Представлен подробный протокол для оценки структурных и визуального отсчетов на грызунах, оптическая когерентная томография и оптокинетический ответ. Результаты дают ценную информацию для офтальмологии, а также неврологических исследований.
Оптическая когерентная томография (Окт) является быстрый, неинвазивный, интерферометрического техника, позволяя сетчатки изображений с высоким разрешением. Это идеальный инструмент для исследования процессов нейродегенеративные, нейропротекции и нейро ремонт с участием зрительной системы, как эти часто соотносятся с изменения сетчатки. Как функциональные индикация, визуально вызвала компенсационного глаза и движения головы часто используется в экспериментальной модели с участием зрительной функции. Сочетание обоих методов позволяет количественных в vivo исследования структуры и функции, которые могут использоваться для расследования патологических состояний или оценить потенциал Роман терапии. Большую пользу из представленных методов является возможность продольного анализа, позволяя исследование динамических процессов, снижение изменчивости и сократит количество животных для экспериментов. Протокол описал призвана обеспечить руководство для сбора и анализа данных высокого качества сетчатки сканов мышей и крыс, используя низкую стоимость заказной держатель с возможностью для доставки ингаляционных анестезии. Кроме того предлагаемое руководство предназначено как учебное пособие для исследователей, с помощью анализа ответов (ДКР) оптокинетический грызунов, которые могут быть адаптированы к их конкретным потребностям и интересам.
Изучение визуального путь, как часть центральной нервной системы, доказано, чтобы быть эффективной отправной точкой в решении не только офтальмологические1,2,3,4,5 , но также неврологические6,,78,9,10,11,12,13,14 ,,1516 вопросов. В последние годы, OCT и ДКР были определены в качестве полезных аналитических, неинвазивные инструменты для оценки большое разнообразие ретинопатии и сетчатки проявления в различных грызунов модели17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. Окт позволяет для быстрый и высокого разрешения в vivo визуализации сетчатки морфологии и структуре мышей и крыс, с результатами в хорошие соответствии с гистологических срезах животных retinae26. ОКР является быстрый и надежный метод количественной оценки зрительной функции.
Многие OCT устройства позволяют одновременное конфокальный сканирования лазерного офтальмоскопия (cSLO) изображений с различных длинах волн, которые предоставляет диагностические сведения о патологии сетчатки, т.е., Визуализация отложений липофусцина или изменения сетчатки пигмента эпителия27. Кроме того в естественных условиях изображений флуоресценции помечены клетки в трансгенных животных является возможным28,29,30,,3132. Однако применение технологии OCT в грызунов модели по-прежнему является сложным, главным образом из-за небольшой глаз размер. Некоторые коммерчески доступные устройства требуют адаптации и часто требуется другой размер держателя для изображения животных различных видов. Кроме того животные требуют анестезии для измерения.
ДКР устройства могут использоваться для оценки зрительной функции грызунов. Животные размещены на платформе в центре реальных или виртуальных цилиндра, отображение движущихся решетки, который животные отслеживать с рефлексивной головы и шеи движения. Этот ответ оптокинетический сокращены или ликвидированы в случае снижение или потеря зрительной функции.
Цель настоящего Протокола заключается в представлении руководство для измерения толщины сетчатки, использование коммерчески доступных OCT устройства с пользовательских владельца, обеспечивая вдыхаемые анестезии. Протокол показывает, как анализировать объем сканирования с помощью программного обеспечения, предоставляемых производителем. Для визуального тестирования, цель заключается в том, чтобы предоставить инструкции о том, как использовать систему коммерчески доступных для оценки ДКР.
Этот протокол предоставляет инструкции для измерения толщины и изучение зрительной функции в грызунов. Визуальные показаний все чаще используются в трансляционного исследования18,26,,3839,40 и легко передаваться в клинических испытаниях. Значительное преимущество окт по сравнению с гистологических исследований подопытных животных является то, что продольный анализ возможности, позволяя исследование динамических патологических процессов, в основном снижение изменчивости и количество Животные, нуждается в исследовании. Кроме того в естественных условиях изображений с октября не подлежит фиксации, резки или окрашивание артефакты, которые могут повлиять на толщину слоя в гистологических исследований.
Однако ортогональной ориентации лазерного луча во всех плоскостях по отношению к сетчатке является важным шагом для обеспечения качества и воспроизводимость значений толщины. Это требует определенной подготовки следователя и является обязательным до приобретения OCT сканирования. Кроме того как коммерческие устройства построены для человека приложений, качество грызунов OCT изображений все еще уступает по сравнению с Б-сканов человека пациентов. В опыте авторов, он может быть трудно отличить различные внутренние сетчатки слои (слой сетчатки нервных волокон, слоя клеток ганглия и внутренний сплетениевидный слой) во время ручной коррекции. Поэтому мы рекомендуем, анализируя эти слои как составные индикацию (IRL).
Экспериментальной установки обеспечивает возможность для летучих анестезии, например, вдыхаемые изофлюрановая, который, по нашему опыту, безопаснее и легче контролировать чем инъекционный наркоз, например, кетамин Ксилазина41,42 и уменьшает риск преждевременного пробуждения грызунов в случае приобретения больше времени (например, при выполнении визуализации дневно маркированных клеток). В предварительном исследовании объем проверок были определены как протоколы с высокой надежности и достоверности. Интер вещь и тестирования Тестирование надежности была отличной, когда объем проверки, за исключением центральной части, содержащий диск зрительного нерва были оценены с ICC (коэффициент корреляции интра класса) значения выше 0,85 для всех оценок.
Измерения оптокинетический ответ основан на недобровольное оптокинетический рефлекс, который происходит в ответ на постоянно движущихся поле. В грызунов, в отличие от других видов движение включает в себя не только глаз, но и всю голову, которые могут быть легко обнаружены с помощью камеры.
Отличительный, между «отслеживание» или нормальной поведенческих движений животных требует определенной подготовки следователя и важно быть ослеплены для экспериментальной группы. Кроме того Животные нуждаются в адаптации фазы для размещения экспериментальной установки и во время протоколы долгое время измерений, животные должны быть анимированными неоднократно заверить, что «нет отслеживания» за счет достижения порога ДКР и не уменьшается внимание. Есть также значительные деформации изменчивость относительно зрительной функции лабораторных мышей и крыс43,–44. Острота грызуна поэтому должны оцениваться прежде чем они тестируются и некоторые штаммы, таких как SJL мышей, могут даже не подходит для измерений ДКР, как они гомозиготных для аллеля Pde6brd1 (дегенерация сетчатки 1).
Таким образом изучение сетчатки морфологии и зрительной функции в животных моделях допускает неинвазивный, продольного исследования структурных и функциональных повреждений, возникающих в контексте ЕАЕ и может оказаться полезным в других моделях с участием визуального системы, включая но не ограничиваясь в модели ретинопатии или повреждение зрительного нерва.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов д -р Роберт Pfleger-фонд Ilselore Лукков-фонд, а также Biogen и Новартис ПА. Рисунок 1B был воспроизведен из «всего тела позиционные манипуляторов для глазной изображений анестезированные мышей и крыс: сделай сам гид. Дитрих, м., Крус-Эрранс Касадо, а., Yiu, H., Актас, о.в., Брандт, U. а. Гартунг, HP., зеленый цвет, а., Альбрехт, P. BMJ открытым офтальмологии. 1 (1), e000008, 2017″ с разрешения BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |