Ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der strukturellen und optischen Anzeigen bei Nagetieren durch optische Kohärenz Tomographie und optokinetischen Reaktion wird vorgestellt. Die Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse für die Augenheilkunde sowie neurologische Forschung.
Optische Kohärenztomografie (OCT) ist eine schnelle, nicht-invasive, interferometrischen Technik ermöglicht hochauflösende retinale Bildgebung. Es ist ein ideales Werkzeug für die Untersuchung von Prozessen der Neurodegeneration, Neuroprotektion und Neuro-Reparatur an denen das visuelle System, als diese oft korrelieren gut mit Netzhautveränderungen. Wie eine funktionale auslesen, visuell evozierte kompensatorische Augen- und Kopfbewegungen üblicherweise in experimentellen Modellen unter Einbeziehung der visuellen Funktion eingesetzt werden. Die Kombination beider Techniken ermöglicht eine quantitative in-vivo-Untersuchung der Struktur und Funktion, die die pathologischen Zuständen zu untersuchen oder zu bewerten das Potenzial neuer Therapeutika verwendet werden kann. Ein großer Vorteil der vorgestellten Techniken besteht die Möglichkeit, Längsschnittanalysen ermöglicht die Untersuchung dynamischer Prozesse, Reduzierung der Variabilität führen und reduziert die Anzahl der Tiere, die für die Versuche benötigt. Das Protokoll beschrieben zielt darauf ab, ein Handbuch für die Erfassung und Analyse der retinalen hochwertige Scans von Mäusen und Ratten mit einer low-cost angepasste Halterung mit einer Option, um inhalativ Anästhesie zu liefern. Darüber hinaus die vorgeschlagene Leitfaden soll ein Lehr-Handbuch für Forscher anhand optokinetischen Reaktion (OKR) Analyse bei Nagern, die auf ihre spezifischen Bedürfnisse und Interessen angepasst werden können.
Die Prüfung des optischen Weges, als Teil des zentralen Nervensystems, hat sich bewährt, eine effektive Ausgangspunkt bei der Bewältigung nicht nur ophthalmologische1,2,3,4,5 , aber auch neurologische6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 Fragen. In den letzten Jahren, OCT und OKR wurden identifiziert als nützliche analytische, nicht-invasive Werkzeuge auszuwertende eine Vielzahl von Retinopathies und Netzhaut Manifestationen in verschiedenen Nager-Modelle17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT ermöglicht eine schnelle und hohe Auflösung in Vivo Visualisierung der Netzhaut Morphologie und Struktur bei Mäusen und Ratten, mit Ergebnissen in guter Übereinstimmung mit histologischen Abschnitte der Tiere Netzhaut26. OKR stellt eine schnelle und robuste Methode um Sichtfunktion quantitativ zu bewerten.
Viele OCT-Geräte ermöglichen gleichzeitige konfokalen scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) Bildgebung mit unterschiedlichen Wellenlängen, die Diagnoseinformationen über retinale Erkrankungen, d.h. bietet, Visualisierung von Lipofuszin Einlagen oder Veränderungen an der Netzhaut Pigment Epithel27. Darüber hinaus ist die in-Vivo Bildgebung der Fluoreszenz markiert Zellen in transgenen Tieren möglich28,29,30,31,32. Allerdings ist die Anwendung der OCT-Technologie in der Nager-Modelle noch anspruchsvoll, vor allem wegen der kleinen Größe. Mehreren im Handel erhältlichen Geräte erfordern Anpassungen und oft eine andere Größe des Inhabers ist erforderlich, um die Tiere von verschiedenen Arten Bild. Zusätzlich benötigen die Tiere Anästhesie für die Messung.
OKR Geräte lässt sich die Sehfunktion bei Nagetieren zu beurteilen. Die Tiere werden auf einer Plattform in der Mitte eines tatsächlichen oder virtuellen Zylinders anzeigen eine bewegende Gitter, gelegt, die Tiere mit reflexiven Kopf und Hals Bewegungen zu verfolgen. Diese optokinetischen Antwort ist reduziert oder eliminiert im Falle der Minderung oder Verlust der Sehfunktion.
Das Ziel dieses Protokolls ist ein Handbuch für die Messung der Netzhautdicke mit einem handelsüblichen OCT-Gerät mit einem benutzerdefinierten Halter mit Schnüffelstoffen Anästhesie zu präsentieren. Das Protokoll zeigt, wie Volume-Scans mit der vom Hersteller mitgelieferten Software zu analysieren. Für die visuelle Prüfung soll Anleitungen wie man ein handelsübliches System verwenden, um die OKR zu beurteilen.
Dieses Protokoll bietet eine Anleitung für die Dickenmessung und die Prüfung der Sehfunktion bei Nagetieren. Visuelle Anzeigen werden zunehmend in translationale Forschung18,26,38,39,40 eingesetzt und sind leicht übertragbar, klinische Studien. Der wesentliche Vorteil von OCT im Vergleich zur histologischen Untersuchungen in Tierversuchen ist Längsschnittanalysen sind möglich, so dass die Untersuchung dynamischer pathologischer Prozesse, weitgehend zu reduzieren, die Variabilität und die Anzahl der Tiere pro Studie benötigt. Darüber hinaus unterliegt in-vivo Bildgebung mit OCT nicht Fixierung, schneiden oder färben Artefakte, die die Schichtdicke in histologischen Untersuchungen beeinträchtigen können.
Die orthogonale Ausrichtung des Laserstrahls auf allen Ebenen in Bezug auf die Netzhaut ist jedoch ein wichtiger Schritt zur Sicherung der Qualität und Reproduzierbarkeit der Dicke Werte. Es erfordert einige Übung des Prüfers und ist zwingend vor der Anschaffung von OCT Scans. Darüber hinaus wie die kommerzielle Geräte für menschliche Anwendungen gebaut werden, ist die Qualität der Nagetier OCT Bilder noch schlechter als im Vergleich zu B-Scans von menschlichen Patienten. In Erfahrung der Autoren ist es möglicherweise schwer zu unterscheiden, die verschiedenen inneren Netzhaut Schichten (retinalen Nervenfaserschicht, Ganglion Zellschicht und inneren plexiformen Schicht) während der manuellen Korrektur. Wir empfehlen daher, diese Schichten als eine zusammengesetzte auslesen (IRL) zu analysieren.
Der experimentelle Aufbau bietet eine Option für volatile Anästhesie, z. B. Inhalat Isofluran, das ist nach unserer Erfahrung, sicherer und einfacher zu steuern als injizierbare Anästhesie, z. B. Ketamin-Xylazin41,42 und reduziert das Risiko der vorzeitige Erwachen der Nager bei längeren Erwerb Zeiten (z. B. bei Bildgebung Fluoreszent markierten Zellen). In einer Vorstudie wurden Volumen Scans als die Protokolle mit die höchste Validität und Zuverlässigkeit gekennzeichnet. Die Inter Rater und Test-Retest-Zuverlässigkeit war ausgezeichnet, wenn Volumen Scans mit Ausnahme das zentrale Teil enthält die Papille mit ICC (Intra-Klasse Korrelationskoeffizient) Werten über 0,85 für alle Bewertungen beurteilt wurden.
Die Messung der optokinetischen Antwort basiert auf den unfreiwilligen optokinetischen Reflex, die als Reaktion auf ein kontinuierlich bewegenden Feld auftritt. Bei Nagetieren, im Gegensatz zu anderen Arten ist die Bewegung nicht nur die Augen, sondern den ganzen Kopf, die mit der Kamera leicht erkannt werden können.
Unterscheidung zwischen “Tracking” oder normal Behaviorale Bewegungen der Tiere erfordert einige Übung des Prüfers und es ist wichtig für die experimentelle Gruppe blenden lassen. Darüber hinaus die Tiere brauchen eine Phase der Anpassung, die experimentelle Einstellung und während der langjährigen Messprotokolle unterzubringen, die Tiere müssen immer wieder animiert werden, um sicherzustellen, dass “keine Verfolgung” durch erreichen der Schwelle OKR und nicht zu einer Reduzierung Aufmerksamkeit. Es gibt auch eine erhebliche Belastung Variabilität bezüglich der visuellen Funktion von Labor Mäuse und Ratten43,44. Die Sehschärfe des Nagers sollte daher ausgewertet werden, bevor sie getestet werden und einige Stämme, wie SJL Mäuse, sogar möglicherweise nicht geeignet für OKR Messungen sind homozygot für das Allel Pde6brd1 (Degeneration der Netzhaut 1).
Zusammenfassend lässt sich sagen die Untersuchung der Netzhaut Morphologie und Sehfunktion in Tiermodellen für nicht-invasive, longitudinale Untersuchungen der strukturellen und funktionellen Schäden im Zusammenhang mit EAE erlaubt und kann hilfreich sein bei anderen Modellen unter Einbeziehung der visuelles Systems, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Modelle der Sehnerv Verletzungen oder Retinopathies.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Dr. Robert Pfleger-Stiftung Ilselore Luckow-Stiftung, sowie Biogen und Novartis, PA Abbildung 1 b wurde übernommen aus: “Ganzkörper-positionelle Manipulatoren für okuläre Bildgebung narkotisierter Mäuse und Ratten: eine do it yourself Anleitung. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Hartung, Aktaş, O., Brandt, A. U. HP., grün, A., Albrecht, P. BMJ offen Augenheilkunde. 1 (1), e000008, 2017” mit freundlicher Genehmigung von BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |