar ett beta-klöver fällbara motiv och en kompletterande alpha helix. Detta protokoll kan anpassas för uttryck, rening och strukturell karaktärisering av andra domäner eller proteiner i allmänhet.
Ryanodine receptorer (RyRs) är specifika jonkanaler, som medlar genomträngning av Ca2 + joner över de sarkoplasmatiska Retikulum (SR) membran i muskelcellerna. Därför, de spelar en viktig roll i excitation contractionen koppling processen. I sin funktionella form, RyR monterar som en homo-tetramer med en molekylvikt av > 2 MDa, med varje subenhet bestående av ~ 5000 aminosyra rester. Hos däggdjur finns det tre isoformer: RyR1 – skelettmuskulaturen typ, hjärtmuskulatur typ RyR2- och RyR3-ubiquitously uttryckt i olika vävnader1.
I insekter finns det endast en typ av RyR, som uttrycks i muskulös och nervös vävnad2. Insekt RyR är mer lik däggdjur RyR2 med en sekvens identitet av cirka 47%3. Diamide insekticider inriktning RyR av Lepidoptera och Coleoptera har utvecklats och marknadsförs av stora företag som Bayer (flubendiamid), DuPont (klorantraniliprol) och Syngenta (cyantraniliprole). Sedan lanseringen relativt nyligen har diamide insekticider blivit en av de snabbast växande klassen av insekticider. För närvarande har försäljningen av dessa tre insekticider årligen passerat 2 miljarder US-dollar med en tillväxttakt på mer än 50% sedan 2009 (Agranova).
Nyligen genomförda studier har rapporterat resistensutveckling hos insekter efter några generationer av användningen av dessa insektsmedel4,5,6,7,8. Resistensmutationer i domänen transmembrana av RyRs från diamondback mal (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) och motsvarande positioner i tomat leafminer, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) visar att regionen kan vara inblandade i diamide insektsmedel bindande eftersom denna region är känd för att vara kritiska för gating av channel4,8,9. Trots omfattande forskning på detta område fortfarande de exakta molekylära mekanismerna av diamide insekticider gäckande. Dessutom är det oklart huruvida resistensmutationer påverkar interaktionen med diamides direkt eller allosterically.
Tidigare studier har rapporterat strukturen för flera RyR domäner från däggdjursarter och struktur fullängds däggdjur RyR1 och RyR2 av röntgenkristallografi och cryo-elektronmikroskopi, respektive10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men hittills har ingen struktur av insekt RyR har rapporterats, som förbjuder oss från att förstå funktionen receptor molekylär krångligheter samt insektsmedel molekylära verkningsmekanismer och insektsmedel resistensutveckling.
I detta manuskript presenterar vi en generaliserad protokoll för strukturella karakterisering av N-terminala β-klöver domänen för ryanodinreceptorn från diamondback mal, en destruktiv pest som infekterar korsblommiga grödor i världen22. Konstruktionen utformades enligt den publicera kanin RyR1 NTD crystal strukturer23,24och cryo-EM strukturella modeller16,17,18,19, 20 , 21. Detta är den första högupplösta strukturen som rapporterats för insekt RyR, som avslöjar mekanismen för kanal gating och ger en viktig mall för utvecklingen av artspecifika insekticider använder strukturbaserad design. För struktur klarläggande anställt vi röntgenkristallografi, som är ansedd som den ‘gold standarden’ för protein strukturbestämning på nära atomär upplösning. Även om kristallisation är oförutsägbar och arbetsintensivt, hjälper detta stegvisa protokoll forskare att uttrycka, rena och karakterisera andra domäner av insekt RyR eller några andra proteiner i allmänhet.
I detta papper beskriver vi förfarandet för att recombinantly express, rena, kristallisera och utreda strukturen av DBM RyR NTD. För kristallisering är ett viktigt krav att få proteiner med hög löslighet, renhet och homogenitet. I våra protokoll valde vi att använda pET-28a-HMT vektor eftersom det innehåller en hexahistidine-tagg och MBP tagg, som båda skulle kunna utnyttjas för rening att erhålla en högre fold renhet. Dessutom de MBP tag aids i målproteinet löslighet. Vi renat protein av fem på varandra…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för denna forskning lämnades av: nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nationella natur Science Foundation of China (31320103922, 31230061) och projekt av nationell grundforskning (973) Program för Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi är tacksamma till Personalen på beamline BL17U1 på Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
IPTG | Genview | 367931 | |
HEPES | Genview | 7365459 | |
β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
Sonnicator | Scientz | II-D | |
Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |