Summary
نحن نقدم طريقة لتوليد وزراعة والتحليل المنهجي لشرائح أورجانوتيبيك المستمدة من أورام الرئة موريني. ونحن أيضا وصف كيفية تحسين لسمك الشريحة، وكيفية تحديد تركيزات العقاقير لعلاج الورم شرائح.
Abstract
أورجانوتيبيك الأنسجة الأولية explant الثقافات، التي تشمل دقة قطع شرائح، تمثل بنية ثلاثية الأبعاد (3-D) الأنسجة، فضلا عن تفاعلات متعددة الخلايا من الأنسجة الأصلية. شرائح الأنسجة مباشرة قطع من الأورام مستأصل حديثا الحفاظ على الجوانب المكانية لتغاير إينتراتومور، مما يجعلها مفيدة الأمهات البديلات في فيفو البيولوجيا. دقيق الأمثل لظروف إعداد وزراعة شريحة الأنسجة الأساسية لإمكانات التشخيص التنبؤي للورم شريحة اكسبلانتس. وفي هذا الصدد، نماذج مورين قيمة، كما توفر هذه تدفق المواد الورم لإجراء تجارب استنساخه وتكرار متسقة. ويصف هذا البروتوكول استزراع شرائح الأنسجة المستمدة من ورم الرئة مورين استخدام وحدة حضانة الدورية، وهو نظام يمكن التعرض المتقطع من الأنسجة بالأكسجين والمواد الغذائية. أعمالنا السابقة أظهرت أن استخدام وحدات الحضانة بالتناوب ويحسن إمكانية مقارنة بالأساليب الأخرى الثقافة، لا سيما العائمة شرائح الأنسجة ويدعم تصفية الراكدة. هنا، نحن كذلك تظهر أن شريحة سمك يؤثر على استمرارية من شرائح المثقفين، مما يوحي بأن الاستغلال الأمثل لشريحة سمك وينبغي أن يتم لأنواع مختلفة من الأنسجة. وضوحاً ايث في وظائف النمطان ذات الصلة، مثل الإشارات الأنشطة، تسلل الخلايا اللحمية أو التعبير عن علامات التمايز، يتطلب تقييم شرائح النسيج المجاور للتعبير عن علامات تم تعديلها من قبل العلاج من تعاطي المخدرات أو زراعة نفسها. باختصار، هذا البروتوكول يصف توليد شرائح ورم الرئة مورين وثقافتهم في وحدة حضانة الدورية ويوضح كيف يجب أن يتم تحليل الشرائح بشكل منتظم للتعبير عن علامات النسيج غير المتجانس، كشرط مسبق قبل دراسات استجابة المخدرات.
Introduction
أنسجة الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان الرئة، ويحمل التغايرية المظهرية والوراثية، وميناء ميكرونفيرونمينتس المعقدة1،2. التفاعل بين الخلايا السرطانية وتأثيرها المكروية المحيطة على المخدرات الحساسية والمقاومة آليات3. وهذا يبرز الحاجة إلى نماذج الإكلينيكية التي يمكن دقة نموذج تعقيدات البيولوجية ووظائف يعملون بأورام أصلية. دقة قطع شرائح المستمدة مباشرة من أورام جديدة توفر موردا فريداً، كما لديهم قدرة رئيسية لتمثيل في فيفو البيولوجيا، على الأقل لنافذة قصيرة من الزمن، بما في ذلك تعمل موزعة مكانياً في ورم فردية. مستأصل الأورام السريرية هي واحدة من العينات الشخصية القليلة التي يمكن الحصول عليها من مريض سرطان، واستخدام التشخيص تستحق التمحيص.
معلقة تاريخ أورجانوتيبيك الثقافات يعود تاريخها إلى القرنال 19 في وقت مبكر، عندما كانت الأورام داخل الجمجمة البشرية قطع اليد إلى قطع الأنسجة ومثقف باستخدام ما يسمى بأسلوب الإسقاط. أجزاء الأنسجة تم إرفاقه ساترة ويسمح لتراجع في البلازما البشرية هيبارينيزيد، مقلوب بعد ذلك كوفيرسليبس، ومختومة ومثقف لعدة أسابيع4. قطع الورم القطع منذ ذلك الوقت مثقف استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الأخرى، كما هو الحال في البلازما جلطات5، في وسائل الإعلام السائل6، أو على 0.45 ميكرومتر المسامية حجم مرشحات6يدوياً. استخدم مصطلح "أورجانوتيبيك" لأول مرة في عام 1954، في دراسة عن التمايز شبكية العين الجنين الفرخ7. وأعقب هذه الدراسات التي تستخدم explants أنسجة الرئة والقلب المستمدة من الأجنة الفرخ8، و explants الدماغ من الفئران الكبار9.
مختلف أساليب تشريح كانت المروحيات الموصوفة، هي دليل10،11، كرومديك الأنسجة تقطيع12،13و، فيبراتوميس11،،من1415 16. يولد تقطيع اللحم والأنسجة كرومديك الأنسجة أسطواني النوى، والتي هي شرائح ثم إلى شرائح دائرية الأنسجة باستخدام مبضع. من ناحية أخرى، يستخدم فيبرتوم، مبضع بليد تهتز. وفي دراسة عن شرائح الكبد، تبين أن يولد فيبرتوم إيكا شرائح استنساخه ويتفق أكثر مقارنة مع تقطيع كرومديك15. استخدمت سمك شريحة تتراوح ما بين 250 إلى 500 ميكرومتر، والدراسات تقرير الحفاظ على استمرارية والخصائص المورفولوجية بل حتى 16 يوما14،10،،من1718. ومع ذلك، أورام التشكيلات الجانبية الأيضية المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الاحتياجات من المغذيات، والمعلمات مثل تكوين مصفوفة وتصلب الأنسجة يمكن أن تؤثر في التهوية وتدفق المواد الغذائية. ولذلك فمن المرجح أن كل نوع من أنواع الأنسجة يتطلب الاستغلال الأمثل للظروف تشريح والثقافة.
وقد استخدمت أساليب زراعة مختلفة لدعم الثقافات شريحة: أنا) ثقافة الطور البيني ثابتة، وتسمى أيضا الثقافة الدعم الراكدة، التي توضع الشرائح فوق إدراج غشاء شبه مسامية منغمسين في الأجلين المتوسط والثقافة. في هذا الصدد، يتعرض أعلى الشرائح في الهواء، في حين تستكمل الجزء السفلي مع المواد الغذائية عن طريق ال14،إدراج مسامية19؛ ثانيا) الأسلوب مجرفة، وضعت أصلاً لأجهزة الثقافة كله أو شرائح الأنسجة الجنينية. في هذا الصدد، شرائح توضع على رأس ورقة القطن أو مرشح يدعمه شبكة معدنية، وهي غارقة في عامل التصفية على المديين المتوسط والثقافة. للحفاظ الأنسجة الرطبة، يتم إضافة طبقة رقيقة من المتوسطة أعلى الشرائح20،،من2122. وتسمى هذه الأولين حتى الطور البيني الهواء السائل الثقافات؛ ثالثا) الاسطوانة أنبوب الثقافات، التي توضع الشرائح داخل الجانب المسطح من أنبوب البلاستيك تحتوي على المتوسط، ويضمن التناوب أنبوب بطيء هو مغطاة المتوسطة خلال الجزء الأول من دورة الأنسجة، أو الرغوة أثناء الثاني23؛ رابعا) تناوب الوحدات الحضانة، التي تتعرض شرائح بشكل متقطع للمتوسطة مع المواد المغذية والتهوية. مختلفة من أنابيب الاسطوانة، وفي هذه الطريقة توضع الشرائح على رأس شبكات التيتانيوم مسامية توضع في لوحات 6-جيدا مع الثقافة المتوسطة24.
شرائح الأنسجة المستمدة من الأورام الصلبة مستأصل منطقياً هذا نموذج جاذبية فيفو السابقين لاختبار الاستجابة للمعالجة العوامل المضادة للسرطان، كما أنها تسمح بتقييم الجدوى ويستهدف نشاط المسار، وملامح الجزيئية وجود ورم محدد حضور به الأم وورم المكروية. ومع ذلك، تقييم ما إذا كانت الردود المخدرات تقاس في شرائح الورم التنبؤية للردود في الموقع ، من المهم تقييم ما شرائح الأنسجة مدى الحفاظ على الوظائف البيولوجية الخاصة بالورم مثل انتشار الخلايا، تمايز الخلايا الخاصة بالتشريح المرضى أو أنشطة إشارات النمطان. أثر الإجهاد الميكانيكي وأثارت أثناء إعداد شريحة أو التعامل مع شريحة أدابتيونس الناجمة عن الثقافة في كل من الجودة والوظائف البيولوجية لشرائح الأنسجة هي المسائل الأساسية، مشددة مرتبطة بالقدرة على تنفيذ المستمدة من ورم شرائح للتشخيص الوظيفي.
لدينا مشروع اتحاد تموله IMI بريديكت (http://www.predect.eu) يحدد منهجياً العنوان هذه الأسئلة الأساسية، عن طريق دراسة explants شريحة من مجموعة متنوعة من المصادر. باستخدام شرائح المستمدة من نماذج سرطان الثدي والبروستاتا والرئة، استخدمت هذا الجهد المشترك read-outs النوعي، فضلا عن توضع الكمية وقراءات ويوزين (H & E)-على أساس إثبات شرط للأكسجين في الغلاف الجوي وتصفية راكدة وتؤيد للحفاظ على استمرارية شرائح مثقف حتى ح 72. وعلاوة على ذلك، كشفت التحاليل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) على شرائح مثقف التدرجات البقاء داخل شريحة، يتضح نخر التدرجات في شرائح المستمدة من مورين غير صغيرة خلية سرطان الرئة (NSCLC)، مستقبلات الإستروجين (ER)، HIF1α و γH2AX التدرجات في شرائح سرطان الثدي، أو تدرجات التعبير مستقبلات (ع) الاندروجين في سرطان البروستات شرائح25. من المثير للاهتمام، أنقذت شريحة داخل صلاحية التدرجات في الثقافات ح 24 من NSCLC مورين زراعة في وحدة الدورية لحضانة، ولدينا دراسة أجريت مؤخرا أظهرت أن بقاء مددت إلى 72 ح26. وظل لا سيما الجانب العلوي أصلح26، يؤيد أن تحاليل المخدرات ردا على شرائح تنفذ أفضل على هذا الجانب من الأنسجة.
حتى لو أنه يبقى سؤال كيف الآن شرائح الأنسجة يمكن إيجاز مهام ورم في الموقع ، وقد استخدمت على نطاق واسع لاختبار ردود على وكلاء المضادة للسرطان، بما في ذلك الأدوية المستهدفة، والأجسام المضادة ووكلاء العلاج الكيميائي 10،،من1113،14،،من1827. نحن أظهرت مؤخرا أن مورين NSCLC شرائح تظهر التغيرات الدينامية في الانتشار وشرائح النمطان أنشطة إشارات بعد زراعة عند مقارنتها بقطع طازجة 0 ح26. وهذا يشير إلى أن من المهم للتحقيق في ما إذا كانت الوظائف البيولوجية المستهدفة في الموقع يتم الاحتفاظ مناسب أثناء زراعة، قبل دراسات اضطراب. وعلى الرغم من هذه النتائج، واظهرنا أن شرائح الورم يمكن النموذج المكاني استجابة للعلاجات المستهدفة، خضم المخدرات تظل العلاجات موجزة (24 ساعة)، والتي بدأت في بداية استزراع26. البروتوكول التالي يصف مهمة التحقق من الجوانب ذات الصلة بإنشاء وتحليل الثقافات شريحة الورم، قبل تطبيقها في اختبار العقاقير الدوائية.
Protocol
جميع التجارب الماوس الموصوفة في هذه الدراسة أجريت باتباع المبادئ التوجيهية من "المجلس الوطني الفنلندي للحيوان التجريب"، ووافقت عليها "اللجنة الحيوانات التجريبية" جامعة هلسنكي والمقاطعات الدولة مكتب جنوب فنلندا (ترخيص رقم ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1-الأعمال التحضيرية قبل تقطيع
- الحفاظ على المواد التالية جاهزة: فيبرتوم العينة حامل، فيبرتوم المخزن المؤقت صينية، لوحة الثقافة 10 سم، ولوحة 24-جيدا، والماصة 10 مل، الصبي ماصة، كيس النفايات، 70% EtOH في أنبوب 50 مل لتطهير الأدوات، والغراء الأنسجة.
- إعداد فيبرتوم: مسح صاحب شفرة مع 70% EtOH، إرفاق شفرة جديدة، وتؤدي فيبروتشيك وفقا للتعليمات الواردة في الدليل (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
ملاحظة: من المهم تنفيذ الخطوة فيبروتشيك، كما أنه يقلل من الانحراف الرأسي النصل ويضمن الشرائح ذات نوعية جيدة. - ملء كل من لوحة 24-جيدا مع 1 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) تستكمل مع البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (حبس + P/S)؛ تبقى لوحة على الجليد.
- إعداد F12 الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 100 يو/مليلتر البنسلين 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، جلوتاماكس 2 مم، 22 مم الجلوكوز و 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
ملاحظة: يمكن أن تختلف عن شريحة ورم المتوسطة الثقافة وعامل النمو مكملات أنسجة الورم25. - إعداد الكمية المطلوبة من المتوسطة F12 للعلاج من تعاطي المخدرات، باستخدام نفس التكوين كما هو موضح في الخطوة 1، 4، ولكن إهمال FBS.
ملاحظة: نظراً لعوامل النمو في المصل قد تؤثر على إشارات النمطان شرائح مثقف، ينصح المتوسطة خالية من المصل للمخدرات اضطراب الدراسات القصيرة الأجل على شرائح الورم. إذا كان يتم تحليل الثقافات شريحة الأطول أجلاً، من المهم أولاً تقييم أثر المتوسطة خالية من المصل على بقاء الأنسجة والتعبير علامة خاصة بورم في الثقافات شريحة غير المعالجة.
2-جمع الرئتين الحاملة للورم
- Euthanize ماوس الحاملة لورم بعنق الرحم التفكك عندما يظهر أعراض التنفس شاقة وفقدان وزن الجسم.
ملاحظة: أول أكسيد الكربون2-القتل الرحيم وساطة المعروف للحث على شروط التاكسج في الرئتين، التي قد يكون لها تأثير على صلاحية الشريحة أو النمطان الأنشطة عن طريق التماس رد التاكسج. - تمتد الماوس يوثانيزيد على غطاء الستايروفوم بإدخال إبر ز 30 في جميع الكفوف الأربع، حيث أنه يتم كشفها في الصدر.
- قص فتح الجلد من البطن نحو الصدر، وتصل إلى منطقة الرقبة. قص فتح القفص الصدري، ومن ثم الحجاب الحاجز للكشف على الرئتين والقلب. يبقى المقص في موقع زاوية لتجنب تلف الأنسجة.
- تشريح الرئتين الحاملة للورم جنبا إلى جنب مع القلب ووضعها في أنبوب 50 مل تحتوي على 30 مل من المثلج حبس + P/S؛ إبقاء الأنبوب المثلج والمضي قدما إلى الخطوة التالية، في أسرع وقت ممكن.
ملاحظة: التأخير في معالجة أورام الرئة قد يغير النمطان المهام، على سبيل المثال يشير إلى أنشطة المسار.
3-جيل ورم الرئة دقة قطع شرائح
- نقل الرئتين الحاملة لاستئصال ورم في هبس + P/S إلى طبق استنبات الأنسجة 10 سم تبقى داخل غطاء الصفحي. فصل الفصوص الرئة باستخدام مقص معقم والملقط، وحدد الفصوص مع الأورام على السطح للتقطيع.
ملاحظة: الأورام > 3 مم في الحجم وتصلح للتقطيع. منذ أنسجة الرئة العادية المحيطة بتنازلات كبيرة الورم التقطيع بسبب الاختلافات في تصلب الأنسجة، ينبغي فصل ورم الأنسجة تمر تشريح بعيداً عن الأنسجة الطبيعية، مثل أن يواجه منطقة ورم المطهرة بليد فيبرتوم. - إنشاء سطح قطعة نسيج مسطحة بقطع جزء من أنسجة الرئة العادية التي تحيط الورم بعيداً مع مشرط معقم، وتراجع الشريحة شقة في قطره من مادة لاصقة cyanoacrylate. جبل هذا الجانب على حامل فيبرتوم عينة حتى يواجه الورم بليد في وضع رأسي. اسمحوا الغراء جافة لمدة 2 – 3 دقيقة.
ملاحظة: أنسجة الرئة طبيعية لصقها على صاحب العينة لا تتداخل مع تشريح أنسجة الورم، وتقطيع توقفت قبل التوصل إلى أنسجة طبيعية. في بعض الأحيان الانحناءات أنسجة الورم سبب الاسفنجية نسيج من أنسجة الرئة طبيعية لصقها على صاحب العينة، والمساس وضع مستقيم. إذا حدث هذا، الصق قطعة من أنسجة الرئة طبيعية إضافية الدعم بجوار أنسجة الرئة طبيعية المحملة مسبقاً على الاحتفاظ الورم في وضع رأسي (الشكل 1A الثالث). - مكان صاحب العينة في علبة معدنية المخزن المؤقت وملئه بالبرد هبس + P/S حتى الأنسجة هي مغمورة في المخزن المؤقت. ضع علبة معدنية المخزن المؤقت إلى حمام الثلج الأبيض وإضافة الثلج حتى للحفاظ على النسيج بارد أثناء التقطيع.
- إرفاق حمام الثلج الأبيض فيبرتوم. حدد الإعدادات المناسبة تشريح: السعة تتراوح ما بين 2.5-2.8، تشريح السرعة بين 0.10 0.14 مرض التصلب العصبي المتعدد، وسمك قطع تتراوح ما بين 160 – 250 ميكرون.
ملاحظة: إعدادات تشريح تحتاج إلى تعديلها وفقا لصلابة الأنسجة. أسهل لشريحة من الأنسجة ليونة الأنسجة الصلبة، والأنسجة ليونة يتطلب تشريح بسرعة أقل (0.1 – 0.12 ms) والسعة أعلى (2.6-2.8). عادة ما توفر ورم كبير من 4 – 5 مم شرائح 15 – 20 من 200 ميكرون سمك. لزراعة قصيرة الأجل، يمكن شرائح الأورام مورين تحت ظروف شبه معقمة خارج هود الصفحي. ومع ذلك، ينبغي دائماً شرائح الأورام السريري داخل فئة الثاني السلامة الأحيائية الصفحي غطاء لتفادي التعرض للعوامل المعدية الممكن في الأنسجة البشرية. - استخدام الملقط العقيمة، جمع الشرائح في 1 مل من حبس في آبار منفصلة من صفيحة 24-جيدا في الجليد، وعن كثب تتبع من النظام التي هي شرائح شرائح. وضع علامة على كل جيد من لوحة 24-جيدا وفقا لخطة تجريبية. على سبيل المثال، المخدرات الآبار مارك متسلسلة من صفيحة 24-جيدا كثقافة الوقت نقطة أو 0 ح، مراقبة المركبات (ج)، المعالجة (T) (1B الشكل الثاني).
ملاحظة: لا تخل أو سحب الأنسجة الورم حين جمع شريحة، وهذا سوف يغير التوجه للورم فيما يتعلق بالزاوية من النصل، مما يؤدي إلى عدم الاتساق في سمك الشرائح اللاحقة. - عندما يتم جمع كل الشرائح، نقلها على التيتانيوم الشبكات (2-3 شرائح في الشبكة) توضع في صفيحة 6-البئر الذي يحتوي على 2.5 مل متوسطة الثقافة الواحدة وكذلك. تأكد من أنه لا توجد فقاعات الهواء تتشكل بين الشبكة التيتانيوم والمتوسطة.
- لتحميل شريحة إلى الشبكة وإبقاء لوحة 6-جيدا في وضع زاوية حيث أنه يغطي جزء من المتوسط الشبكة ووضع الشريحة في المتوسط على الشبكة؛ استخدام الملقط للشريحة إذا كان تجعيد الشعر. تحميل لوحات 6-جيدا على وحدة الحضانة تتولى وضعها داخل حاضنة هوميديفيد الحفاظ على 37 درجة مئوية مع الهواء 95% و 5% CO2، وبدء دورة التناوب (الشكل 1 i-ii).
ملاحظة: شبكات معدنية وألواح 6-كذلك تحتاج إلى تكون دقة الوزن متوازنة قبل تشغيل وحدة الدورية. من المهم وضع الشرائح في وسط الشبكة حيث أنها البديل الكامل بين الهواء ومراحل السائل خلال دورات التناوب. الشرائح التي يتم وضعها منخفضة جداً أو عالية لا يتعرضون على نحو ملائم للأكسجين أو المواد الغذائية (الشكل 1 أنا)، التي يمكن أن تعرض للخطر سلامة الأنسجة. من المهم أن تتبع موقف الشريحة على الشبكة أثناء زراعة، كما يمكن أحياناً الشريحة الشريحة أسفل. إذا كان هذا يحدث ضمن ح 1 – 2 من ظهور ثقافة، تصحيح موقفها ويدون أن هذا النموذج قد يكون معطوباً. يجب أن يتم تجاهل الشرائح التي يتم ميسبوسيتيونيد لفترة ممتدة من الوقت، كصلاحية الأنسجة يتأثر إلى حد كبير الأوكسجين غير لائق والإمداد بالمواد الغذائية.
- لتحميل شريحة إلى الشبكة وإبقاء لوحة 6-جيدا في وضع زاوية حيث أنه يغطي جزء من المتوسط الشبكة ووضع الشريحة في المتوسط على الشبكة؛ استخدام الملقط للشريحة إذا كان تجعيد الشعر. تحميل لوحات 6-جيدا على وحدة الحضانة تتولى وضعها داخل حاضنة هوميديفيد الحفاظ على 37 درجة مئوية مع الهواء 95% و 5% CO2، وبدء دورة التناوب (الشكل 1 i-ii).
- جمع شريحة نسيج المجاور لشرائح مثقف ح 0، جاهل، مرجع. جمع الإشارة على الأقل ثلاث شرائح تمثل الأعلى والأوسط ومركز الأنسجة يجري شرائح. إصلاح ح 0 شرائح فورا والعملية كما هو موضح في 5.1.
ملاحظة: إذا كان العدد شرائح محدودة، مثلاً، إذا فعلت العديد من العلاجات المركبة أو replicates التقنية، إجراء مقارنات لكل عينة تعامل مع العينة 0 ح المجاورة يمكن صعبة. في مثل هذه الحالات، استخدم شريحة 0 ح أقرب (على الأقل 400 – 600 ميكرون وبصرف النظر) لتقييم صلاحية الأنسجة النسبي أو التعبير عن علامات ذات الصلة في ظهور ثقافة. - لزراعة طويلة الأجل، وتجديد المتوسطة الثقافة كل يوم. رفع الشبكة التي تحتوي على شرائح الأنسجة باستخدام الملقط العقيمة، ووضعه في بئر فارغة من لوحة 6-جيدا؛ استبدال 70 في المائة المتوسط المتوسطة ثقافة جديدة، ووضع الشبكة مرة أخرى في المتوسط. مواصلة دورة التناوب كما هو موضح في الخطوة 3، 6.
4-معاملة شرائح الورم مع مثبطات جزيء صغير
- إعداد تركيزات مركبات في المتوسط المعاملة المطلوبة. عادة، إذ أعلى تركيز المخدرات مقارنة IC50s تقاس بالثقافات الخلية مطلوب لتحقيق هدف تثبيط شرائح الأنسجة. لتجنب سيتوتوكسيسيتي غير محدد، اختبار مجموعة من تركيزات للحصول على التركيز الأدنى الفعال لكل مجمع. هنا، نحن اختبار 0.1 – 1 ميكرومتر داكتوليسيب المانع PI3K/mTOR و 0.05 – 0.5 ميكرومتر سيلوميتينيب مثبط لمجاهدى خلق على موريني NSCLC شرائح.
- إضافة 2.5 مل من وسائل الإعلام مع الدواء المخفف أو [دمس] أو أخرى التحكم بالسيارة في لوحة 6-جيدا. وضع شبكات التيتانيوم في الآبار.
- وضع شرائح الأنسجة على الشبكات كما هو موضح في الخطوة 3، 6.
- تنفيذ العلاجات المركبة أو المخدرات 24 h. المضي قدما مع تثبيت الأنسجة وتجهيز الشرائح إلى كتل البارافين كما هو موضح في القسم 5.
ملاحظة: مدة علاج المخدرات يمكن أن يكون الأمثل اعتماداً على هدف التجربة، مع الأخذ بالاعتبار قدرة شرائح الأنسجة الاحتفاظ بها في الموقع وظائف الأنسجة تحليلها أثناء فترة الثقافة.
5-تثبيت وتجهيز شرائح الأنسجة
- ورفع بعناية المرجع ح 0 جاهل أو مثقف شريحة على ورقة تصفية غارقة في برنامج تلفزيوني.
- للقيام بهذا، أضف 2-3 مل من برنامج تلفزيوني في صفيحة 10 سم وتعويم شريحة في برنامج تلفزيوني 'الأسماك' أنه قبل رفع شريحة على ورقة تصفية مع زوج من الملقط.
- نقل ورقة تصفية في هيستوكاسيتي، وإضافة قطره توضع المخفف (1:1 في المياه) على أعلى شريحة الأنسجة وضوح وضع علامة على موضع الشريحة أثناء خطوات المعالجة اللاحقة (الشكل 1).
- إغلاق الكاسيت، وتحويلها إلى 4% فورمالين مخزنة محايدة الحل. إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في حين وضع الشريحة على رأس الورقة عامل التصفية، تأكد من أن يواجه القسم العلوي من الشريحة إلى أعلى؛ هذا ضروري لمتابعة الأعلى والأوسط، والقسم السفلي من شريحة أثناء تقطيع والتحليل كما هو موضح في الخطوة 6.3.
- في اليوم التالي، نقل الأشرطة إلى 70% EtOH، والشروع فورا بخطوة معالجة الأنسجة التضمين البارافين.
- قبل تجهيز الأنسجة، تغسل في هيستوكاسيتيس في 100% EtOH 2 x لمدة 10 دقائق. وفي هذه الحالة، استخدام محطة تعمل بالموجات الدقيقة لمعالجة الأنسجة. حدد البرنامج الذي تم استخدامه لسماكة الأنسجة 1 مم، واتبع التعليمات الواردة في الدليل (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
ملاحظة: عند استخدام أنسجة أخرى تجهيز الآلات، استخدام برنامج مناسب لعينات الأنسجة رقيقة. - لتضمين البارافين، فتح هيستوكاسيتي واستخدام مشرط لرفع الشريحة من ورق الترشيح بعناية. تجاهل ورق الترشيح، ونقل الشريحة إلى قالب الذي يحتوي على البارافين السائل.
- اضغط الأنسجة ضد الجزء السفلي من القالب التضمين، على سبيل المثال مع وزن مسطح، لضمان حتى تمزيقها. ضع الجزء السفلي من هيستوكاسيتي على رأس العفن والسماح لتبرد العفن في بات بارد لمدة 30 دقيقة، وفصل العفن من كتلة البارافين.
ملاحظة: كبديل للدمج الأفقي، فمن الممكن لتضمين شريحة الورم رأسياً عن طريق وضع الشريحة في وضع رأسي. المقاطع العمودية سهولة إتاحة التحليل التدرجات في البقاء أو تعبير العلامة الفنية في قسم واحد 25. ويتطلب تحليل الانحدار باستخدام الشرائح أفقياً-جزءا لا يتجزأ من البارافين تمزيقها كما هو موضح في الخطوة 6، 2.
- اضغط الأنسجة ضد الجزء السفلي من القالب التضمين، على سبيل المثال مع وزن مسطح، لضمان حتى تمزيقها. ضع الجزء السفلي من هيستوكاسيتي على رأس العفن والسماح لتبرد العفن في بات بارد لمدة 30 دقيقة، وفصل العفن من كتلة البارافين.
6-تجهيز وتحليل الفورمالين--الثابتة وجزءاً لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة
- إعداد 4 أقسام رقيقة ميكرومتر كتل شريحة الأنسجة FFPE باستخدام مبضع. عند تقطيع، ضبط زاوية الكتلة حيث أن سطح الكتلة تتجه أفقياً فيما يتعلق بالشفرة؛ وهذا ضروري للحصول على مقاطع حتى في جميع أنحاء الأنسجة.
- لتمكين التقاط المحتملة الناجمة عن ثقافة السلامة التدرج، والهجرة الخلية عبر شرائح، أو التدرجات في التعبير العلامات البيولوجية عبر شرائح مثقف، جمع مقاطع من طبقات أعلى ووسط وأسفل كل شريحة الأنسجة على الشرائح كائن كما هو موضح أدناه.
- جمع أقسام الأنسجة متسلسلة من شريحة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين أولاً في الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية. يواصل جمع الفروع من أعمق طبقات الأنسجة في وسط متبوعاً بالجزء السفلي من الشرائح الزجاجية (الشكل 1E).
ملاحظة: لاستيعاب ثلاثة أقسام على شريحة زجاجية، تقليم بعيداً فائض البارافين المحيطة بالشريحة جزءا لا يتجزأ من النسيج. - يسمح بوجود المقاطع للمبيت الجافة في 37 درجة مئوية، والمضي قدما في تلطيخ ح & ه أو إيمونوهيستوتشيميستري كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: يمكن أن يحدث فقدان أنتيجينيسيتي عندما يتم تخزين المقاطع فب في درجات حرارة عالية أو لفترات طويلة من الزمن. مقاطع البارافين ينصح بتخزينها في 4 درجات مئوية، وأن تجري تحليلات للمدينة في غضون 6 أشهر بعد تمزيقها.- لتلوين ح & ه، ديبارافينيزي وترطيب مقاطع البارافين كما يلي: زيلين نفط 3 x لمدة 5 دقائق، 100% EtOH 3 x ل 1 دقيقة، 96% EtOH 2 x ل 1 دقيقة، 70% EtOH 1 x 1 دقيقة، والمياه 2 x ل 1 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الحل توضع المصفاة طازجة لمدة 10 دقائق، وتغسل تحت تشغيل ماء الصنبور لأدنى 5 Dip المقاطع في الكحول حمض (1% HCl في 70% EtOH) 2 مرات، والمياه والصرف الصحي تحت إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق تليها الحضانة مع ويوزين 0.5% 2 م في.
- عقب الخطوة ويوزين، يذوي المقاطع التي غمر الشرائح في حلول الكحول وزيلين نفط، على النحو التالي: 96% EtOH 2 x ل 15 ق، 100% EtOH 3 x ل 30 ثانية، زيلين نفط 3 x ل 1 دقيقة. وأخيراً، تضمين المقاطع في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
7-تحليل جدوى الأنسجة والتعبير العلامات البيولوجية
- الحصول على صور عالية الدقة عن طريق توليد مسح الشريحة كاملة من ح & ه الملون الشرائح باستخدام ماسح ضوئي. لتقييم إمكانية بقاء الأنسجة، أخذ لقطات من فحص الأنسجة تمثل أجزاء الشرائح الأعلى والأوسط والأسفل.
- يدوياً باستخدام برامج الصور مناور، رسم أقنعة في مناطق نخرية في الأنسجة، متبوعاً بالتحديد الكمي لمناطق نخرية باستخدام MATLAB.
- حساب النسبية صلاحية الشرائح المزروعة لنقاط زمنية مختلفة مقارنة بشريحة 0 ح أقرب كما فعلت في أعمالنا السابقة دراسة (Närhi et al., S2B الشكل وج)26. وبالمثل، تقييم التدرجات البقاء داخل شريحة المحتملة بالتحديد الكمي للبقاء في الجزء الأعلى والأوسط والأسفل من شريحة المثقفين، وحساب جدوى النسبية لكل قسم شريحة 0 ح الأقرب.
ملاحظة: بينما مجرد زراعة مورين NSCLC شرائح يستحث موت الخلايا نخرية، تختلف الاستجابات البيولوجية السابقين فيفو شروط الثقافة اعتماداً على أنسجة الورم. على سبيل المثال، تم الكشف عن التدرجات في HIF1α و ER والضامه تميزت F4/80 في الشريحة المدعومة من تصفية الثقافات مستمدة من نموذج سرطان الثدي25. ولذلك، يلزم H & E-فضلا عن التحليلات المستندة إلى المدينة من شرائح المثقفين النظر لكل نوع من أنواع الأنسجة.
- تنفيذ المدينة على أبواب البارافين. بروتوكول المدينة التالية هي نقطة انطلاق، ويتطلب المزيد من التحسين لأجسام أخرى. باختصار، ديبارافينيزي وترطيب مقاطع البارافين كما يلي: زيلين نفط 3 x لمدة 5 دقائق، 100% EtOH 3 x ل 1 دقيقة، 96% EtOH 2 x ل 1 دقيقة، 70% EtoH 1 x 1 دقيقة، والمياه 2 x ل 1 دقيقة.
- ليعرض [ابيتوبس] مولده، إجراء استرجاع الحرارة بوساطة مستضد استخدام حامض الستريك 10 ملم في درجة الحموضة 6 في وحدة نمطية لحزب العمال، متبوعة بحظر مع 1% ألبومين المصل البقري (BSA) و 10% مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (21-23 درجة مئوية).
- احتضان جسم الابتدائي المخفف في جيش صرب البوسنة 1% و 5% خ ع في برنامج تلفزيوني 1 x، أما من أجل ح 1 – 2 في درجة حرارة الغرفة. احتضان بجسم الأرنب المضادة الثانوية، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها الكشف عن استخدام 3، 3-ديامينوبينزيديني (DAB).
- أقسام هي كونتيرستينيد مع الهيماتوكسيلين (المخفف إلى 01:10 في المياه) عن 30 ثانية، والغسيل تحت ماء الصنبور لمدة 5 دقائق، يليه الجفاف بغمر الشرائح في حلول الكحول وزيلين نفط، على النحو التالي: 70% EtOH 1 x، 96% EtOH 2 × 100 ٪ EtOH 3 x، x (زيلين نفط 3 الخطوة 1 دقيقة). وأخيراً، تضمين المقاطع في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
- الحصول على شريحة كاملة بمسح الشرائح الملطخة بالمدينة وتصديرها كصور TIFF بنسبة تكبير 1:4 باستخدام استخدام صورة مشاهد، وأداء كوانتيفيكيشنز استخدام إيماجيج.
ملاحظة: كما يمكن الحصول على بديل للماسح الضوئي، والصور المجهرية في 20 X أو 40 X التكبير كوانتيفيكيشنز. ويمكن اختيار تكبير الصورة اعتماداً على العلامة كمياً؛ يفضل صور عالية التكبير لتلطيخ النووية، بينما هيولى أو علامات غشاء يمكن قياسها كمياً باستخدام 20 X الصور.- للتحديد الكمي لعلامات النووية، في هذه الحالة التعبير NKX2-1، وتحويل كل صورة للصور 16-بت باستخدام فيجي-إيماجيج، وتحميل الصور لتحليل الصور.
- تخصيص خط الأنابيب تحليل الصورة اعتماداً على التحليل. في هذا البروتوكول باستخدام خط الأنابيب التالية للتحديد الكمي لنواة الإيجابية NKX2-1: "تحديد الكائنات الأولية" | قياس كثافة الكائن | تصفية الكائنات (القيمة الدنيا = 0.0025) | حساب رياضيات يتم تمثيل النتائج كنسب مئوية من نويات الملطخة بالدأب من إجمالي عدد الأنوية.
Representative Results
ويمثل الشكل 1 سير العمل لتوليد وزراعة وتحليل الأنسجة دقة قطع شرائح المستمدة من موريني NSCLC الأورام. لهذه التظاهرة، علينا الاستفادة من الأورام من طراز ماوس المهندسة وراثيا (جيم) إيواء التنشيط الشرطي من كراسG12D جنبا إلى جنب مع فقدان Lkb1 (يعرف أيضا باسم سيرين/ثريونين كيناز 11)، يشار إلى كوالا لمبور. تم إجراء بدء ورم الرئة وتربية الماوس كما هو موضح في26،28. يوضح الشكل 2 ألف أثر الأنسجة شريحة سمك على بقاء شرائح مثقف عن 24 ساعة باستخدام وحدة الدورية لحضانة. وتبين النتائج أن 160 ميكرون شرائح رقيقة تحتوي على مناطق نخرية كبيرة عبر الشريحة. وباﻹضافة إلى ذلك، 250 ميكرون شرائح رقيقة إظهار نخر التدرج عبر الشريحة بالمقارنة مع 200 ميكرومتر شرائح رقيقة. ومن المرجح أن استمرارية عموما الفقراء ميكرومتر 160 أنحف الناجم عن التعامل مع التقنية أثناء تحديد المواقع الشرائح على رأس الشبكات، وهذه هي هشة وتميل إلى حليقة. من ناحية أخرى، التي في NSCLC مورين explants يدل عند الشرائح تكون سميكة جداً، يمكن أن تصبح عرضه للنقص في الأوكسجين أو نشر المواد الغذائية عبر الشرائح، كالموت نخرية التدرج25. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن شرائح بسمك متغير يمكن أن تتولد من ورم واحد، على الرغم من استخدام إعدادات فيبرتوم متطابقة. ولذلك يوصي بتحليل replicates العديد من عينات مختلفة من الورم. الأهم من ذلك، يتطلب كل نوع من أنواع الأنسجة شريحة سمك الأمثل تحقيق أقصى قدر من الجدارة، كما يمكن أن تؤثر على نسيج الأنسجة وصلابة الأوكسجين وتدفق المواد الغذائية. الشكل 2 -2C يوضح الكمية المدينة تحليلات للتعبير NKX2-1، علامة على الرئة المتمايزة جيدا غدية (AC) في عينات المزروعة تصل إلى 72 ساعة، ومطابقة شرائح 0 ح. وتبين النتائج أن التعبير NKX2-1 لم يغير كثيرا في شرائح مثقف بالمقارنة مع شرائح جاهل ح 0، مما يوحي بأن عملية زراعة لا يؤثر علنا حالة التمايز AC ورم الأنسجة. يوضح الشكل 2D الأداة المساعدة من ورم الأنسجة شرائح لتقييم فعالية العقاقير المستهدفة. نحن مؤخرا أظهرت أن كراس متحولة مورين ACs معرض عالية التعبير عن فوسفوريلاتيد ERK1/2 (وسم زيادة النشاط المسار MAPK) عند مقارنة بالأورام أدينوسكواموس (الرابطة)، بينما التعبير عن 4EBP1 فوسفوريلاتيد (وسم النشاط mTOR ) يعبر عن المثل بأورام التيار المتردد والرابطة. لاختبار ما إذا كان يمكن توجيه هذه المسارات فعلياً على شرائح الأنسجة، شرائح الأنسجة AC كوالا لمبور تعامل مع [دمس] أو معاير كميات من المركبات، أي 0.1 – 1 ميكرومتر داكتوليسيب لاستهداف المسار mTOR أو 0.05 – 0.5 ميكرومتر سيلوميتينيب لاستهداف MAPK المسار. وتبين النتائج أن داكتوليسيب 1 ميكرومتر أو 0.5 ميكرومتر من سيلوميتينيب فعالة في تثبيط الفسفرة 4EBP1 أو ERK1/2، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يشير الجرعة تعتمد على تثبيط فوسفوبروتين المستهدفة أن شرائح الأنسجة يمكن أن تستخدم أيضا للتحقق من صحة أجسام الفسفرة على حدة.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل لإنشاء وتحليل مورين explants شريحة المستمدة من ورم NSCLC. تصف في جمع وإعداد الرئتين الورم الحاملة لتقطيع التخطيطي (A). يتم حصاد الفصوص الرئة من ماوس وهو تشريح أنسجة الورم بعيداً عن أنسجة طبيعية. السهم الأسود والنجمة تشير إلى حوالي 4 مم والأورام 1 مم، على التوالي. يشير رأس السهم الأبيض إلى أنسجة الرئة لصقها على السطح لصاحب العينة. يشير السهم الأحمر في قطعة إضافية من أنسجة الرئة طبيعية دعم الاحتفاظ بالورم في وضع رأسي. (ب) فيبرتوم تقطيع وجمع شرائح الأنسجة. السهم الأبيض يشير إلى اتجاه تشريح. مجموعة من شرائح متتابعة في لوحة 24-البئر الذي يحتوي على البارد حبس + P/s. الشرائح يمكن أن تكون أما مثقف لنقاط زمنية مختلفة (هنا، ح 24 – 72) لتقييم تعبير العلامة الخاصة باستئصال ورم من خلال زراعة (الصف العلوي)، أو يمكن استخدامها لإجراء العلاج بالعقاقير. C: التحكم بالسيارة، t: العلاج من تعاطي المخدرات. (ج) وضع شريحة الأنسجة لزراعة استخدام وحدات حضانة الدورية. إمالة لوحة 6-جيدا، حتى أن بعض المتوسطة ويغطي الجزء العلوي من الشبكة ومكان الشريحة الأنسجة في وسط الشبكة على أعلى من المتوسط، وانتشار شريحة استخدام الملقط. التأكد من وجود لوحات 6-جيدا وزن متوازنة لدورة تناوب سلس. X: يشير إلى غير صحيحة، و 
: يشير إلى الموضع الصحيح للشريحة. (د) صورة فوتوغرافية لكتلة FFPE شريحة الورم. يشير السهم الأسود في شريحة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة الهيماتوكسيلين. (ﻫ) تخطيطات عرض تقطيع ترتيب الشرائح في كتل فب؛ يمكن معالجة هذه المقاطع لتقييم صلاحية الأنسجة والتعبير العلامات البيولوجية الخاصة بالورم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم التعبير علامة السلامة وهيستوتيبي على حدة، والعلاج من تعاطي المخدرات المستهدفة على شرائح الأنسجة NSCLC. صور الممثل (A) ح & ه AC NSCLC شرائح من سمك المشار إليه مثقف ل 24 h. 200 ميكرومتر شرائح رقيقة من الحفاظ على استمرارية أفضل بالمقارنة مع 160 ميكرون أو 250 ميكرون شرائح رقيقة. أزرق داكن يمثل ح & ه الملون الأنسجة قابلة للاستمرار، والوردي يشير إلى مناطق نخرية بسيودوكولوريد. الضوء الأزرق يشير إلى المناطق التي استبعدت من التحليل، أما بسبب نوعية الأنسجة الفقيرة أو وجود ألياف ستروما. T1 و T2 تمثل replicates البيولوجية المستمدة من أورام مختلفة اثنين. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) ممثل المدينة صور التعبير NKX2-1 في شرائح AC مثقف للنقاط الزمنية المشار إليها. يشير السهم إلى منطقة سيظهر في أعلى التكبير. وتبين النتائج أن لا يتم تبديل تعبير NKX2-1 في شرائح مثقف مقارنة بشرائح 0 ح. شريط المقياس = 500 ميكرومتر و 50 ميكرون لتكبير المنخفضة والعالية، على التوالي. (ج) التحديد الكمي للبيانات المبينة في الفقرة (ب). (د) ممثل المدينة صور 4EBP1 فوسفوريلاتيد أو التعبير pERK1/2 في ح 0 الشرائح، أو الشرائح تعامل مع [دمس] أو معاير كميات من داكتوليسيب (داكت، الصف العلوي) أو فوسفوريلاتيد pERK1/2 التعبير في ح 0 شريحة أو شرائح تعامل مع [دمس] أو سيلوميتينيب (sel، الصف السفلي). مربعات سوداء مربعة تشير إلى المجالات التي تظهر في أعلى التكبير. مقياس بار = 1 مم أو 50 ميكرومتر للتكبير عالية أو منخفضة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وضعت المعقدة في المختبر الورم نماذج مختلفة، بما في ذلك الثقافات 3D وأورجانويدس، أن الخص بالهندسة المعمارية ووظائفها النمطان في فيفو ورم الأنسجة29،30. ومع ذلك، ينطوي إنشاء ثقافات 3D أو أورجانويدس تفكك الأنسجة والنمو الانتقائي من نوع خلية مفردة أو الثقافة المشتركة لتحديد بعض أنواع الخلايا في بيئة اصطناعية. نتيجة لذلك، التقاط هذه النماذج غير كامل بتعقيدات التفاعلات التغاير وورم-ستروما الورم. من ناحية أخرى، أن شرائح الورم أورجانوتيبيك، الحفاظ على الأنسجة البيولوجية والهندسة المعمارية تعقيدات الورم في الموقع ، دون التلاعب واسعة النطاق. هذه القدرة لشرائح الأنسجة إلى الخلايا السرطانية النموذجي في بهم المكروية الأصلية يجعلها جذابة خاصة للدراسات الإكلينيكية. أبلغنا سابقا لسير عمل أمثل لإنشاء وتحليل الورم دقة قطع شرائح، وأظهرت أنه، بالمقارنة مع تصفية يدعم، وحدة حضانة الدورية تحسين صلاحية قصيرة الأجل مورين NSCLC شريحة الثقافات25 , 31-بيد أن زراعة على تناوب الوحدات يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب الرصد المستمر. نقدم هنا بروتوكولا لورم الأنسجة شريحة الجيل والاستخدام العملي التناوب وحدة الحضانة الثقافة لهم، فضلا عن المصاحبة لأساليب رصد قدرة الشرائح لالتقاط في الموقع الورم البيولوجيا، شرطا أساسيا قبل المخدرات اختبار استجابة.
العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول بضمان سلامة الأنسجة وصلاحية الشرائح الورم. إذا أنسجة الرئة طبيعية تحيط بالورم، يمكن إنشاء شرائح بسمك غير متناسقة فيبرتوم أو تلف الشرائح، بسبب الاختلافات في نسيج وصلابة بين عادي وورم الأنسجة. وبالتالي من المهم لإزالة أنسجة الرئة الطبيعية المحيطة بها قبل تقطيع الورم. خطوة حاسمة أخرى هي سمك تشريح، الذي ينبغي أن يكون الأمثل بعناية لكل نوع من أنواع الأنسجة. وعلاوة على ذلك، بمجرد شرائح، من الأهمية بمكان أن يتم وضع الشريحة تقريبا في منتصف الشبكة، لذا لضمان دقة متقطعة الغمس في المتوسط الثقافة والتعرض للأوكسجين. أخيرا، من المهم اتباع موقف شريحة أثناء فترة التناوب، كما يمكن المنسدلة شريحة للمتوسط؛ إذا حدث هذا، اتخاذ مزيد من الإجراءات يمكن كما هو موضح في الخطوة 3، 6 من البروتوكول.
بالإضافة إلى معالجة لضمان سلامة الأنسجة، وهناك أيضا خطوات حاسمة في تحليل المدينة لتفسير كيف تمثل الشريحة الأنسجة الأصلية. وأظهرت دراستنا السابقة أن يحمل مورين NSCLC الأورام الورم داخل وضوحاً عدم التجانس المكاني في أنشطة إشارات النمطان26. هذا يعني أن استخدام أنسجة متميزة مكانياً شرائح لعناصر التحكم أو العينات المعالجة بالعقاقير يمكن أن تؤثر على تفسير البيانات التجريبية يمكن الاعتماد عليها، ومن ثم ينبغي أن تستخدم شرائح عن كثب المجاورة كضوابط وعينات الاختبار. ونحن كذلك أظهرت أن أثناء انتشار أو التعبير فوسفوبروتين النمطان شرائح طازجة قطع جاهل 0 ح كانت مشابهة للأورام في عين المكان ، شرائح مثقف وأظهرت فوسفوبروتين النمطان تغيير التعبير، على وجه التحديد غيرت p4EBP1 وبسرك،، فضلا عن انتشار غيرت تحليلها بواسطة Ki67 المدينة. وبالمثل تم الكشف عن التعبير p4EBP1 غيرت في ح 24 NSCLC البشري وسرطان البروستاتا شريحة الثقافات (ناري et al.، التكميلية الرقم S3B-S3C، S5 و S7)26. تؤيد هذه النتائج أن المقارنة بين شرائح المثقفين مع شريحة جاهل أقرب بهم 0 ح أمر حاسم لتقييم الحفاظ على في الموقع وظائف ورم في شرائح مثقف.
وعلى الرغم من تحسين الجدوى ل شرائح أورجانوتيبيك25، هناك قيود مع نظام التداول من حيث الجوانب التقنية. وضع شرائح الأنسجة على التيتانيوم الشبكات هو أكثر تحديا مقارنة للتصفية إدراج، ووحدة حضانة الدورية قد لا تكون متوفرة. وكبديل لذلك، يمكن أن يدعم تصفية الراكدة، ولكن في هذه الحالة فقط الجانب المعرضة للهواء من الشرائح ينبغي تحليله، كمرشح الهواء التدرجات في البقاء ونقص يقاس بالتعبير HIF1α تتشكل سريعاً في الشريحة المدعومة من تصفية الثقافات (ديفيز et al.، الرقم 5، والشكل 7A 7B)25. وقد أظهرنا كذلك أن الورم شريحة الثقافات يمكن أن يحمل انتشار غيرت وأنشطة إشارات النمطان مقارنة ب الأورام الأصلي على26، ربما بسبب الردود التئام الجروح أو التكيف الأيضي الشرائح إلى السابقين فيفو الثقافة32. على الرغم من أن الخصائص المورفولوجية الإجمالي من الأورام NSCLC مورين أبقى أثناء زراعة ح 72، قد تؤثر التغييرات التكاثري المستحثة بالثقافة على درجات دقة الشرائح المزروعة. وهكذا، ينبغي أن تستخدم شرائح الأنسجة فقط للدراسات الفنية قصيرة الأجل.
جزئيا على الأقل تنقذ استخدام وحدة الدورية لاحتضان شريحة داخل صلاحية أو العلامات البيولوجية التدرجات التعبير، لا سيما خلال 24 ساعة الأولى من الثقافة. بمجرد التحقق من سلامة ووظيفة، وهذا يوفر مواد النسيج للدراسات الفنية، مثل دراسات علاج المخدرات. بالإضافة إلى المخدرات استجابة التنميط، التعبير الهدف تغيير بعد العلاج من تعاطي المخدرات يمكن الاستفادة أيضا من التحقق من صحة جسم. هذا ذات الصلة وبخاصة للكشف عن مورين [ابيتوبس] مع الماوس [مونوكلونل]، كهذه تميل إلى إعطاء خلفية المصبوغة عالية. وباﻹضافة إلى ذلك، أجسام جيدا تم التحقق من صحتها مطلوبة لتحقيق بيانات موثوقة واستنساخه في إعدادات التشخيصية والعلاجية. وهكذا، يوفر التحوير لوفرة أو الفسفرة من ذات الصلة [ابيتوبس] بعد العلاج من تعاطي المخدرات في شرائح الأنسجة سهل تطبيق عملي في التحقق من صحة جسم. ميزة رئيسية للورم شريحة الثقافات هو القدرة على نموذج المهام موزعة مكانياً، بما في ذلك أنشطة إشارات النمطان أو استجابة المخدرات في الورم أو الخلايا اللحمية، مما يجعلها نموذجا جذاباً السابقين فيفو . ومع ذلك، تدوير الشرائح أثناء زراعة، وعملية زراعة أخرى يمكن أن تلحق الضرر الأنسجة خاصة عند الحواف. أنه ولذلك تحدي على وجه التحديد تراكب الصور المدينة الملطخة بالعلامات البيولوجية لشرائح 0 ح مع مناطق نخرية الكشف عن شرائح المثقفين، مما يهدد القدرة على الضبط ربط أنشطة المكانية العلامات البيولوجية للمخدرات واستجابة. وباﻹضافة إلى ذلك، ردود نخرية الورم الجوهرية، والناجمة عن ثقافة والمخدرات التي يسببها تمييزه على الأقل مورين شرائح الأنسجة NSCLC، المساس كوانتيتيشن دقيقة من الاستجابات المكانية المخدرات. وأخيراً، يسمح استخدام الثقافات شريحة الورم باحث إلى الاختبار مركبات متعددة على الورم نفسه، دون حاجة إلى علاج الحيوانات، وبالتالي صقل والحد، والاستعاضة عن التجارب التي أجريت على الحيوانات المختبرية.
كتطبيق مستقبلا، يمكن اعتماد البروتوكول وصف للعينات السريرية الأورام الصلبة. كذلك الأنسجة تعتمد على نوع التعديلات أو التحسينات مطلوبة المحتمل، بدءاً بإجراء تعديلات على إعدادات فيبرتوم بما في ذلك سرعة شريحة سمك والاهتزاز تحسين هذه لمادة ورم أو صلابة. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف متطلبات المغذيات وعامل النمو لانسجة الورم مختلفة. على سبيل مثال، قد تم مثقف شرائح سرطان الثدي مع الأنسولين تستكمل في المتوسط13،18. نظراً إلى أن يتم الحصول على مواد محدودة الأنسجة أثناء الجراحة أو خزعة، يمكن أن يكون تحديا الأمثل للثقافات شريحة الورم المستمدة من المريض بسبب الصعوبات في الحصول على عدد كاف من العينات نسخ متماثل. وعلاوة على ذلك، إمكانية تكرار نتائج البيانات هو أيضا تحدي وضوحاً عينة مريض لعدم التجانس، لا سيما في النسبة المئوية للخلايا السرطانية مقابل المناطق تليفية أو تتسرب stromal، فضلا عن مكونات النسيج المتنخر. وأخيراً، سيتطلب تطبيق شرائح ورم في إعدادات التشخيص التحقيق في المدى للمخدرات التي يطابق الردود في اكسبلانتس شريحة من خزعات قبل العلاج بعد العلاج في فيفو الاستجابات.
Disclosures
ويعلن المؤلف لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا البحث العمل وتلقى الدعم المالي من "المشروع المشترك مبادرة الأدوية المبتكرة" منح اتفاق نس 115188، جامعة هلسنكي برنامج الدكتوراه في الطب الحيوي المنح الدراسية (A.S.N.)، وجوسيليوس سيغريد و أسس أوريون-فارموس (E.W.V.). ونحن نتقدم بخالص الشكر أعضائنا الكونسورتيوم منصة شريحة الأنسجة بريديكت (af تيجا هالستروم وسيف نابيلا لتقديم الدعم في إعداد نظام الدوار، وتركي Riku لدعم تحليل MATLAB. وشكر سيرو يوكو هو التقاط الصور الفوتوغرافية الرقم 1. ونشكر أيضا فريق "فم ويبميكروسكوبي" لمسح الشرائح النسيجي، ودعم "مركز" تربية الحيوانات المختبرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
| Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
| Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
| Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
| Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
| Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
| 10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
| Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
| 50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
| PBS | Lonza | BE17-517Q | |
| Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
| Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
| Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
| KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
| Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
| Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
| Citric acid | Sigma | C1909 | |
| PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
| Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
| Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
| Eosin | Sigma | E4382 | |
| NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
| pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
| p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
| BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
| Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
| DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
| Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
| Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
| Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
| MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
| Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
| Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
| CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |
References
- Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution. Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).
- Travis, W. D., et al. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).
- Wright, J. C., et al. Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer. Cancer. 15, 284-293 (1962).
- Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. Studies on the organ culture of human tumors. Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).
- Reinbold, R. [Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).
- Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. [Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects]. Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).
- Bousquet, J., Meunier, J. M. [Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Estes, J. M., et al. Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model. Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).
- Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).
- Jaamaa, S., et al. DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue. Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).
- Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue. Current protocols in neuroscience. , Chapter 6 Unit 6.11 (2001).
- Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture. Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells International. , 959807 (2015).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement. Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).
- Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices. Scientific Reports. 5, 17187 (2015).
- Narhi, K., et al. Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours. The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Nagaraj, A. S., et al. Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1. Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).
- Hoogt, R., et al. Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project. Scientific Data. 4, 170170 (2017).
- Davidson, S. M., et al. Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer. Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).
