Um protocolo detalhado para a avaliação de leituras visuais e estruturais em roedores por coerência óptica tomografia computadorizada e optocinético resposta é apresentado. Os resultados fornecem informações valiosas para investigação oftalmológica, bem como neurológica.
Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica rápida, não-invasivo, interferométricas, permitindo que a imagem da retina de alta resolução. É uma ferramenta ideal para a investigação dos processos de neurodegeneração, neuroproteção e neuro-reparação envolvendo o sistema visual, como estes frequentemente correlacionar bem com as alterações da retina. Como uma leitura funcional, visualmente evocado olho compensatório e os movimentos da cabeça são comumente usados em modelos experimentais envolvendo a função visual. Combinar as duas técnicas permite uma investigação in vivo quantitativa da estrutura e função, que pode ser usada para investigar as condições patológicas ou para avaliar o potencial de novas terapêuticas. Um grande benefício das técnicas apresentadas é a possibilidade de realizar análises longitudinais, permitindo a investigação de processos dinâmicos, reduzindo a variabilidade e reduz o número de animais necessários para os experimentos. O protocolo descrito visa fornecer um manual para a aquisição e análise de retina de alta qualidade de camundongos e ratos usando um suporte personalizado de baixo custo com uma opção para fornecer anestesia inalatória. Além disso, o guia proposto destina-se como um manual de instruções para pesquisadores usando análise de resposta (OKR) optocinético em roedores, que podem ser adaptados às suas necessidades específicas e os interesses.
O exame do percurso visual, como parte do sistema nervoso central, tem provado para ser um ponto de partida eficaz na abordagem não só oftalmológica1,2,3,,45 , mas também neurológicos6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 perguntas. Nos últimos anos, a OCT e OKR foram identificados como ferramentas úteis de analíticas, não-invasivo para avaliar uma variedade grande de retinopatias e manifestações da retina em vários modelos de roedores17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT permite rápido e de alta resolução na vivo visualização da morfologia da retina e estrutura em camundongos e ratos, com resultados em boa concordância com cortes histológicos de animais retinae26. OKR constitui um método rápido e robusto para avaliar quantitativamente a função visual.
Muitos dispositivos OCT permitam simultânea confocal digitalização laser Oftalmoscopia (cSLO) de imagem com diferentes comprimentos de onda, que fornece informações de diagnóstico sobre patologias da retina, ou seja, visualização de lipofuscina depósitos ou alterações da retina pigmento de epitélio27. Além disso, a imagem latente na vivo de fluorescência rotulados de células em animais transgénicos é possível28,29,30,31,32. No entanto, a aplicação da tecnologia de OCT em modelos de roedores é ainda um desafio, principalmente por causa do tamanho pequeno olho. Vários dispositivos comercialmente disponíveis exigem adaptações e muitas vezes um tamanho diferente de titular é necessário para os animais de espécies diferentes da imagem. Além disso, os animais requerem anestesia para medição.
OKR dispositivos podem ser usados para avaliar a função visual em roedores. Os animais são colocados em uma plataforma no centro de um cilindro real ou virtual, exibindo um movimento irritante, que os animais acompanhar com movimentos de pescoço e cabeça reflexiva. Esta resposta optokinetic é reduzida ou eliminada em caso de redução ou perda da função visual.
O objetivo do presente protocolo é apresentar um manual para a medição da espessura da retina usando um dispositivo OCT comercialmente disponível com um suporte personalizado fornecendo anestesia inalantes. O protocolo ilustra como analisar o volume de digitalizações usando o software fornecido pelo fabricante. Para o teste visual, o objectivo é fornecer instruções sobre como usar um sistema comercialmente disponível para avaliar a OKR.
Este protocolo fornece uma instrução para as medições de espessura e o exame da função visual em roedores. Leituras visuais são cada vez mais utilizadas em pesquisa translacional18,26,38,39,40 e são facilmente transferíveis para ensaios clínicos. A significativa vantagem de PTU em comparação com investigações histológicas em experiências com animais é que análises longitudinais são possíveis, permitindo que a investigação de processos patológicos dinâmicos, em grande medida, reduzindo a variabilidade e o número de animais necessários por estudo. Além disso, imagens in vivo com OCT não está sujeita a fixação, corte ou coloração artefatos, que podem afetar a espessura de camada em investigações histológicas.
No entanto, a orientação ortogonal do raio laser em todos os planos em relação a retina é um passo fundamental para garantir a qualidade e a reprodutibilidade dos valores de espessura. Isso requer algum treinamento do investigador e é obrigatório antes da aquisição do OCT varreduras. Além disso, como os dispositivos comerciais são construídos para aplicações em seres humanos, a qualidade das imagens de OCT roedores é ainda inferior em comparação com B-exames de pacientes humanos. Na experiência dos autores, pode ser difícil distinguir a retiniana interna diferente camadas (camada retinal da fibra do nervo, camada de células ganglionares e camada plexiforme interna) durante a correção manual. Portanto recomendamos analisar estas camadas como uma leitura composta (IRL).
A instalação experimental fornece uma opção para anestesia volátil, por exemplo, inalantes, isoflurano, que é, em nossa experiência, mais segura e mais fácil de controlar do que a anestesia injetável, por exemplo, xilazina-cetamina41,42 e reduz o risco do despertar prematuro de roedores em caso de aquisição mais vezes (por exemplo, ao realizar imagens de células fluorescente rotuladas). Em um estudo preliminar, varreduras de volume foram identificadas como os protocolos com a maior validade e confiabilidade. A confiabilidade de reteste inter avaliador e o teste foi excelente quando volume varreduras, excluindo a parte central que contém o disco óptico foram avaliadas com valores de ICC (coeficiente de correlação intraclasse) acima de 0,85 para todas as avaliações.
A medição da resposta optokinetic baseia-se o reflexo optocinético involuntário, que ocorre em resposta a um campo continuamente em movimento. Em roedores, em contraste com outras espécies, o movimento envolve não só os olhos, mas a cabeça, que pode ser facilmente detectada usando a câmera.
Distinção entre “acompanhamento” ou normal movimentos comportamentais dos animais requer algum treinamento do investigador, e é importante para o grupo experimental de ser cego. Além disso, os animais precisam de uma fase de adaptação para acomodar a configuração experimental e durante os protocolos de medição de longa data, os animais tem que ser animado repetidamente para assegurar-se de que “sem controle” é devido ao atingir o limiar OKR e não para diminuir atenção. Há também uma variação de tensão significativa em relação a função visual do laboratório ratos e ratazanas43,44. A acuidade visual do roedor, portanto, devem ser avaliada antes que eles são testados e algumas estirpes, tais como ratos SJL, podem não ser adequados para medições de OKR, como eles são homozigotos para o alelo Pde6brd1 (degeneração da retina 1).
Em resumo, o exame da morfologia da retina e função visual em modelos animais permite investigações não-invasivo, longitudinais de danos estruturais e funcionais que ocorrem no contexto da EAE e pode ser útil em outros modelos envolvendo o visual sistema, incluindo mas não limitado aos modelos de retinopatias ou lesão do nervo óptico.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações de Dr. Robert Pfleger-Fundação Ilselore Luckow-Fundação, bem como Biogen e Novartis para PA Figura 1B foi reproduzida de “manipuladores posicionais de corpo inteiro para a imagem latente ocular de anestesiado e ratos: um guia faça você mesmo. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H. Aktas, O., Brandt, r. U., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, P. BMJ Oftalmologia aberto. 1 (1), e000008, 2017”, com a permissão do BMJ Publishing Group Ltd.
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Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |