En detaljeret protokol for vurderingen af strukturelle og visuelle udlæsninger i gnavere af optisk kohærens tomografi og optokinetic svar er præsenteret. Resultaterne giver værdifuld indsigt for oftalmologisk samt neurologisk forskning.
Optisk kohærens tomografi (OCT) er en hurtig, ikke-invasiv, interferometriske teknik giver høj opløsning nethinde billedbehandling. Det er et ideelt værktøj for undersøgelse af processer neurodegeneration, neuroprotection og neuro-reparation der involverer det visuelle system, som disse ofte korrelerer med retinale forandringer. Som en funktionel udlæsning, er visuel evoked kompenserende øjne og hovedbevægelser almindeligt anvendt i eksperimentelle modeller med funktionen visuelle. Kombinere begge teknikker gør det muligt for en kvantitativ in vivo undersøgelse af struktur og funktion, som kan bruges til at undersøge de patologiske betingelser eller at evaluere potentialet i romanen therapeutics. En stor fordel af de præsenterede teknikker er mulighed for at udføre langsgående analyser giver mulighed for undersøgelse af dynamiske processer, at reducere variation og skærer ned på antallet af dyr, der er nødvendige for eksperimenterne. Protokollen beskrev sigter på at give en manual for erhvervelse og analyse af høj kvalitet retinal scanninger af mus og rotter ved hjælp af en billig tilpassede indehaveren med en mulighed for at levere slimhindeirritation anæstesi. Derudover er den foreslåede guide beregnet som en instruktions manual til forskere ved hjælp af optokinetic svar (OKR) analyse i gnavere, der kan tilpasses til deres særlige behov og interesser.
Undersøgelse af den visuelle pathway, som en del af det centrale nervesystem, har vist sig for at være en effektiv udgangspunkt i håndteringen af ikke kun oftalmologisk1,2,3,4,5 , men også neurologisk6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 spørgsmål. I de seneste år, OCT og OKR er blevet identificeret som nyttige analytiske, ikke-invasiv værktøjer til at vurdere en lang række retinopathies og retinal manifestationer i forskellige gnavere modeller17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT giver mulighed for hurtig og høj opløsning i vivo visualisering af retinale morfologi og struktur i mus og rotter, med resultater i god overensstemmelse med histologiske sektioner af dyr retinae26. OKR udgør en hurtig og robust metode til at vurdere kvantitativt visuel funktion.
Mange OCT enheder tillade samtidige Konfokal scanning laser oftalmoskopi (cSLO) billeddannelse med forskellige bølgelængder, som giver diagnosticeringsoplysninger om retinal patologier, dvs, visualisering af lipofuscin indskud eller ændringer af retinal pigment epitel27. Desuden, i vivo billeddannelse af fluorescens mærket celler i transgene dyr er muligt28,29,30,31,32. Men anvendelsen af OCT teknologi i gnavere modeller stadig udfordrende, hovedsagelig på grund af den lille øje størrelse. Flere kommercielt tilgængelige enheder kræver tilpasninger og ofte en anden størrelse af indehaveren skal billede dyr af forskellige arter. Derudover kræver dyr anæstesi til måling.
OKR enheder kan bruges til at vurdere den visuelle funktion i rotter. Dyrene placeres på en platform i midten af en faktisk eller virtuelle cylinder fremvisningen af en bevægende rist, som dyrene styr med refleksiv hoved og hals bevægelser. Dette optokinetic svar er reduceret eller elimineret i tilfælde af nedsættelse eller tab af visuel funktion.
Formålet med denne protokol er at præsentere en manual til måling af retinale tykkelse ved hjælp af en kommercielt tilgængelig OCT enhed med en brugerdefineret indehaveren giver inhalant anæstesi. Protokollen illustrerer, hvordan man analysere volumen scanninger ved hjælp af softwaren, der leveres af producenten. Til visual test, er målet at give anvisninger på hvordan et kommercielt tilgængelige system til at vurdere OKR.
Denne protokol giver en instruktion til tykkelsesmålinger og undersøgelse af visuel funktion i rotter. Visuel aflæsning er i stigende grad brugt i Translationel forskning18,26,38,39,40 og kan let overføres til kliniske forsøg. Den betydelige fordel af OLT i sammenligning med histologiske undersøgelser i dyreforsøg er at langsgående analyser er mulige, giver undersøgelsen af dynamisk patologiske processer, i høj grad at reducere variabiliteten og antallet af dyr behov pr undersøgelse. Derudover er in vivo billeddannelse med OCT ikke underlagt fiksering, skære eller farvning artefakter, som kan påvirke lagtykkelse i histologiske undersøgelser.
Dog er ortogonale orienteringen af laserstråle i alle planer i forhold til nethinden et kritisk skridt til at sikre kvalitet og reproducerbarhed af tykkelse værdier. Det kræver nogle uddannelse af investigator og er obligatorisk før erhvervelse af OCT scanninger. Derudover, som de kommercielle enheder er bygget til anvendelse på mennesker, er kvaliteten af gnaver OCT billeder i stadig ringere i forhold til B-scanninger af menneskelige patienter. I forfatternes erfaring, kan det være vanskeligt at skelne de forskellige indre retinal lag (retinale nerve fiber lag, ganglion cellelag og inderste plexiform lag) under manuel korrektion. Vi anbefaler derfor analysere disse lag som en sammensat udlæsning (IRL).
Opsætningen af eksperimenterende giver mulighed for flygtige anæstesi, fx inhalant isofluran, som er vores erfaring, sikrere og lettere at styre end injicerbare anæstesi, fx ketamin-xylazin41,42 og reducerer risikoen tidlig opvågnen af gnavere i tilfælde af længere erhvervelse gange (f.eks., når du udfører billeddannelse af fluorescently mærkede celler). I en forundersøgelse, blev volumen scanninger identificeret som protokollerne med de højeste gyldighed og pålidelighed. Inter-rater og test retest pålidelighed var fremragende, når volumen scanninger bortset fra den centrale del, som indeholder den optiske disk blev vurderet med ICC (intra-class korrelationskoefficienten) værdier over 0,85 til alle vurderinger.
Måling af optokinetic svar er baseret på den ufrivillige optokinetic refleks, som opstår som reaktion på et kontinuerligt bevægende felt. I gnavere, i modsætning til andre arter, indebærer bevægelsen ikke kun øjnene, men hele hovedet, der kan nemt blive opdaget ved hjælp af kameraet.
Karakteristiske mellem “tracking” eller normal adfærdsmæssige flytninger af dyr kræver nogle uddannelse af investigator og det er vigtigt at blive blindet til den eksperimentelle gruppe. Derudover dyrene har brug for en tilpasning fase til at rumme den eksperimentelle indstilling og under lang tid måling protokoller, dyrene skal være animerede gentagne gange for at forsikre, at “ingen tracking” på grund af at nå tærsklen OKR og ikke til faldende opmærksomhed. Der er også en betydelig belastning variation med hensyn til den visuelle funktion af laboratoriet mus og rotter43,44. Synsstyrke af gnaver bør derfor vurderes, før de er testet og nogle stammer, såsom SJL mus, måske ikke engang være egnet til OKR målinger, som de er homozygote for allel Pde6brd1 (retinale degeneration 1).
Sammenfattende undersøgelse af retinale morfologi og visuel funktion i dyremodeller giver mulighed for ikke-invasiv, langsgående undersøgelser af strukturelle og funktionelle skader, der opstår i forbindelse med EAE og kan være nyttige i andre modeller, der involverer visuelle system, herunder men ikke begrænset til modeller af retinopathies eller synsnerven skade.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud af Dr. Robert Pfleger-Foundation og Ilselore Luckow-Foundation, samt Biogen og Novartis til PA. Figur 1B blev gengivet fra “hele kroppen positionelle manipulatorer til okulær billeddannelse af bedøvet mus og rotter: en gør det selv-guide. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, HK., grøn, A., Albrecht, P. BMJ åben oftalmologi. 1 (1), e000008, 2017” med tilladelse fra BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |