Summary
Nós fornecemos um método para a geração, cultivo e análise sistemática de fatias de organotypic derivadas de tumores de pulmão murino. Descrevemos também como otimizar para espessura da fatia e como selecionar as concentrações de drogas para tratar a fatias de tumor.
Abstract
Culturas de explant organotypic tecido primário, que inclui a precisão de corte fatias, representam a arquitetura do tecido tridimensional (3D), bem como as interações multicelulares do tecido nativo. Fatias de tecido imediatamente cortadas da recém ressecadas tumores preservam aspectos espaciais da heterogeneidade intratumor, tornando-os úteis substitutos de biologia na vivo . Cuidado de otimização das condições de preparação e cultivo de fatia de tecido é fundamental para o potencial de diagnóstico preditivo de tumor fatia explants. A este respeito, modelos murino são valiosos, como estes fornecem um fluxo consistente de material do tumor para realizar experiências reprodutíveis e replicar. Este protocolo descreve a cultura de fatias de tumor derivado de tecido de pulmão murino usando uma unidade rotativa de incubação, um sistema que permite a exposição intermitente de tecidos de oxigênio e nutrientes. Nosso trabalho anterior mostrou que o uso de unidades de incubação de giro melhora a viabilidade do tecido, em comparação com outros métodos de cultura, particularmente flutuante fatias e suporta filtro estagnado. Aqui, mostramos ainda mais que a espessura da fatia influencia a viabilidade de fatias culturas, sugerir que a otimização da espessura da fatia deve ser feito para tipos diferentes de tecido. Pronuncia-se OM em funções oncogênicas relevantes, tais como sinalização atividades, infiltração de células do estroma ou expressão de marcadores de diferenciação, exige avaliação de fatias de tecido adjacente para a expressão de marcadores alterada por tratamento medicamentoso ou cultivo próprio. Em resumo, este protocolo descreve a geração de fatias de tumor de pulmão murino e sua cultura em uma unidade de incubação rotativa e demonstra como fatias devem ser analisadas sistematicamente para a expressão de marcadores de tecido heterogêneo, como um pré-requisito antes de estudos de resposta de drogas.
Introduction
Tecidos de tumores sólidos, incluindo câncer de pulmão, apresentam heterogeneidade fenotípica e genética e abrigam microambiente complexo1,2. A interação entre as células do tumor e sua influência microambiente circundante na droga sensibilidade e resistência mecanismos3. Isto sublinha a necessidade de modelos pré-clínicos que pode modelar com precisão complexidades biológicas e funções, atuando em tumores nativos. Precisão de corte fatias imediatamente derivadas de tumores frescas fornecem um recurso exclusivo, como eles têm uma capacidade principal para representar a biologia na vivo , pelo menos por um curto espaço de tempo, incluindo fenótipos espacialmente distribuídos em um tumor individual. Ressecado tumores clínicas são um dos poucos espécimes personalizados que podem ser obtidos de um paciente com câncer, e seu uso diagnóstico merece escrutínio.
A história da organotypic culturas remonta ao século cedo 19th , quando tumores intracranianas humanas eram mão-corte em pedaços de tecido e cultivadas usando os chamados pendurado método drop. Fragmentos de tecido foram anexados uma lamela e permissão para mergulhar em plasma humano heparinizado, após o qual as lamelas foram invertidas, seladas e cultivadas por várias semanas4. Cortar manualmente tumor peças já foram cultivadas usando uma variedade de outros métodos, tais como coágulos plasma5, em meio líquido6, ou em 0,45 µm poro de filtros de tamanho6. O termo "organotypic" foi usado primeiramente em 1954, em um estudo sobre a diferenciação da retina do olho embrião garota7. Isto foi seguido por estudos que utilizados explantes de tecido de pulmão e coração derivados de embriões de pintainho8e explantes de cérebro de ratos adultos9.
Vários métodos de corte foram helicópteros descrito, ou seja manual10,11, Krumdieck tecido fatiador12,13e vibratomes11,14,15, 16. O cortador de tecido Krumdieck gera núcleos do tecido cilíndrico, que depois são cortados em fatias de tecido circular usando um micrótomo. Um vibratome, por outro lado, usa um micrótomo lâmina vibratória. Em um estudo sobre fatias de fígado, foi demonstrado que a Leica vibratome gera mais consistentes e reprodutíveis fatias em comparação com o cortador de Krumdieck15. Fatia de espessuras que variam de 250 a 500 µm foram usadas, e estudos relatam a manutenção da viabilidade e das características morfológicas mesmo até 16 dias14,10,17,18. No entanto, tumores têm perfis metabólicos variáveis que podem afetar as necessidades de nutrientes e parâmetros como a composição de matriz e rigidez do tecido podem influenciar na aeração e fluxo de nutrientes. Portanto, é provável que cada tipo de tecido requer a otimização das condições de corte e cultura.
Métodos de cultivo diferentes foram usados para apoiar a fatia culturas: eu) cultura estacionária interfase, também chamada de cultura estagnada suporte, em que as fatias são colocadas em cima de uma inserção de membrana semi porosas imergida em meio de cultura. Neste, o topo das fatias é exposto ao ar, enquanto a parte inferior é suplementada com nutrientes através da inserção porosa14,19; II) o método de espátula, originalmente desenvolvido para órgãos inteiros de cultura ou fatias de tecido embrionário. Neste, as fatias são colocadas em cima de uma folha de algodão ou filtro suportado por uma grade de metal, e o filtro é embebido em meio de cultura. Para manter os tecidos húmidos, uma fina camada do meio é adicionada em cima as fatias de20,21,22. Esses dois primeiros são chamados culturas interfase ar-líquido; III) culturas de tubo rolo, em que as fatias são colocadas dentro do lado plano de um tubo de plástico contendo meio e tubo lenta rotação assegura que o tecido é coberto com média durante a primeira parte de um ciclo, ou arejado durante o segundo23; IV) rotativa unidades de incubação, em que as fatias intermitentemente são expostas ao meio com nutrientes e aeração. Diferente dos tubos do rolo, neste método, as fatias são colocadas em cima de grades de titânio poroso colocados em 6-poços placas com meio de cultura24.
Fatias de tecido derivado de tumores sólidos ressecados logicamente presentes um modelo atraente ex vivo em que para testar a resposta do tratamento dos agentes anti-câncer, que permitam a avaliação da viabilidade, alvo de atividade de percurso e perfis moleculares de um tumor específico na presença de seu microambiente do tumor nativo. No entanto, para avaliar se as respostas de drogas medidas em fatias de tumor são preditivas de respostas em situ , é importante avaliar em que medida fatias de tecido preservar tumor-específicos funções biológicas como a proliferação celular, diferenciação celular histopatologia específicas ou atividades de sinalização oncogênicas. O impacto do estresse mecânico eliciado durante a preparação da fatia, fatia de manipulação ou adaptações induzida pela cultura, tanto pela qualidade e funções biológicas das fatias de tecido são questões fundamentais, fortemente ligados à capacidade de implementar o tumor derivado fatias de diagnóstico funcional.
Nosso projeto financiado pelo IMI consórcio PREDECT (http://www.predect.eu) visa sistematicamente endereço estas questões fundamentais, através do estudo de explantes de fatia de uma variedade de fontes. Usando fatias derivadas de modelos de câncer de mama, de próstata e de pulmão, este esforço conjunto utilizado qualitativas leituras bem como hematoxilina quantitativa e leituras de eosina (H & E) - com base para demonstrar um requisito para o oxigênio atmosférico e filtro estagnado suportes para sustentar a viabilidade de fatias cultivadas até 72 h. Além disso, análises imuno-histoquímica (IHC) em fatias cultivadas revelaram gradientes de viabilidade intrafatia, evidenciados como gradientes de necrose em fatias derivadas de câncer de pulmão murino não-pequenas células (NSCLC), receptor de estrógeno (ER), HIF1α e γH2AX 25fatias de gradientes em fatias de câncer de mama, ou gradientes de expressão de receptores (AR) de andrógeno no cancro da próstata. Curiosamente, gradientes de viabilidade intrafatia em culturas de 24 h de NSCLC murino foram resgatados pelo cultivo em uma unidade de incubação rotativa, e nosso estudo recente mostrou que a viabilidade foi estendida para 72 h26. Particularmente o lado superior permaneceu mais viável26, endossando que as análises de resposta de droga em fatias melhor são efectuadas neste lado do tecido.
Mesmo que continua a ser uma questão de saber como longe fatias de tecido podem recapitular em situ funções do tumor, eles têm sido extensivamente usados para testar respostas a agentes anti-câncer, incluindo drogas alvo, anticorpos monoclonais e agentes quimioterápicos 10,11,13,14,18,27. Recentemente mostramos que fatias NSCLC murino mostram mudanças dinâmicas em proliferação e oncogênicas atividades sinalização após o cultivo, quando comparado com o cortado recentemente h 0 fatias26. Isto indica que é importante investigar se o alvo em situ funções biológicas são adequadamente preservadas durante o cultivo, antes estudos de perturbação. Apesar destas constatações, mostramos que fatias do tumor podem modelar spatial resposta a terapias alvo, meio drogas tratamentos permanecem breve (24h) e são iniciadas no início de cultivo26. O seguinte protocolo descreve validação importantes aspectos relevantes para o estabelecimento e análise de culturas de fatia do tumor, antes da sua aplicação em testes de drogas farmacológicas.
Protocol
Todos os experimentos de rato descritos neste estudo foram realizados seguindo as orientações do finlandês placa nacional da experimentação Animal e foram aprovados pelo Comitê de Animal Experimental da Universidade de Helsinque e o Estado Provincial Escritório do Sul da Finlândia (licença número ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. preparações antes da corte
- Preparem os seguintes materiais: suporte de amostra vibratome, vibratome de buffer bandeja, placa de cultura de 10 cm, placa de 24, pipeta de 10 mL, menino de pipeta, saco de lixo, 70% EtOH em um tubo de 50 mL para desinfetar os instrumentos e cola de tecido.
- Preparar a vibratome: limpar o porta-lâmina com 70% EtOH, anexar uma lâmina nova e executar uma vibrocheck de acordo com as instruções fornecidas no manual (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
Nota: É importante executar o passo de vibrocheck, pois minimiza a deflexão vertical da lâmina e garante fatias de boa qualidade. - Encha cada um bem da placa de 24 poços com 1 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) suplementado com 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL (HBSS + P/S); manter a placa no gelo.
- Prepare-se F12 cultura suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL estreptomicina, glutamax 2mm, glicose de 22 mM e 10% de soro fetal bovino (FBS).
Nota: Suplementos de meio de cultura e o fator de crescimento de fatia de Tumor podem variar dependendo do tumor de tecido25. - Prepare a quantidade necessária de médio F12 para tratamento de drogas, usando a mesma composição, conforme descrito na etapa 1.4, mas omitindo o FBS.
Nota: Como fatores de crescimento no soro pode afetar a sinalização oncogênica em fatias culturas, meio livre de soro é recomendado para estudos de perturbação de drogas a curto prazo sobre fatias de tumor. Se longo prazo fatia de culturas são analisadas, é importante primeiro avaliar o efeito do meio livre de soro na viabilidade do tecido e marcador de tumor-específicos expressão em culturas de fatia não tratada.
2. coleção de pulmões de Tumor-rolamento
- Eutanásia em um tumor-rolamento do mouse por deslocamento cervical quando mostra sintomas de dificuldade respiratória e perda de peso corporal.
Nota: CO2-mediada por eutanásia é conhecida por induzir condições de hipóxicos nos pulmões, o que podem ter um efeito sobre a viabilidade de fatia ou oncogênicas atividades via desencadeiem uma resposta hipóxica. - Estica o mouse euthanized sobre uma tampa de isopor através da inserção de agulhas 30 G em todas as quatro patas, para que o peito fique exposto.
- Corte a pele do abdômen em direção ao peito e até a região do pescoço. Abri a caixa torácica e em seguida o diafragma para expor o pulmão e o coração. Mantenha a tesoura na posição angular para evitar danos aos tecidos.
- Dissecar os pulmões de tumor-rolamento juntamente com o coração e colocá-los em um tubo de 50 mL contendo 30 mL de gelado HBSS + P/S; Mantenha o tubo bem gelada e prossiga para a próxima etapa tão rapidamente quanto possível.
Nota: Os atrasos no processamento de tumores de pulmão podem alterar funções oncogênicas, sinalização por exemplo actividades de caminho.
3. geração de fatias de Tumor de pulmão de precisão de corte
- Transferi os pulmões de tumor-rolamento em HBSS + P/S em uma placa de cultura de tecido de 10cm mantida dentro de uma capa laminar. Separar os lóbulos pulmonares usando fórceps e a tesoura esterilizada e selecione lóbulos com tumores na superfície de corte.
Nota: Tumores > 3 mm em tamanho são apropriados para cortar. Desde o tecido de pulmão normal envolvendo os compromissos de tumor grande o corte devido a diferenças na rigidez do tecido, tecido do tumor em fase de corte deve ser separado longe o tecido normal, tal que uma região de tumor apuradas enfrenta a lâmina vibratome. - Gerar uma superfície de peça de tecido liso, cortando parte do tecido pulmonar normal que rodeia o tumor com um bisturi estéril e mergulhe a corrediça plana em uma gota de adesivo de cianoacrilato. Monte este lado no suporte de amostra do vibratome para que o tumor enfrenta a lâmina na posição vertical. Deixe a cola secar durante 2-3 min.
Nota: O tecido de pulmão normal colado ao titular do espécime não interfere com corte de tecido do tumor e fatiar é interrompido antes que o tecido normal seja atingido. O tecido do tumor dobra-se, às vezes, devido a textura esponjosa do tecido pulmonar normal colado ao titular do espécime, comprometer a sua posição vertical. Se isso acontecer, Cole um pedaço de tecido de suporte adicionais pulmonar normal ao lado do tecido pulmonar normal pré-montado para reter o tumor na posição vertical (figura 1A iii). - Coloque o suporte de amostra na bandeja de metal tampão e preenchê-lo com frio HBSS + P/S até que o tecido é imerso no buffer. Coloque a bandeja de metal tampão para o banho de gelo branco e adicione gelo para refrescar enquanto cortar o tecido.
- Anexe o banho de gelo branco para o vibratome. Selecione Configurações de corte apropriadas: amplitude variando entre 2,5-2,8, cortando a velocidade entre 0,10-0,14 ms e uma espessura de corte que varia entre 160-250 µm.
Nota: As configurações de corte precisam ser ajustada de acordo com a dureza do tecido. Tecido duro é mais fácil de fatia do tecido mais suave, e tecidos mais macios requer corte com velocidade baixa (0.1-0.12 ms) e maior amplitude (2.6-2.8). Um grande tumor de 4 a 5 mm, normalmente, fornece 15 a 20 fatias de espessura de 200 µM. Para cultivo a curto prazo, tumores murino podem ser cortadas sob condições estéreis semi fora do capô laminar. No entanto, tumores clínicos sempre devem ser cortadas para dentro de uma capa laminar classe II biossegurança para evitar a exposição a agentes infecciosos possíveis no tecido humano. - Usando a pinça estéril, colete as fatias em 1 mL de HBSS em separado poços de uma placa de 24 realizada no gelo, seguindo a pista perto da ordem em que as fatias são cortadas. Marcar todos bem da placa 24-bem de acordo com o plano experimental. Por exemplo, a marca sequencial poços de uma placa de 24 como pontos de tempo de cultura ou como 0 h, o controle do veículo (C), drogas Tratado (T) (figura 1B ii).
Nota: Não perturbe ou puxar o tecido do tumor ao coletar uma fatia, como isto irá alterar a orientação do tumor em relação ao ângulo da lâmina, levando a inconsistências nas espessuras das fatias subsequentes. - Quando todas as fatias são coletadas, transferi-los para grades de titânio (2-3 fatias por grade) colocados em uma placa de 6 contendo 2,5 mL do meio de cultura por bem. Certifique-se de que não há bolhas de ar são formadas entre a grade de titânio e o médio.
- Para carregar uma fatia para a grade, manter a placa de 6 em uma posição angular para que uma porção do meio abrange a grade e coloque a fatia no meio da grelha; Use fórceps para espalhar a fatia se ondula. Carregar as placas 6-poços na unidade de incubação rotativo colocado dentro de uma incubadora umidificada mantida a 37 ° C, com ar de 95% e 5% de CO2e iniciar o ciclo de rotação (Figura 1 i-ii).
Nota: Grades metálicas e as placas de 6-poços precisam ser com precisão peso equilibrado antes de ligar a unidade rotativa. É importante posicionar as fatias no meio da grade para que eles totalmente alternativo entre o ar e fases líquidas durante os ciclos de rotação. Fatias que são colocadas demasiado baixa ou alta não são adequadamente expostas a oxigênio ou nutrientes (Figura 1 eu), que podem comprometer a viabilidade do tecido. É importante seguir a posição da fatia da grelha durante o cultivo, como a fatia ocasionalmente pode deslizar para baixo. Se isso acontecer dentro de 1 – 2 h do início da cultura, sua posição correta e anote que esta amostra pode ser danificada. Fatias que são mispositioned por um período prolongado de tempo devem ser descartadas, como a viabilidade do tecido é significativamente afetada pelo fornecimento de nutrientes e oxigenação inadequada.
- Para carregar uma fatia para a grade, manter a placa de 6 em uma posição angular para que uma porção do meio abrange a grade e coloque a fatia no meio da grelha; Use fórceps para espalhar a fatia se ondula. Carregar as placas 6-poços na unidade de incubação rotativo colocado dentro de uma incubadora umidificada mantida a 37 ° C, com ar de 95% e 5% de CO2e iniciar o ciclo de rotação (Figura 1 i-ii).
- Colete um pedaço de tecido adjacente as fatias culturas como a 0h, inculta, referência. Colete referência pelo menos três fatias para representar o topo, o meio e o centro do tecido a ser cortado. Corrigi o processo e fatias de 0 h imediatamente, conforme descrito em 5.1.
Nota: Se o número de fatias é limitado, por exemplo, se vários tratamentos compostos ou técnicas repetições são feitas, comparações de cada amostra tratada com sua vizinha amostra h 0 podem ser difícil. Em tais casos, use a fatia mais próxima de 0 h (separados de pelo menos 400 – 600 µm) para avaliar a viabilidade do tecido relativo ou expressão de marcadores relevantes no início da cultura. - Para o cultivo a longo prazo, reabastecer o meio de cultura todos os dias. Levante a grade que contém as fatias de tecido usando pinça estéril e colocá-lo em um poço vazio da placa 6-poços; substituir o 70% de médio porte com meio de cultura fresco e coloque a grade volta no meio. Continue o ciclo de rotação, conforme explicado no passo 3.6.
4. tratamento de Tumor fatias com inibidores de pequenas moléculas
- Prepare as necessárias concentrações de compostos no meio de tratamento. Normalmente, uma maior concentração de drogas 10 vezes em comparação com o IC50s medido em culturas de células é necessário para alcançar a inibição de alvo em fatias de tecido. Para evitar a citotoxicidade inespecífica, teste uma gama de concentrações para obter concentração minimamente eficaz para cada composto. Aqui, nós testamos 0,1 – 1 µM da dactolisib de inibidor de PI3K/mTOR e 0,05-0,5 µM do MEK inibidor selumetinib fatias de NSCLC murino.
- Adicione 2,5 mL de mídia com a droga diluída ou DMSO ou outro controle de veículo para a placa de 6. Coloque as grelhas de titânio nos poços.
- Coloque as fatias de tecido para as grades conforme descrito na etapa 3.6.
- Realize tratamentos de veículo ou drogas para 24 h. prosseguir com a fixação de tecidos e transformação das fatias em blocos de parafina, conforme descrito na seção 5.
Nota: Duração do tratamento da droga pode ser otimizada dependendo do objetivo do experimento, levando em consideração a capacidade de fatias de tecido para reter em situ funções tecidos analisadas durante o período de cultura.
5. fixação e processamento das fatias de tecido
- Levante com cuidado a referência h 0 inculta ou fatia cultivada em um papel de filtro embebido em PBS.
- Para fazer isso, adicione 2-3 mL de PBS em uma placa de 10 cm, deixe o flutuador de fatia na PBS e 'peixe' fora levantando a fatia para o papel de filtro com um par de pinças.
- Transferir o papel de filtro em um histocassette e adicionar uma gota de hematoxilina diluída (1:1 em água desionizada) em cima da fatia de tecido para marcar visivelmente a posição da fatia durante as etapas de processamento subsequentes (Figura 1).
- Fechar a gaveta e transferi-lo em solução de formol tamponado neutro de 4%. Fixar os tecidos durante a noite a 4 ° C.
Nota: Ao colocar a fatia em cima do papel de filtro, certifique-se de que a secção superior da fatia é virada para cima; Isto é necessário seguir o topo, meio e parte inferior de uma fatia durante o corte e análise, conforme descrito na etapa 6.3.
- No dia seguinte, transfira as fitas em 70% EtOH e imediatamente prosseguir com a etapa de processamento do tecido parafina-incorporação.
- Antes do processamento do tecido, lavar o histocasettes em 100% EtOH 2 x por 10 min cada. Nesse caso, use uma estação de microondas para processamento do tecido. Selecione o programa utilizado para 1 mm de espessura de tecido e siga as instruções fornecidas no manual (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
Nota: Ao usar outros máquinas de processamento de tecidos, utilize o programa adequado para amostras de tecido fino. - Para a incorporação de parafina, abrir um histocassette e usar um bisturi para levantar cuidadosamente a fatia do papel do filtro. Descartar o papel de filtro e transferir a fatia num molde contendo parafina líquida.
- Pressione o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação, por exemplo, com um peso de plano, para garantir o mesmo corte. Coloque a parte inferior do histocasette em cima do molde, deixe arrefecer o molde em um patê frio por 30 min e separar o molde do bloco de parafina.
Nota: Como alternativa à incorporação horizontal, é possível incorporar a fatia de tumor verticalmente posicionando a fatia na posição vertical. Seções verticais facilmente permitam análise de gradientes na viabilidade ou expressão marcador funcional em uma única seção 25. Análise de gradiente com fatias na horizontal-incorporado requer parafina seccionamento conforme descrito na etapa 6.2.
- Pressione o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação, por exemplo, com um peso de plano, para garantir o mesmo corte. Coloque a parte inferior do histocasette em cima do molde, deixe arrefecer o molde em um patê frio por 30 min e separar o molde do bloco de parafina.
6. processamento e análise de fixada em formol e parafina (FFPE) tecidos
- Prepare 4 µm seções finas dos blocos de fatia de tecido FFPE usando um micrótomo. Quando cortar, ajustar o ângulo do bloco para que a superfície do bloco é orientada horizontalmente em relação à lâmina; Isto é necessário para obter as seções mesmo em todo o tecido.
- Para habilitar a captura de um gradiente de potencial viabilidade induzida pela cultura, migração celular toda a fatias, ou gradientes na expressão de biomarcador em fatias culturas, recolher seções as camadas de topo, centro e parte inferior de cada um o pedaço de tecido no slides de objeto conforme explicado abaixo.
- Primeiro, receber cortes histologicos sequencial da fatia parafina tecido na parte superior das lâminas de vidro. Continue coletando as seções das camadas mais profundas do tecido para o meio, seguido pela parte de baixo dos slides vidro (Figura 1E).
Nota: Para acomodar três seções sobre uma lâmina de vidro, apare o excesso de parafina que cercam a fatia de tecido incorporado. - Permitir que as seções para secar durante a noite a 37 ° C e prossiga com H & E mancha ou imuno-histoquímica, conforme descrito abaixo.
Nota: Pode ocorrer perda do antigenicidade quando seções FFPE são armazenadas a temperaturas elevadas ou por períodos prolongados de tempo. Cortes de parafina são recomendados para ser armazenado a 4 ° C, e análises IHC devem ser efectuadas no prazo de 6 meses após o corte.- Para a coloração H & E, deparaffinize e Re-hidratar as secções de parafina como segue: xileno 3 x por 5 min, 100% EtOH 3 x por 1 min, 96% EtOH 2 x por 1 min, 70% EtOH 1 x 1min e água desionizada 2 x por 1 min.
- Incubar as secções em solução de hematoxilina fresco filtrado por 10 min e lave com água corrente por 5 min. Dip as seções em álcool ácido (1% HCl em 70% EtOH) por 2 vezes e lave sob água corrente por 5 min, seguido de incubação com eosina de 0,5% para 2 m no.
- Após a etapa de eosina, desidrata-se as seções imergindo os slides em soluções de álcool e xilol, como segue: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x por 30 s, xileno 3 x por 1 min. Finalmente, incorpore as seções em um meio de montagem baseada em xilol.
7. análise da viabilidade do tecido e expressão de biomarcador
- Adquira imagens de alta resolução gerando scans de slide inteiro de H & E manchada de slides usando um scanner. Para avaliar a viabilidade do tecido, tire instantâneos dos exames de tecido que representa as seções superior, médio e inferior das fatias.
- Usando software de manipulação de fotos, manualmente desenhe máscaras sobre as áreas de necrose dos tecidos, seguidos de quantificação das regiões necróticas usando MATLAB.
- Calcule a viabilidade relativa das fatias cultivadas por pontos de tempo diferente, em comparação com a fatia de 0 h a mais próxima, como feito na nossa anterior de estudo (Närhi et al, Figura S2B e C)26. Da mesma forma, avaliar potenciais gradientes de viabilidade intrafatia através da quantificação de viabilidade na seção superior, médio e inferior de uma fatia de cultura e calcular a viabilidade relativa de cada seção de sua fatia mais próxima de 0 h.
Nota: Enquanto o mero cultivo de murino fatias NSCLC induz a morte celular necrótica, respostas biológicas às condições de cultura ex vivo variam dependendo do tecido do tumor. Por exemplo, gradientes em HIF1α, ER e macrófagos marcados por F4/80 foram detectados em culturas com suporte filtro fatia derivadas de um câncer de mama modelo25. Portanto, H & E -, bem como análises baseadas em IHC de fatias culturas precisam ser considerados para cada tipo de tecido.
- Execute o IHC sobre os cortes de parafina. O seguinte protocolo IHC é um ponto de partida e requer mais otimização para outros anticorpos. Brevemente, deparaffinize e Re-hidratar as secções de parafina como segue: xileno 3 x por 5 min, 100% EtOH 3 x por 1 min, 96% EtOH 2 x por 1 min, 70% EtoH 1 x por 1 min e água desionizada 2 x por 1 min.
- Para expor os epítopos antigênicos, executar recuperação de antígeno mediada por calor usando ácido cítrico de 10mm a pH 6 em um módulo do PT, seguido de bloqueio com 1% de soro Albumina bovina (BSA) e 10% de soro Normal de cabra (NGS) em PBS 1x por 30 min à temperatura ambiente (21-23 ° C).
- Incubar o anticorpo primário diluído em BSA 1% e 5% NGS em PBS 1x, ou para 1-2 h à temperatura ambiente. Incube com anticorpo secundário anticoelho, durante 30 min à temperatura ambiente, seguida pela detecção usando 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB).
- As seções são counterstained com hematoxilina (diluída a 01:10 em água desionizada) por 30 s e lave sob água da torneira por 5 min, seguido de desidratação por imersão os slides em soluções de álcool e xilol, da seguinte forma: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xileno 3 x ( 1 min cada passo). Finalmente, incorpore as seções em um meio de montagem baseada em xilol.
- Adquirir scans de slide inteiro de corrediças manchadas de IHC, exportá-los como imagens TIFF em uma relação de ampliação de 1:4 usando o usando um visualizador de imagens e executar as quantificações usando o ImageJ.
Nota: como uma alternativa para o scanner, imagens microscópicas em 20 X ou ampliação de 40 X pode ser adquirida por quantificações. Ampliação da imagem pode ser escolhida dependendo do marcador para ser quantificada; imagens de alta ampliação são recomendadas para coloração nuclear, enquanto citoplasmática ou marcadores de membrana podem ser quantificados usando 20 X imagens.- Para a quantificação de marcadores nucleares, neste caso NKX2-1 expressão, converter cada imagem para imagens de 16 bits usando Fiji-ImageJ e fazer upload de imagens para análise de imagem.
- Personalize o pipeline de análise de imagem dependendo da análise. Neste protocolo, usar o pipeline de seguir para a quantificação de núcleos positivos NKX2-1: identificar primário objetos | Medindo a intensidade do objeto | Filtrar objetos (valor mínimo = 0,0025) | Calcular matemática Os resultados são representados como porcentagens dos núcleos DAB-manchadas do número total de núcleos.
Representative Results
A Figura 1 representa o fluxo de trabalho para a geração, o cultivo e a análise de precisão de corte tecido fatias derivado murino tumores NSCLC. Para esta demonstração, utilizamos o tumores de um modelo de rato geneticamente (GEMM), abrigando a ativação condicional de KrasG12D juntamente com a perda de Lkb1 (também conhecido como serina/treonina quinase 11), a seguir designada KL. Iniciação de tumor de reprodução e pulmão de rato foi realizada conforme descrito em26,28. Figura 2A demonstra o efeito da espessura da fatia de tecido sobre a viabilidade de fatias cultivadas por 24 h, usando uma unidade rotativa de incubação. Os resultados mostram que 160 µm de fatias finas contêm grandes áreas de necrose em toda a fatia. Além disso, 250 µm de fatias finas mostram uma necrose gradiente através da fatia em comparação com 200 µm de fatias finas. É provável que a pobre viabilidade global o mais fino 160 µm é causada por manipulação técnica durante o posicionamento das fatias em cima das redes, como estes são frágeis e tendem a enrolar. Por outro lado, quando as fatias são muito espessas, que eles podem se tornar propensos a deficiências em oxigênio ou difusão de nutrientes através das fatias, que em NSCLC murino explants é evidenciado como morte necrótica gradiente25. No entanto, deve notar-se que as fatias com espessuras variáveis podem ser geradas de um tumor, apesar do uso de configurações de vibratome idênticos. Portanto, é aconselhável analisar várias réplicas de amostras diferentes de tumor. Importante, cada tipo de tecido requer otimização de espessura fatia para alcançar viabilidade máxima, como a textura do tecido e a dureza podem afetar o fluxo de nutrientes e oxigenação. Figura 2B -2C ilustra análises quantitativas de IHC de expressão NKX2-1, um marcador de adenocarcinoma do pulmão bem diferenciados (AC) em amostras cultivadas até 72 h e correspondido fatias 0 h. Os resultados mostram que expressão NKX2-1 não é significativamente alterado em fatias cultivadas em comparação com 0 h fatias incultos, sugerindo que o processo de cultivo abertamente não afecta o estatuto de diferenciação do tecido do tumor de AC. Figura 2D demonstra a utilidade de fatias de tecido do tumor para avaliar a eficácia das drogas específicas. Recentemente mostramos esse Kras mutante murino ACs exposição alta expressão de ERK1/2 fosforilada (marcando o aumento da atividade via MAPK) quando comparado aos tumores adenosquamous (ASC), enquanto expressão de 4EBP1 fosforilada (marcação mTOR atividade ) da mesma forma é expressa em tumores ambos AC e ASC. Para testar se estes caminhos podem ser efetivamente direcionados em fatias de tecido, fatias de tecido KL AC foram tratadas com DMSO ou titulado quantidades de compostos, ou seja, 0,1 – 1 µM dactolisib alvo via mTOR ou 0,05-0,5 µM selumetinib alvo via MAPK. Resultados mostram que 1 µM dactolisib ou 0,5 µM de selumetinib são eficazes em inibir a fosforilação de 4EBP1 ou ERK1/2, respectivamente. Além disso, a inibição dose-dependente de fosfoproteínas as alvo indica que fatias de tecido também podem ser utilizadas para validar os anticorpos específicos de fosforilação.
Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho para estabelecimento e análise de explantes de fatia derivado de tumor murino NSCLC. (A) diagrama esquemático descrevendo a recolha e preparação dos pulmões de tumor-rolamento para fatiar. Lobos pulmonares são colhidos de um rato e tecido do tumor é dissecado do tecido normal. A seta preta e asterisco indicam aproximadamente 4 mm e tumores de 1 mm, respectivamente. A seta branca indica colado à superfície do titular da amostra de tecido pulmonar. Os pontos de seta vermelha em uma peça adicional de suporte do tecido pulmonar normal para manter o tumor em uma posição ereta. (B) Vibratome corte e coleção de fatias de tecido. Seta branca indica a direção de corte. Coleção de fatias sequenciais em uma placa de 24 contendo frio HBSS + P/S. As fatias podem ser cultivadas para pontos de tempo diferentes (aqui, 24-72 h) para avaliar a expressão do marcador do tumor-específicos durante o cultivo (linha superior), ou podem ser usadas para realizar tratamentos com drogas. C: o controle do veículo de, t: tratamento de drogas. (C) colocar o pedaço de tecido para cultivo usando unidades de incubação rotativa. Inclinar a placa de 6 até que alguma mídia cobre a parte superior da grade, coloque a fatia de tecido no meio da grade em cima do meio e espalhar a fatia usando fórceps. Certifique-se de que as placas de 6-poços são peso equilibrado para um ciclo de rotação suave. X: indica incorreto, e 
: indica o posicionamento correto da fatia. (D) fotografia do bloco FFPE de uma fatia de tumor. Pontos de seta preta na fatia de tecido parafina corados com hematoxilina. (E) esquema mostrando a ordem de corte as fatias em blocos FFPE; Essas seções podem ser processadas para avaliar a viabilidade do tecido e expressão de biomarcador de tumor-específicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: avaliação da viabilidade e histotype específicos expressão do marcador e tratamento de drogas alvo em fatias de tecido NSCLC. Imagens do (A) representante H & E de fatias de NSCLC AC das espessuras indicadas cultivadas para fatias finas de 24 h. 200 µm mantêm viabilidade melhor em comparação com 160 µm ou 250 µm de fatias finas. Azul escuro representa H & E manchada tecido viável, e rosa indica pseudocolored regiões necróticas. Azul claro indica as regiões excluídas da análise, ou devido à qualidade do tecido pobre ou presença de estroma fibrosa. T1 e T2 representam réplicas biológicas derivadas de dois tumores diferentes. Barra de escala = 500 µm. (B) representante IHC imagens de NKX2-1 expressão em fatias AC cultivadas para os pontos de tempo indicado. A seta indica a área mostrada em maior ampliação. Os resultados mostram que expressão NKX2-1 não é alterado das fatias cultivadas em comparação com fatias 0 h. Barra de escala = 500 µm e 50 µm para ampliações de altas e baixas, respectivamente. (C) a quantificação dos dados mostrados em (B). (D) representante IHC imagens de 4EBP1 fosforilada ou expressão de pERK1/2 em 0 h fatias ou fatias tratadas com DMSO ou titulado quantidades de dactolisib (dact, linha superior) ou fosforilada pERK1/2 expressão na fatia de 0 h, ou fatias tratadas com DMSO ou selumetinib (sel, linha inferior). Caixas quadradas pretas indicam áreas mostradas em maior ampliação. Barra de escala = 1 mm ou 50 µm para ampliação de alta ou baixa, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Diversos complexos em vitro tumor modelos, incluindo culturas 3D e organoids, foram desenvolvidos para recapitular as funções oncogênicas em vivo de29,de tecido do tumor30e arquitetura. No entanto, o estabelecimento de culturas 3D ou organoids envolve a dissociação de tecido e crescimento seletivo de um único tipo de células ou cultura co um seleto poucos tipos de células em um ambiente artificial. Como consequência, tais modelos incompleta capturam a complexidade das interações de heterogeneidade e tumor estroma do tumor. Organotypic fatias de tumor, por outro lado, mantenham as complexidades de arquitetura e biológicos do tecido o tumor em situ , sem manipulação extensiva. Essa capacidade de fatias de tecido para as células de tumor de modelo na sua nativa microambiente os torna particularmente atraente para estudos pré-clínicos. Nós relatamos anteriormente um fluxo de trabalho otimizado para o estabelecimento e análise de fatias de tumor de precisão de corte, e mostrou que, em comparação com o suporte do filtro, uma unidade de incubação rotativa melhorar a viabilidade de curto prazo murino NSCLC fatia culturas25 , 31. no entanto, o cultivo em unidades de giro é tecnicamente desafiador e requer monitoramento constante. Aqui apresentamos um protocolo para geração de pedaço de tecido de tumor e o uso prático de uma unidade de incubação para a cultura deles de giro, bem como métodos para monitorar a capacidade de fatias de capturar em situ biologia tumor, um pré-requisito antes da droga de acompanhamento testes de resposta.
Vários passos críticos no protocolo de assegurar a integridade do tecido e a viabilidade das fatias de tumor. Se o tecido pulmonar normal rodeia o tumor, o vibratome pode gerar fatias com espessura inconsistente ou danificar as fatias, devido a diferenças na textura e rigidez entre tecidos normais e tumor. Assim, é importante remover o tecido circundante do pulmão normal antes da corte de tumor. Outro passo crítico é a espessura de corte, que deve ser cuidadosamente otimizada para cada tipo de tecido. Além disso, uma vez cortada, é fundamental que a fatia é colocada aproximadamente no meio da grade, então para garantir precisão intermitente, mergulhando no meio de cultura e exposição de oxigênio. Finalmente, é importante seguir a posição de uma fatia durante seu período de rotação, como uma fatia pode cair para baixo ao meio; Se isso acontecer, ainda mais, ações podem ser tomadas como explicado no passo 3.6 do protocolo.
Além de manipulação para garantir a integridade de tecido, há também passos críticos na análise IHQ para interpretar como a fatia se assemelha ao tecido nativo. Nosso estudo anterior mostrou que murino tumores NSCLC apresentam heterogeneidade espacial intra-tumor pronuncia-se em atividades de sinalização oncogênica26. Isso significa que o uso de tecido espacialmente distinto fatias para controles ou tratados com drogas amostras podem afetar a interpretação dos dados experimentais confiáveis, e, portanto, estreitamente adjacentes fatias devem ser usadas como controles e amostras de teste. Nós revelou ainda que enquanto a proliferação ou expressão phosphoprotein oncogênica em fatias h 0 inculto recém cortadas eram semelhantes a tumores em situ , fatias culturas mostraram expressão alterada phosphoprotein oncogênica, especificamente alterados p4EBP1 e pSRC, bem como alterada proliferação analisados pelo Ki67 IHC. Expressão p4EBP1 alterado da mesma forma foi detectado em 24 h NSCLC humano e câncer de próstata fatia culturas (Narhi et al., complementar figura S3B-S3C, S5 e S7)26. Esses achados endossam que comparação de fatias cultivadas com sua fatia de inculto h 0 mais próxima é fundamental para avaliar a preservação em situ funções de tumor em fatias culturas.
Apesar de melhorar a viabilidade de organotypic fatias25, há limitações com o sistema de rotor em termos técnicos. Colocar as fatias de tecido para grades de titânio é mais desafiador em comparação para filtrar as inserções, e uma unidade rotativa de incubação pode não estar disponível. Como alternativa, suporta filtro estagnada pode ser usada, mas nesse caso deve ser analisado apenas o lado ar-expostos das fatias, como filtro de ar para gradientes na viabilidade e hipoxia medido pela expressão HIF1α formam-se rapidamente na fatia de filtro-suporte culturas (Davies et al., Figura 5 e figura 7A-7B)25. Temos ainda mais demonstrado que culturas de fatia do tumor podem exibir alterada proliferação e atividades de sinalização oncogênicas em comparação com seus tumores nativo26, possivelmente por causa de respostas de cicatrização de feridas ou adaptação metabólica das fatias de ex vivo cultura32. Embora brutas características morfológicas dos tumores NSCLC murino foram mantidas durante o cultivo de 72 h, induzida pela cultura proliferativas alterações podem afetar classificação exata das fatias cultivadas. Assim, fatias de tecido só devem ser utilizadas para estudos funcionais a curto prazo.
Uso de uma unidade de incubação rotativo, pelo menos parcialmente resgata intrafatia viabilidade ou biomarcador gradientes de expressão, particularmente durante as primeiras 24 horas de cultura. Uma vez validado pela integridade e função, isto fornece material de tecido para estudos funcionais, tais como estudos de tratamento de drogas. Além de drogas resposta de perfilação, expressão-alvo alterado após tratamento medicamentoso pode também beneficiar de validação de anticorpo. Isto é particularmente relevante para a detecção de epítopos murino com anticorpos monoclonais de rato, que tendem a dar coloração de fundo elevado. Além disso, anticorpos bem validados são necessários para obter dados confiáveis e reproduzíveis em contextos clínicos e diagnósticos. Assim, a modulação da abundância ou fosforilação de epitopos relevantes após o tratamento de drogas em fatias de tecidos fornece uma útil aplicação prática na validação de anticorpo. Uma grande vantagem das culturas de fatia do tumor é a capacidade de funções modelo espacialmente distribuídos, incluindo atividades de sinalização oncogênicas ou resposta de droga no tumor ou células do estroma, que os torna um modelo atraente ex vivo . No entanto, fatias giram durante o cultivo, e o processo de cultivo mais pode danificar o tecido particularmente nas bordas. É, portanto, um desafio para overlay precisamente as imagens IHC manchadas de biomarcador de fatias 0 h com as regiões necróticas detectadas em fatias culturas, que compromete a capacidade de ligar precisamente as actividades espaciais biomarcador para resposta da droga. Além disso, respostas necróticas tumor intrínsecos, induzida pela cultura e induzida por drogas são indistinguíveis pelo menos em fatias de tecido NSCLC murino, comprometer a quantificação exata das respostas de droga espacial. Finalmente, o uso de culturas de fatia do tumor permite que um pesquisador para o teste de vários compostos do tumor mesmo, sem a necessidade de tratar os animais, assim, refinação, redução e substituição de experimentos em animais de laboratório.
Como uma aplicação futura, o protocolo descrito pode ser adotado para amostras clínicas tumor sólido. Mais modificações dependentes do tipo de tecido ou otimizações são provavelmente necessárias, começando com os ajustes para as configurações de vibratome incluindo a velocidade de espessura e vibração do fatia para otimizar estes para textura de tumor ou rigidez. Além disso, a exigência nutriente e fator de crescimento pode variar para tecidos de tumor diferente. Como exemplo, fatias de câncer de mama tem sido cultivadas com insulina completada em média13,18. Dado que o material tecido limitada é obtido durante a cirurgia ou biópsia, otimização das culturas de fatia de tumor derivado de paciente pode ser um desafio devido às dificuldades de obtenção de um número suficiente de amostras. Além disso, reprodutibilidade de dados também é contestada pela pronunciada heterogeneidade da amostra de paciente para paciente, nomeadamente a percentagem de células tumorais contra regiões fibróticas ou infiltração do estroma, bem como componentes de tecido necrótico. Finalmente, a aplicação de fatias de tumor em configurações de diagnósticos exigiria investigação da dimensão a qual droga respostas em explantes de fatia de biópsias de pré-tratamento corresponde às respostas de pós-tratamento na vivo .
Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Esta pesquisa trabalho recebeu apoio financeiro da empresa comum de iniciativa de medicamentos inovadores conceder acordo no 115188, o programa de doutorado de Universidade de Helsínquia em bolsas de estudo biomedicina (A.S.N.) e a Sigrid Juselius e Orion-Farmos fundações (E.W.V.). Agradecemos sinceramente membros de consórcio nossa plataforma de fatia de tecido PREDECT (af Taija Hallstrom e Siv Knaappila para suporte em configurar o sistema de rotor e Riku Turkki para suporte com a análise MATLAB. Jouko Siro é agradeceu para captura de fotografias da Figura 1. Agradecemos a equipe do FIMM WebMicroscope para digitalizar slides histológicas, e apoio do centro de Animal de laboratório para criação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
| Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
| Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
| Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
| Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
| Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
| 10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
| Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
| 50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
| PBS | Lonza | BE17-517Q | |
| Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
| Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
| Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
| KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
| Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
| Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
| Citric acid | Sigma | C1909 | |
| PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
| Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
| Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
| Eosin | Sigma | E4382 | |
| NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
| pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
| p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
| BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
| Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
| DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
| Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
| Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
| Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
| MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
| Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
| Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
| CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |
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