Summary
פרוטוקול זה מספק את הצעדים הדרושים כדי ליצור ולהעריך אלח דם neonatal בעכברים בן יום-7.
Abstract
אלח דם neonatal נותר נטל גלובלית. דרושה דוגמנית פרה התערבויות טיפוליות או מניעתי יעיל מסך. העכבר neonatal polymicrobial אלח דם יכולה להיגרם על ידי הזרקת cecal slurry intraperitoneally לתוך יום של חיים 7 עכברים ומעקב אחריהם במשך השבוע הבא. המובאות כאן הן השלבים המפורטים הדרושים ליישום המודל אלח דם neonatal. זה כולל ביצוע מניה slurry cecal הומוגנית, לדלל אותה מנה מותאמת משקל המלטה, חלוקה לרמות של לוח הזמנים ניטור, והגדרה של בריאות שנצפה קטגוריות המשמשות להגדרת נקודות הקצה הומאני. הדור של מניה slurry cecal הומוגנית מתורמים במאגר מאפשר המינהל לתוך המלטות רבות לאורך זמן, צמצום וריאציית בין התורמים, ולמניעת השימוש של גליצרול רעיל. האסטרטגיה ניטור בשימוש מאפשר הציפייה של הישרדות התוצאה וזיהוי של עכברים זה מאוחר יותר התקדמות למוות, המאפשרות זיהוי מוקדם יותר של נקודת הקצה של הומאניות. שתי תכונות התנהגותיות הראשי משמשות כדי להגדיר את הציונים בריאות, כלומר, היכולת של העכברים neonatal לתקן את עצמם כאשר הם ממוקמים על גבם ועל רמת ניידות. באופן פוטנציאלי יכול להיות מיושם קריטריונים אלה לנקודות קצה הומאני כתובת במחקרים אחרים של מחלת neonatal בעכברים, כל עוד מחקר פיילוט מתבצע כדי לאשר את דיוק. לסיכום, גישה זו מספק שיטה תקנית דגם יילוד שמת מאלח בעכברים, תוך מתן משאבים כדי להעריך את רווחת בעלי חיים המשמש להגדרת מוקדם נקודות קצה הומאנית לבעלי מאותגר.
Introduction
אלח דם הוא הגורם המוביל האנושי מקרי מוות זיהומיות יילוד1. כי היילוד אלח דם ממעטים להבין, התקדמות קטנה נעשתה בשתי הזיהוי של ילודים בסיכון מוקדם במהלך המחלה ופיתוח של טיפולי אפקטיבי או prophylaxes. זה מצריך את השימוש במודלים של אלח דם כדי להבין טוב יותר את תהליך, בדיקת אפשרות התערבות. יתר על כן, מכרסמים מבוגרים מגיבים באופן שונה אלח-דם, עם הבדלים משמעותיים סטטיסטית במספר של חיידקים כדי לנהל את לקבל את אותה מנה קטלנית (LD) וההבדלים התגובה מארח לעומת ילודים2. לפיכך, אלח דם neonatal חייב להילמד ב- neonates. מספר מודלים אלח דם למבוגרים השתמשו במחקר אלח דם. אלה כוללים אתגר תוך ורידי עם אורגניזמים ספציפיות בהפרות אלח דם אנושי למבוגרים או מצדו cecal, ניקוב (CLP). CLP הוא מודל אתגר אנדוגני איפה המעי האטום הוא מבודד, מאתרים וכמה ניקב כדי לאפשר דליפה של תוכן המעי לתוך הצפק, המוביל בסופו של דבר להפצת מערכתי חיידקים ו- מוצרים שלהם3. עם זאת, הליך כירורגי להקים CLP הוא קטלני לבעלי היילוד; לכן, שיטה חלופית יש צורך לחקות את האתגר polymicrobial צלפ כדי לגרום אלח דם neonatal. המודל cecal slurry neonatal polymicrobial אלח דם פותחה כדי לפנות את הצורך הזה, לפיה התכנים cecal של בעלי חיים הם שנקטפו מושעה סטרילי דקסטרוז 5% במים (D5W), intraperitoneally מוזרק עכברים היילוד2. זה, מאז, הפך מודל פופולרי יותר ויותר ללמוד אלח דם אצל בעלי חיים היילוד והן למבוגרים ו התקדמה באופן משמעותי תובנות מכניסטית של המחלה תהליך4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
לאור השימוש הגובר מודל זה ורצון של חוקרים ישירות משווים תוצאות בין פרסומים, יש צורך ההיבטים הטכניים להיות מתואר היטב מתוקננת לרוחב מחקרים. סטנדרטיזציה חל על שלושה היבטים של המודל, כלומר, i) הכנה של המניה cecal slurry, ii) הכנת האתגר aliquots להזרקה לתוך החיות ניסיוני, iii) ההגדרה של נקודת הקצה של הומאניות לפיה חיות כאילו nonsurvivors בניסויים אתגר. באופן ספציפי, שיטות כדי להכין את המניה cecal slurry מוזכרים לעתים קרובות למאמר באתר מציגה את דגם2. סיכום קצר של מודל זה הוא התוכן cecal של עכברים בוגרים היו שנקטפו, הושעו ב D5W סטרילי כדי ריכוז של 80 מ"ג/מ"ל, שמוצעת 2 h כדי להזריק את החיות ניסיוני. המודל המקורי השתמשו בעכברים, באותו הגיל, מאותו ספק מיקום, אשר שוכנו מכוני מחקר בהתאמה שלהם פחות מ 2 שבועות לפני הקטיף תוכן cecal. השימוש של עכברים שחונך ללא צורך במיקור חוץ, למרות הפחתת העלות של משלוח רגיל הספק ומאפשרת לשימוש של עכברים עודף של מגוון רחב יותר של מין, גיל, גם גדל באופן משמעותי התורם-כדי-תורם השתנות. זה מונע ההתפתחות של טכניקה חלופית, לפיה cecal התוכן של עכברים מרובים היו איחדו ביחד להכין מלאי גדול, שהיה אז aliquoted מאוחסנת ב- 80 ° C13. שיטה חלופית זו הותאמה על ידי קבוצות מרובות14,15. עם זאת, הביא את ההסתגלות וריאציות הטכני, הן בתקשורת אחסון בשימוש (גליצרול 10% או 15%, או D5W לבד) והן באסטרטגיה של סינון כדי להסיר חלקיקים (סינון multistage באמצעות מיקרומטר 860. ולאחר מכן, מיקרומטר 190 מסנן, או בודדים סינון באמצעות מיקרומטר 100 או 70 מסננים מיקרומטר)13,14,15. ההזרקה של גליצרול לבד פוטנציאל לגרימת נזק, בהתחשב בכך 25% - 50% גליצרול זריקות שימשו כמודל מכרסמים כלייתית16,17,18,19, 20. כדי למנוע תופעות לוואי לא מכוונות של גליצרול, ההכנות מניות cecal slurry עכברים במחקר זה מוקפא ב D5W ללא גליצרול, מבוצעות בדיקות של חיידקי הכדאיות של אחסון ב- 80 מעלות צלזיוס. האסטרטגיה סינון השתמשו במחקר זה הוא אחד לעבור מסנן מיקרומטר 70, אשר לא ישירות הושוותה האסטרטגיות סינון אחרים המפורטים.
קטלניים במינונים מנוכים משקל של slurry cecal מוזרק עשויים להשתנות מתקן למתקן, צריך להיות titered החוצה הקטלניות הרצוי עבור קבוצות בודדות. במינונים שונים אתגר, לשנות הכרכים הנלווים אתגר לפי הצורך. עם זאת, פרט מתודולוגי זה לא דווחה בעבר. יתר על כן, אסטרטגיות של הליכים סטנדרטיים, כגון זריקה בקרום הבטן, לעיתים רחוקות פירט על תוך הספרות, אבל טכניקות בודדים עשוי להשפיע על אם היילוד לדלוף כאשר מזריקים ועכברים להשפיע על תוצאות הסופי שלהם.
רווחת בעלי חיים, כולל הגדרה של נקודת קצה אנושי, הוא היבט מרכזי של מודל זה, כל דגם של זיהום ודלקת מכרסמים21. בשנת 1998, המועצה הקנדית על חיה על עצמך (CCAC) פרסם הנחיות נרחב לבחירת קצה הומאני, והגדיר את נקודת הקצה של הומאניות "כל כאב ממשי או פוטנציאלי, מצוקה או אי נוחות צריך להיות ממוזער או על ידי בחירת המוקדמים קצה הדבר עולה בקנה אחד עם יעדי המחקר המדעי"22. אחרים גם התראה כי ליצור נקודות קצה אנושי המבוסס על הצדקה מדעית ולא על פרשנות סובייקטיבית של החיה המדינה לבד21. אמנם יש שפע של משאבים עבור קליני, התנהגותית, הגוף-מצב מבוססי סימן קריטריונים עבור נקודת קצה הומאני, אפילו בהקשר של זיהום ודלקת במיוחד21,23,24, אף אחד מהם , כולל הנחיות הומאניות קצה22, CCAC מזכיר את היילוד עכברים. כך, באופן אובייקטיבי מדעית מוצדק הקצה הומאני הם הרבה יותר קשה להקים עבור חיות היילוד, נתן גם יכולות התנהגותיות מוגבלת שלהם וגם חוסר הראיות קריטריונים כמו ירידה במשקל, המשמש בדרך כלל למבוגר עכברים. כיום, הקריטריונים עבור נקודת הקצה אנושי משמש 5 עד 12 יום-בן - עכברים neonatal בספרות cecal slurry כל התייחסות בחזרה לכתב היד המקורי כי הציג את מודל2. בנייר זה המקורי, ההגדרה של קצה הומאנית לבעלי היילוד התבססה על שני קריטריונים; כלומר, המיקום של עכבר מחוץ לקן (פיזור) והיעדר כתמים של חלב היה כבר ראיתי כדי לגרום למוות בתוך שעות. עניין לסבך הקצאת נקודת קצה של הומאניות היא כי כתמים של חלב להיות קשה לראות ב העכבר זנים עם פרווה כהה, כגון המתח C57BL/6J מועסקים בדרך כלל, לאחר השבוע הראשון לחיים, בעוד חיות חולה מנוטרים עד היום ה-14 של החיים (בארבי כוכ). בעלי חיים נוספים, מת ניתן למצוא postchallenge בשעת החלת קריטריונים אלה (הבעלים של התבוננות; לא פורסם); לכן, הגדרה קפדנית יותר של קצה אנושי יש צורך להקל על סבל חיות ניסוי ולהימנע התמותה במצבים איפה התוצאה יכולה במדויק מאובחן גם מוקדם יותר.
כל שלושה היבטים מתודולוגיים של המודל cecal slurry מוצגים הליך מקובל המפרט את הכנת מלאי cecal slurry, שיטה מזריק חיות ניסוי שמחזיק את הקבוע נפח הזרקה בין מינונים ו מפחית את הסיכון של דליפות, והגדרה של קצה אנושי עבור עכברים 7 - עד היום ה-12 המבוסס על מערכת של מודלים התנהגותיים. מידע התנהגותי של עשרות בריאות העכבר מעל 240 חיות ניסוי שנאספו, כשהם מקובצים לפי תוצאות גמר הישרדות, הוכחת הגדרה מונחה ראיות של הקצה של הומאניות. סבלם של חיות ניסוי הוא מופחת על ידי זיהוי אדעך עכברים neonatal בנקודת הזמן האפשרי המוקדם ביותר, ואילו תוצאות ההישרדות ביולוגית משמעותי שניתן להסיק על ידי התבוננות משתני מפתח. ייצוג ויזואלי של cecal slurry הכנה והתנהגויות העכבר neonatal ישמש משאב מצוין לכל קבוצה לומדת אלח דם בחיות מודל אתגר היילוד.
Protocol
ניסויים כל פרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים אוניברסיטת בריטיש קולומביה לפי מספר פרוטוקול A17-0110.
1. כלי עיקור
- בטיחות ביולוגית cabinet (BSC), להפעיל, מחממים המעקר חרוז חם עד 250 מעלות צלזיוס, לפחות 30 דקות לפני השימוש.
- טובלים הכלים ב- 70% אתנול.
- להטביע את הכלים לתוך המעקר טרופה חרוז חם למשך תקופה מינימלית של 1 דקות.
הערה: ידיות הכלים יקבל חם, עלול להישרף אם הושארה המעקר חרוז חם מעל 1.5 דקות. - תרסיס שטיח של מגבות נייר עם 70% אתנול לחטא זה.
- להסיר את הכלים המעקר חרוז חם בלי לגעת החלק סטיריליים של הכלי ידיות nonsterile כלים אחרים המשוקע ומניחים על מגבות נייר ריססה אתנול.
- לחכות 30 s כדי 2 דקות של כלי להתקרר לפני השימוש עבור ניתוח.
2. הכנה cecal slurry
- Preweigh 15 mL צנטריפוגה צינורות (שפופרת אחת עבור כל החמישה העכברים להיות מורדמים).
- המתת חסד cecal slurry תורמים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מקומיים או להשתמש בפרוטוקול להלן.
הערה: עד 40 עכברים C57BL/6J בין 6 ל 12 שבועות העתיקה שימשו להכנת cecal slurry, עם עכברים עד חמישה להיות מורדמים בכל פעם.- העברת העכברים לתא המתת חסד והגדר מכונת ההרדמה איזופלוריין 5% עם חמצן זלוף.
- לפקח על העכברים להתבונן על אובדן היכולת לנוע, לראות אותם הזנת המטוס כירורגי של הרדמה, בסופו של דבר, מפסיק לנשום.
- הסר עכבר מן החדר המתת חסד, לצבוט את כף הרגל שלה, אם צוינו הרגל הכחשה או באינהלציה. אם גם זה קיים, להחזיר את העכבר אל התא המתת חסד; אחרת, המשך.
- סופניים המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם חדה.
- לבצע ניתוח המעי האטום, שימוש בכלים presterilized מקורר (ראה סעיף 1) ב- BSC.
- להצמיד את הרגליים של העכבר כדי וקרש מעוקם פוליסטירן מוקצף באמצעות מחטים 23 גרם כך העכבר יש את הבטן שלה. מאובטח, ואז לרסס את הבטן עם 70% אתנול.
- שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים, לחתוך העור, שחרר את העור מן הבטנה הצפק עם מספריים, לחתוך פתח אזור מלבני מהארבה החזה, צד שמאל לצד ימין. הסר לשום פרווה הצפק.
- לעבור זוג חדש של כלי סטרילי כדי לחתוך הצפק, ביצוע פתח מלבני כפי שבוצע עבור העור, החלפת כלים אם אלה נעשה שימוש מגע העור.
- לזהות את המעי האטום, אשר אמור לפעול משמאל לימין לאורך הגוף. לשבש את רקמת חיבור כדי לזהות את הענפים המעי האטום מהמעיים. ולחתוך את המעי האטום מן המעיים. מקם את המעי האטום על גיליון סטיריליים במשקל נייר.
הערה: שקילה נייר יכולים להיות מעוקר או התזה עם 70% אתנול על הצדדים והן להשאיר אותה להתייבש, או על ידי הקרנת UV. לחלופין, המעי יכול להיות גזור על צלחת פטרי סטריליות.
- ההבלטה תוכן cecal
- ב- BSC, להשתמש בכלי סטרילי שנחתוך את שני הקצוות של המעי.
- לעצור באמצע. המעי עם מלקחיים סטרילי והשתמש מרית מתכת שטוחים סטרילי בעדינות לדחוף התוכן cecal מתוך החתך מסתיימת, שימוש של תנועה מגרד זה יכולה לקרוע האפיתל מתגלגל תנועה והימנעות. לאסוף את התוכן, למקם אותם לתוך שפופרת צנטרפוגה preweighed 15 mL.
- מאגר התוכן cecal של מספר מרבי של החמישה העכברים לתוך הצינור אותו. לשקול את הצינור שוב פעם כל התוכן נוספו.
הערה: בממוצע 300 מ ג, ומעלה 390 מ ג של slurry cecal לכל עכבר, הדורשים 1.8 ל 2.4 מ ל D5W עבור resuspension לכל העכבר; לכן, שימוש בעכברים יותר מחמישה במהלך שלב זה יכול לגרום ב overfilling הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. - לנגב את הכלים נקיים עם מגבת נייר ריססה אתנול, לעקר אותם מחדש על-ידי חזרה על צעדים 1.2-1.6.
- סינון cecal slurry
- שוקל את הצינור צנטריפוגה מלא תוכן cecal, לחשב את כמות D5W כדי להוסיף תוכן cecal על ידי חלוקת המשקל של תוכן cecal על ידי ריכוז המניה הרצויה ב מיליגרם למיליליטר, כמו המשוואה להלן.
- ב- BSC, להוסיף את הכמות הנדרשת של D5W כקרח הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל את התוכן cecal.
- מערבולת 15 מ"ל צנטריפוגה צינור אנכית או אופקית לבדיקת ס' 30 עבור חלקיקים של יותר מ 1-3 מ מ קוטר ולהמשיך אם היא קיימת, vortexing עד חלקיקים גדולים כל נעלם בעליל.
- מניחים מסננת סטרילית של התא מיקרומטר 70 לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל זה מושם על קרח. פיפטה 4 מ"ל של resuspended cecal slurry לתוך מסננת את התא ומשם, הצינור אוסף. Resuspend של חלקיקים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 2 x-3 x. הבלטת בעדינות בועות כדי להגביר את מהירות הסינון תוך ערבוב את התוכן עם קצה פיפטה עד אין טיפות יותר סינון.
הערה: בעת ערבוב, ייתכנו חלקיקים גדולים מספיק כדי לחבר את פיפטה 5 מ ל. במקרה זה, אני חוזר על vortexing מ שלב הנגן 2.5.3 ולהשתמש אם הפתרון עדיין לא ניפרד, על פיפטה להקיש על חלקיקים הקיר של הצינור צנטריפוגה. - חזור על שלב 2.5.4, שינוי תא strainers בין כל שפופרת של cecal slurry, בריכת כל התוכן לתוך ברכבת התחתית זהה של אוסף צנטריפוגה 50 מ ל שמר על הקרח, או לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל השני אם נפח פילטרט של עולה רמת קרח בתיבת קרח.
- שוקל את הצינור צנטריפוגה מלא תוכן cecal, לחשב את כמות D5W כדי להוסיף תוכן cecal על ידי חלוקת המשקל של תוכן cecal על ידי ריכוז המניה הרצויה ב מיליגרם למיליליטר, כמו המשוואה להלן.
- Aliquot slurry cecal.
- במידת הצורך, לשלב מספר 50 מ ל, cecal slurry פילטרט של צינורות מהשלב 2.5.5 לתוך מיכל גדול יותר סטרילי (למשל, הבקבוק אחסון 1000 מ"ל). לאחר מכן, מערבולת עבור s ומקום 15 מ"ל 20 לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש.
- מערבולת המניה cecal slurry זה בצינור צנטריפוגה 50 מ ל 5-10 s, aliquot 500 µL לתוך שלוש מבחנות הקפאה 2 מ"ל שיש חותמת גומי, כדי למנוע אידוי לאורך זמן. מיד במקום את המניות הראשי ואת הבקבוקון קריוגני aliquoted על הקרח.
- חזור על שלבים 2.6.1 ו 2.6.2 עד כל slurry cecal היה aliquoted, vortexing המניות הראשי לאחר כל שלוש מבחנות הקפאה למניעת שיקוע של חלקיקים כלשהם וכדי לשמור על תערובת הומוגנית.
- להקפיא את aliquots cecal slurry ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: מצפה בין 3-4 בקבוקונים מניות ב µL 500 מ כל עכבר למבוגרים. כל בקבוקון המניה צריכה להיות בערך מספיק אתגר אחד המלטה של עכברים 8-7 עוד לא יודעיםעליהם כלום.
3. אלח דם האתגר של עכברים neonatal בן יום-7
- נפרדים, לזהות, שוקל עכברים neonatal.
- ב- BSC, להעביר העכברים neonatal כלוב חדש כדי לשמור על העכברים מן הסכר וכדי להפחית את הלחץ לכיוון הסכר.
- הסר ומרח על חלק מהחומר קינון עם כפפות כדי להעביר את הריח של הכלוב עם כפפות. לאחר מכן, עובש חומר הקינון לתוך קן קטן ומניחים אותו לתוך כלוב חדש ללא הסכר.
- העברה העכברים neonatal חומר הקינון לכלוב חדש.
- העברת חומר הקינון יותר להכין קן השני, ריק בתוך הכלוב חדש.
- סגור ולאחר להסיר את הכלוב של הסכר מהשכונה כך הסכר לא לחוץ לשמוע כל אחד המצוקה של עכברים neonatal.
- כדי לעקוב אחר בודדים neonatal עכברים בתוך הגורים לאורך זמן, השתמש סמן אתנול-הוכחה כדי לסמן נקודות אחד עד חמישה בחזית או הפוכה של הזנב, החלה מחדש של כל ה 12-24 לפי הצורך.
- שוקלים כל עכבר כי יהיה לערער, הצבת אחד לתוך המשני לקנן לאחר שקילה, חזור על הפעולה עבור כל העכברים.
- תחזור כל הגורים הסכר לפני הכנת האתגר cecal slurry aliquot.
- לחשב את המנות מנוכים משקל בודדים של cecal slurry, נדרש דילול עם D5W השלמת שלב זה עבור כל המלטה בנפרד, באמצעות בחישובים שלהלן או באמצעות גליון העבודה שסופקה (ראה קובץ משלים).
- לחשב את מיליגרם של cecal slurry () כדי להיות מנוהל על מנת כל עכבר על-ידי הכפלת המשקל של העכבר גרם (b) על-ידי המינון הרצוי אתגר מיליגרם של slurry cecal לגרם של העכבר (c).
- לחשב כמות המניות מדולל slurry cecal הנדרשים לכל העכבר בתוך microliters (d) על ידי חלוקת את מיליגרם של slurry cecal זקוקים לכל העכבר משלב 3.2.1 () בודדים על-ידי ריכוז slurry cecal מניות, 160 מ ג של cecal slurry למיליליטר של D5W (e), והכפלתם 1,000 µL למיליליטר כדי להמיר מ מיליליטר microliters.
- ממוצע כמות מניות cecal slurry הנדרש לכל העכבר (g) על-ידי סיכום כמות המניות cecal slurry (d) לכל העכבר בהמלטה של עכברים n , לחלק למספר של עכברים (n).
- לחשב הגורם דילול ממוצע עבור המניה cecal slurry (h) על-ידי חלוקת האחסון הזרקת הממוצע (100 µL) על-ידי כמות המניות הממוצע cecal slurry נדרש לכל העכבר (g).
- לחשב נפח הזרקה ספציפי של העכבר בכל microliters (j) על-ידי הכפלת הנפח של עכבר כל מניות cecal slurry נדרש (d) הגורם דילול ממוצע (h) ולאחר מכן לעגל אותו לעשר הקרוב (כדי להתאים 10 µL דרגות של המזרק הזרקה).
- חישוב היקף נדרש ממוצע D5W כדי לדלל את המניה cecal slurry (k) על-ידי חיסור המניה הממוצע slurry cecal (g) מאמצעי האחסון הזרקת הממוצע (100 µL).
- לחשב את הסכום הכולל של מניות cecal slurry של microliters (l) על-ידי הכפלת את slurry cecal המניה הממוצע לכל העכבר microliters (g) לפי מספר עכברים בתוך האלונקה הזו (n) והכפלתם 1.4 כדי ליצור עוד.
- לחשב את הסכום הכולל של D5W ב- microliters (ז) נדרש לדלל את המניה cecal slurry על-ידי הכפלת הנפח הנדרש הממוצע של D5W (k) לפי מספר עכברים (n) והכפלתם 1.4 כדי ליצור עוד.
- לחשב את מיליגרם של cecal slurry () כדי להיות מנוהל על מנת כל עכבר על-ידי הכפלת המשקל של העכבר גרם (b) על-ידי המינון הרצוי אתגר מיליגרם של slurry cecal לגרם של העכבר (c).
- הכינו את aliquot אתגר לאחר חישוב כמות מניות cecal slurry נדרש (l משלב 3.2.7). ב- BSC, להפשיר את המספר הנדרש של בקבוקונים מניות cecal slurry בטמפרטורת החדר, pipetting את תוכנו לערבב.
- כאשר ישנם יותר גלוי גבישי קרח להציג slurry cecal המופשרים, להעביר את הסכום המחושב של cecal slurry מניות (l משלב 3.2.7) צינור microcentrifuge mL 1.8 סטרילי.
- לדלל את הריכוז הנדרש על-ידי הוספת D5W כקרח כמחושב שלב 3.2.8 (m). אחסן את האתגר aliquot על הקרח.
- לפני טעינת המזרק, לערבב את הצינור microcentrifuge על ידי מצליף זה 20 x, ואחריו 3 x של ממלאים וגירשו 300-500 µL של cecal slurry עם 500 cc 28 גרם ½ אינץ ' אינסולין מזרק.
- לצייר את µL בערך 150 של slurry cecal מדולל לתוך המזרק אותו.
- קפיצי את המזרק מכך בועות של הבוכנה, לסגת מעט על המזרק ולאחר מכן לגרש את הבועות.
- מדבקות/ברקודים של slurry cecal עודף בחזרה לתוך הצינור microcentrifuge עד הכמות המדוייקת של slurry cecal עבור עכבר אחד, כפי מחושב עבור עכברים בודדים בשלב 3.2.5 (j), הוא טעון במזרק.
- Intraperitoneally להזריק cecal slurry, בהתאם להנחיות המוסד הרלוונטי טיפול בבעלי חיים מקומיים, או בצע את הפעולות המפורטות להלן.
- ב- BSC, הפרד העכברים neonatal מהסכר כפי שמתואר בשלב 3.1.
- עורפה העכבר על ידי האחורי של הצוואר, באמצעות האגודל לאצבע.
- אבטח את הזנב של העכבר לרוחב החלק האחורי של האמצעי, טבעות, או על החלק הקדמי של האצבעות הטבעת של פינקי.
- כדי למזער דליפות, להטות את העכבר neonatal כך הוא פונה כלפי מטה, להוסיף את שפוע המחט של המחט פונה כלפי מעלה, בין הרגל ואת איבר המין, להשאיר את המחט רדוד ו התת-עורית.
- כאשר המחט מוחדרת עבור 1 ס מ, לחץ כלפי מטה וקדימה להרגיש את המחט לנקב את הצפק. לאט לאט את הבוכנה, מחזיק את קצה המחט הכי יציב ככל שניתן, כמו תנועות לרוחב עלול לגרום נזק לאיברים של העכבר.
- בזהירות לשלוף את המחט מעל 5-10 s, בעקבות באותו המסלול החוצה כמו, מרגיע את האצבע האמצעית במהלך הסרת כדי להפחית את המתח בגוף של העכבר.
- לבדיקת דליפות, להחזיק את העכבר במשך כמה שניות לאחר הסרת המחט לאפשר זמן ההזרקה לסגור, ובדוק אם צוינו דליפה כלשהי או בולטות במקום ההזרקה, ובשלב העכבר אין להשתמש בניתוח.
הערה: בולטות של העור במקום ההזרקה מציינת זריקה בקרום הבטן שנכשלו, עם injectant להיות תת עורית. - הנח את העכבר על מגבת נייר ולאפשר את העכבר כדי לקחת צעד. אם העכבר משותק עבור 5 s, ואז מצמידה את הזנב.
- הרם את העכבר ולבדוק כל דליפה של slurry cecal באתר הזרקת. אם יש דליפה, אל תכלול את העכבר מניתוח, המתת חסד העכבר.
4. העכבר ניטור
- לפקח על העכברים באופן קבוע כדי לבדוק אותם הנכנסים נקודת קצה של הומאניות.
- להתבונן העכברים 2 h postchallenge עבור סיבוכים הזרקת הקשורות.
- לפקח על postchallenge 12 h עכברים עבור תחלואה הקשורות אלח דם וזיהוי של עכברים-נקודת קצה של הומאניות (ראה שלבים 4.2-4.3 עבור קריטריון).
- לאחר מכן לפקח על כל 4-6 h עבור 2 הימים הראשונים, חוץ 8 שעות בלילה, כאשר העכברים neonatal הם ללא התערבות.
- מעבר postchallenge יומיים, לפקח 1 x x-2 ליום. אם חולה עכברים או עכברים ניקוד בריאות אשר מקטין שנצפו, ואז להגדיל את תדירות הניטור ש כל 4-6.
- ניטור neonatal עכברים
- עבור כל הליך מעורבים עכברים neonatal, להעביר את המצעים גשמי לכלוב חדש כפי שמתואר בשלב 3.1 (עבור אותו סיבות כפי שהוזכר שם). בדוק עבור כל neonates הם שגרר מן הקן בזמן ההנקה. יש עכברים הם נגרר אל הגורים בזמן ההנקה, אינו נחשב להיות מפוזרים עכברים.
- בעת הסרת העליון של הקן, לזהות כל פיזור של עכברים neonatal גם לעזוב את הקן או תקוע בחומר הקינון אך אינך נמצא ליד הארנבונים מאותה שלהם, מלבד עכברים גררה הגורים בזמן ההנקה. מתייחסים אל נקודת הקצה של הומאניות קריטריונים בשלב 4.5 אם העכבר נמצא מפוזרים.
- למדוד את הרפלקסים וניידות שקמה בעצמה אחרי שמפילים של העכברים.
- על מגבת נייר, למקם את העכבר על גבו, לפקח על יכולתו לתקן את עצמה תוך לכל היותר 4 s. כאשר מניחים על גבו, העכבר תיפול שמאל או צד ימין, כאשר הרוזן s 4 מתחיל.
הערה: כדי להיות מסווגים את קבוצת "זכויות", העכבר חייב להיות מסוגל לקבל לפחות שלושה מתוך ארבעה כף של רפידות על מגבת הנייר עבור 1 s. זה עדיין מקובצים בתור יכולת לתקן את עצמו. לא.- אם העכבר ישר עצמה, ואז תחכו 8 s כדי לקבוע את רמת ניידות.
- לסווג את העכבר "זכויות-נייד" אם זה יכול ממש עצמו לחקור את סביבתו על ידי לקיחת מרובי שלבים ברצף.
- לסווג את העכבר "זכויות-אדיש", אם זה יכול ממש עצמה ולקחת כמה צעדים על מנת לחקור את הסביבה. העכברים בקבוצה זו אולי תיפול תוך כדי לקחת צעד, גובה על רגליהם, הפסקה בין השלבים.
- לסווג את העכבר "זכויות-Nonmobile" אם ישר עצמה לא זזה הרבה בסביבה. זה עדיין עלול ליפול, ואם זה לא לוקח כל השלבים בתוך 8 s, זה מקובצים כמו זכויות-Nonmobile.
- אם העכבר יכול לא בסדר עצמה, ואז לסווג הניידות שלה מבוסס על תנועת הירך שנצפו.
הערה: להימנע מחזרות על ה-ניטור או הגדלת אורך הזמן שהעכבר מקדיש שלהם בחזרה. כי זה יכול להשפיע על מערכת התוצאות ועל קצה אנושי, כמו עכבר נכשל לתקן את עצמו בתוך 4 s יכול לפעמים לעשות זאת אם נותן יותר זמן.- לסווג את העכבר כמו "כשל לימין (כותרת תחתונה של. דוח)-נייד" אם זה אין אפשרות לתקן את עצמו ומציג תנועת הירך שחורג זווית 90 מעלות אופקי. בחלק מהעכברים ישר את עצמם אם ניתנה יותר מ 4 s אבל צריך עדיין להיות מסווג בתור כותרת תחתונה של דוח, עם ניידות שהתבססו על תנועת מפרק הירך.
- לסווג את העכבר "כותרת תחתונה של דוח-אדיש" אם זה אין אפשרות לתקן את עצמו ומציג את תנועת הירך מתחת זווית 90 מעלות אופקי.
- לסווג את העכבר כמו "כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile", אם זה אין אפשרות לתקן את עצמו, יש רגליים לנער או רטט אבל אין תנועה היפ. הגפיים עשוי להרחיב או לסגת אך האם אין תנועה לרוחב. העכבר חולה בעליל, הגיעה נקודת הקצה הומאני.
- על מגבת נייר, למקם את העכבר על גבו, לפקח על יכולתו לתקן את עצמה תוך לכל היותר 4 s. כאשר מניחים על גבו, העכבר תיפול שמאל או צד ימין, כאשר הרוזן s 4 מתחיל.
- חזור על שלב 4.3 בצד השני של מצביע העכבר, הקלטה בשני הצדדים.
הערה: ראה קובץ משלים עבור הקלטה תצפיות. - לקבוע אם העכבר נמצא נקודת קצה של הומאניות, דורש המתת חסד כמתואר בטבלה1, ומתחת.
- לסווג עכברים לתוך בטעותו שונים ורמות ניידות על סמך התצפיות ניטור ציין בשלבים 4.3 ו- 4.4. הניידות של העכבר נמדד לכל צד, התנהגות נייד משמשת כדי לקבוע אם העכבר דורש המתת חסד.
- הקצאת כל העכברים עם תיקונו רפלקס של כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile (א) או (ב) כותרת תחתונה של דוח-אדיש ומצאתי מופרדים מן הקן להיות נקודת קצה של הומאניות.
- בפיקוח נקודות זמן מעבר 20 h postchallenge, לסווג כל עכבר עם רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים של "כשל לימין" משני הצדדים כאילו בנקודת קצה הומנית, כי הנתונים שהוצגו לחזות עם רמת דיוק גבוהה כי אלו עכברים בסופו של דבר להיכנע למחלה, לא לשחזר.
- עכברים נפרדים המהווים. תומת, כפי שנקבע בשלב 4.5. אם העכבר תחת פיקוח אינה נראית כמו על נקודת קצה של הומאניות, למקם אותו לתוך הקן הריק השני לכלוב חדש ללא הסכר, ולהמשיך עם העכברים neonatal אחרים.
- ברגע הגורים כולו נמצא במעקב, לעבור חצי של חומר הקינון לתוך הכלוב עם הסכר, רפורמה קן עם מקום באמצע העכברים neonatal.
הערה: הקן בנוי כראוי עלול לגרום העכברים פיזור ולהפחית את כמות טיפול זמין הסכר יכול להציע. - העברת העכברים neonatal בחזרה לתוך הכלוב עם הסכר.
- הקף את הגורים בתוך הקן על ידי לשים את שאריות חומר קינון על הגורים בעדינות לצבוט את זה מסביב למכסה כדי לאבטח את חומר הקינון במקום.
- המתת חסד העכברים neonatal מופרדים בשלב 4.6 על פי דרישות למוסד מקומי.
5. טיטור של slurry cecal
- אתגר העכברים במינון הרצוי אתגר (סעיף 3) ולעקוב אחר התוצאות (סעיף 4).
- שים לב אם התוצאה הסופית יוצרת תעודת הזהות הרצויה, ואם לא, חזור על סעיפים 3 ו- 4 עם המליטה החדש במינון גבוה או נמוך אתגר, התאמת אותה על ידי 5% - 10%.
הערה: אתגר מינונים עלולה להיות דומה איור 1B אך צריך להיות titered כל מתקן, זן של עכברים. - בנוסף, שים לב אם העכברים להשיג נקודת קצה של הומאניות מהר יותר או לאט יותר מאשר קינטיקה הצפוי באיור 1B, וחזור סעיפים 3 ו- 4 עם המליטה החדש במינון גבוה או נמוך אתגר, התאמת אותה על ידי 5% - 10%.
Representative Results
הכדאיות cecal slurry המאוחסן ב- 80 ° C יכול להיבדק לאורך זמן באופן סדרתי דילול, ציפוי aliquots של cecal slurry מניות על אגר סויה tryptic של דם של כבשים 5% ואחריו 24 שעות של דגירה אירובי ב 37 º C. לאחר מכן ספירת culturable המושבה יוצרי יחידה (CFU) תוכן של הכנה cecal slurry נמצאה לא להשתנות לאורך תקופה של 6 חודשים, ואת הכדאיות לא הושפע אחסון ממושך ב-80 מעלות צלזיוס (איור 2). העכבר התורם לכל גרם, בממוצע, מספיק slurry cecal כדי לאתגר שלושה או ארבעה המלטות (נתונים לא מוצג).
עכברים אתגר-7 עוד לא יודעיםעליהם כלום cecal slurry לגרום אלח דם polymicrobial החלו להגיע נקודת הקצה אנושי בתוך 12 שעות של האתגר, אלח דם polymicrobial נפתרה בעיקר על ידי postchallenge 48 h, כפי שנצפתה עקומת הישרדות קפלן-מאייר בשילוב של נתונים מיותר מ 200 עכברים מאותגרים (איור 1 א'). הקטלניות הייתה תלויה המינון אתגר מנוהל, עם 5% שינוי במינון האתגר והתוצאה בערך 15% הבדל בהישרדות (איור 1B). משקל הגוף העכבר נמדדה ב כל ביקור פיקוח. ירידה במשקל היה לראות כל החיות מאותגר, להיות לא אדם כיתתי כאלה לא במהלך הראשונית 24 שעות postchallenge (איור 1C) בין עכברים שרדה. לאחר 24 שעות, חיות ביותר ששרדו החל להשיב את המשקל שלהם, בעוד nonsurvivors כל המשיך לרדת במשקל, העביר לנקודת הקצה ההומאנית שלהם. עם זאת, קטן פרופורציה לשרוד חיות נשמר שלהם רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים גם המשיך לרדת במשקל או נכשל לעלות במשקל, עד תום הניסוי, אפילו מאבד גם 20% ממשקל גופם הראשונית בתוך 40 h של האתגר. כפי שהייתה חפיפה בין ירידה במשקל בין עכברים שרדה לבין אלו שלא, את השינוי במשקל או הסף של אובדן משקל לא ניתן להשתמש כקריטריון עבור נקודת קצה אנושי תוך שמירה על מטרת במדויק חלוקת ניצולים מ- nonsurvivors.
ההתנהגות של עכברים היה פיקוח כמתואר בפרוטוקול, בטבלה מס ' 2. תמונות של הבריאות הקטגוריות הן מוצגות (איור 3 א-ג). התמונות האלה מראים הקטגוריות בריאות שונים של עכברים מי נכשלה מיד את עצמם לאחר להצבה על גבם, המתאר את ההבדל בין כותרת תחתונה של דוח-Mobile ומוטיבציה כותרת תחתונה של דוח-, זו הבחנה חשובה. לאתגר עכברים בריאים בגיל הזה אינם מציגים פעילות כותרת תחתונה של דוח-אדיש; לכן, בריאות קטגוריה זו סמן של המחלה, תגובה לאתגר. חולה עכברים, מוצגים כותרת תחתונה של דוח-אדיש הסימפטומים (איור 3B) יכול לסגת לכיוון כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile (איור 3C), איפה הרגל העליונה נשאר מקביל עם הרגל התחתונה, עד אפס הירך נדנדה התנועה, אשר הוא אחד הקריטריונים נקודת קצה של הומאניות. העכברים יכול גם לשחזר, צובר התנועה היפ גדל והופך כותרת תחתונה של דוח-Mobile (איור 3 א). רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ותוצאות ניידות היו נחושים עבור שמאל והן בצד הימני של העכבר בכל, הציון הגבוה ביותר היה מנוצל כדי לקבוע אם העכבר הגיעה נקודת קצה של הומאניות. התנהגות מידע נאסף מתוך יותר מ- 240 חיות עם מנה קטלנית 60 (LD60) של cecal slurry, 144 נקודות קצה הומאני נצפו (איור 3D-F , טבלה 1). גישה זו מבוססת על ראיות שימש כדי להגדיר ולמקד את נקודת הקצה אנושי מעבר לארבעה שלבים מחלה, מקוטלגת על ניסויים המבוססים על שני הבדלים התנהגותיים בין הניצולים nonsurvivors ועל ידי השבר של נקודות קצה הומאני הגיעו במהלך כל מסגרת זמן. במהלך הניסויים הראשונים, עכברים כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile שהיה אין תנועה הירך נמצאו באופן עקבי מת בתוך 4-6 h של התנהגות זו הנצפה. באוסף של המידע שהוצגו, ניקוד בריאות כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile שימש קריטריון עבור נקודת קצה של הומאניות. מ- 12-21 h postchallenge, בעוד עכברים כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile היו מורדמים, ששרד ובעלי nonsurviving מוצגים דפוסי התנהגות דומה מאוד ולא יכול להיות מכובד בכל דרך אחרת (איור תלת-ממד). Postchallenge h 21-48, הרוב המכריע של הישרדות העכברים חזרה רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים שלהם, בעוד פחות מ 1% של ההתנהגויות כותרת תחתונה של דוח שנצפו היו בעלי החיים הייתי הולך על מנת לשרוד את הניסוי (איור 3E). לפיכך, עכברים שנכשלו לתקן את עצמם משני הצדדים הפך קריטריון נוסף עבור נקודת קצה אנושי במהלך תקופה זו. בין 12 ל-20 postchallenge h, 12.5% של המספר הכולל של נקודות קצה הומאני נצפו, לעומת 80.5% בין 20 ל- 48 שעות, ו-7% לאחר 48 שעות (טבלה 1). סימן היכר בין עכברים זה הסתיים ששרדו וזה החמיר בסופו של דבר אל נקודת קצה של הומאניות היה אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים, עצמאית של מפרק הירך ניידות (איור 3F). אכן, בין 20 ל-48 h את האתגר, סך של עכברים 121 הצליחו לתקן את עצמם משני הצדדים, עם 116 של עכברים אלה בסופו של דבר ומתחזקים נקודת קצה של הומאניות (המייצגת של 96% דיוק בזיהוי עכברים לא יתאושש). מעבר 48 שעות לאחר האתגר, נצפו עכברים 11 להיכשל לתקן את עצמם מכל הצדדים וגם 10 מתוך אלה שהתמשכו אל נקודת קצה של הומאניות (דיוק 91%). מעבר 20 h את האתגר, מספר עכברים איבד את רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים לשני הצדדים מנבאת את התוצאה הסופית עם דיוק של יותר מ- 90%; לכן, זו נוספה על הקריטריונים קצה הומאני, לזהות עכברים nonrecovering מוקדם יותר ולהפחית את העכבר סבל (טבלה 1).
תדירות כי עכברים צריך ניטור משתנה לאורך זמן, בשל תעריפים שונים של המוות postchallenge, המותווה בטבלה1. עכבר נחשבה לאבן בנקודת קצה ההומאנית שלו בשלב כלשהו אם זה הצליח לתקן את עצמו ויוצג התנועה היפ nonmobile משני הצדדים, או אם העכבר נמצא מפוזרים מן הקן, לא היתה אפשרות לתקן את עצמו, והיה אדיש תנועת מפרק הירך. עכברים עם אחד מהתנאים הללו לא היו אמורים להיות מסוגל להצטרף הגורים, נצפו להיות כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile בתוך 4-6 ה 20 החל h את האתגר, נקודת קצה של הומאניות חדשה נוספה כי המידע הציג מראה כי את העצום הרוב של עכברים כותרת תחתונה של דוח משני הצדדים בסופו של דבר נכנע למחלה.
קטעי וידאו, טבלאות ומשאבים שהוצגו בכתב היד הם משאב הוראה יעילה עבור ההקצאה התנהגותית נכונה של עכברים מאותגר. ניסויים שבע התבקשו צפה בסרטון הדרכה ולקרוא את הפרוטוקול והן את הטבלאות לפני הקצאת התנהגויות לבעלי מאותגר 60. הזיהוי של הקצאה קצה אנושי היה מדויק גם עכברים כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile הבחנה של עכברים שלא להציג את התנהגויות אחרות (איור 4A) וגם עכברים כותרת תחתונה של דוח של עכברים הצליחו לתקן את עצמם בתוך (מסגרת הזמן המותר איור 4B).
איור 1 : קפלן-מאייר עקומת הישרדות cecal slurry במינון טיטור, משקל משתנה בעקבות האתגר cecal slurry. (א) תוצאות ההישרדות של עכברים C57BL/6J neonatal תגר עם זריקה slurry cecal בקרום הבטן-7 עוד לא יודעיםעליהם כלום. הנתונים עבור איור זה משולב של ניסויים עצמאית באמצעות אתגר מספר מנות, החל 0.7 1.3 mg של slurry cecal לכל משקל גוף גרם ערכנו אלו עכברים. (B) Neonatal עכברים הם אתגר 0.80 כדי 0.95 מ"ג של slurry cecal לכל משקל גוף גרם של הכנה cecal slurry אחד להציג יחסים למינון בין גודל slurry cecal נתן את אחוזי הישרדות. (C) אחוזי השינוי במשקל לעומת המשקל אתגר, עם קו מקווקו המציין 20% אובדן משקל מימי האתגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ריכוז CFU במלאי cecal slurry המאוחסן ב- 80 ° C אינה משנה לאורך תקופה של 6 חודשים. השפעת הגיל cecal slurry על ריכוז CFU נבחנה באמצעות רגרסיה ליניארית. כל נקודה מייצג אחד aliquot של הכנת cecal slurry אותו, באופן סדרתי מדולל, מצופה במשך תקופה של 6 חודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : היפ ניידות קטגוריות של עכברים שנכשלות לתקן את עצמם ואת התנהגויות בעלי חיים שונים פעמים postchallenge. עכברים כבר ערערו אותה מחדש עם אלח דם, כאשר מניחים על גבם, יציג סימני תחלואה זה ניתן למדוד על-פי מידת התנועה היפ. (א) A להיכשל לימין (כותרת תחתונה של. דוח)-עכבר נייד מראה תנועה מתנודדת מפרק הירך של הרגל העליונה שלהם העולה על זווית 90 מעלות אופקי. (B) כותרת תחתונה של דוח-אדיש עכבר מראה הירך נדנדה תנועה אך אינו עולה על 90 ° זווית מאופקי בשלב כלשהו במהלך 4 s של ניטור. (ג) איזה כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile עכברים תרחיב את הרגל שלהם, כיפוף בברך, אך יראה מעט מאוד (פחות מ- 10 ° מעלות) כדי אפס הירך נדנדה, וטלי הרגליים יישאר מקבילים זה לזה. (ד) התנהגויות בעלי חיים 12-21 h postchallenge מראים כי רק כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile התנהגויות להפריד ניצולים nonsurvivors. (E) מ-21 עד 48 שעות postchallenge, רק 4 מתוך ההתנהגויות כותרת תחתונה של דוח שנצפה 592 (0.67%) שייכים ניצולים, המאפשרת תיקונו רפלקס כדי לחזות את התוצאה הסופית, לשמש criterium חדש עבור נקודת קצה הומאני. Postinfection (F) h מעבר 48, 6 מתוך 131 עכברים (4.55%) היה רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים נהיה חלק מקבוצת כותרת תחתונה של דוח, הוקרבו בסוף הניסוי, המצדיקה ניטור מתמשכת לאורך כל הקורס של התאוששות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : משאבי הדרכה התוצאה מדויקת סיווג התנהגות על ידי ניסויים עצמאית. ניסויים מאומנים על ידי צופה וידאו המלווה פרוטוקול זה מחולק לקטגוריות סרטונים של עכברים neonatal 60 קבוצות בריאות שונות. (א) היכולת להבחין בין נקודת קצה של הומאניות נקבע ומסווגת ממוצע של 97% של התנהגויות היה במדויק כמו כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile או לא, כאשר רק 1% של כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile העכברים היו טעינו בזיהוי. שני אחוזים העכברים זוהו בטעות בתור כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile. (B) הזיהוי של נקודת הקצה השניה הומאני קריטריון של הבחנה נכונה בין עכברים כותרת תחתונה של דוח או אלה שיש להם את היכולת לתקן את עצמם בתוך 4 מכוניבת s של להצבה על גבם הוצב כראוי ב- 97% scorings, ואילו היחידה 0.96% מהעכברים שהוזמנו באופן שגוי כמו בטעותו עצמם ו- 2% של עכברים שהוזמנו באופן שגוי כמו כותרת תחתונה של דוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב המחלה | ת: גבוהה תחלואה, תמותה אין | ב': גבוהה תחלואה, תמותה נמוך | C: גבוהה תחלואה, תמותה גבוהה | D: נמוך תחלואה, תמותה נמוך |
| שעות להציב אתגר | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| תדירות הניטור | אתגר פוסט 2 h | כל h 4−6 | כל h 4−6, 8 שעות, ללא התערבות בין לילה | 1−2 פעמים ביום, יותר במידת הצורך |
| פרופורציה של נקודות קצה הומנית הכוללת נצפתה | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| אחוז של נקודות קצה הומאני שנצפו | 0% | 12.5% | 80.5% | 7% |
| קריטריונים קצה אנושי | 1. FTR−Nonmobile משני הצדדים | 1. FTR−Nonmobile משני הצדדים | ||
| 2. המתפזרת הקן, והוא FTR−Lethargic | 2. המתפזרת הקן, והוא FTR−Lethargic | |||
| 3. כותרת תחתונה של דוח על הן בצד שמאל או ימין (עם ציון כל ניידות) | ||||
טבלה 1: תדירות של קריטריונים קצה ניטור והומאני בשלבים שונים של המחלה. ניטור תדר, הקצה הומאני נצפתה, האחוז של נקודות קצה הומאני וקריטריונים קצה הומאני בשלבים שונים של המחלה.
| בטעותו רפלקס | ניידות | מגבלת הזמן לימין לאחר להצבה על הגב | מגבלת הזמן כדי למדוד כמות התנועה (נייד / אדיש / nonmobile) | קריטריונים הבקיע ניידות |
| זכויות | נייד | 4 s | 8 נוספים s | העכבר לוקח מספר השלבים ברציפות, שמירה על המומנטום קדימה, בוחן את הסביבה שלו. הגור לא תיפול. |
| אדיש | העכבר יכול לקחת צעד אבל הפסקה והשהיה לפני נטילת אחרת. גור יפלו. | |||
| Nonmobile | העכבר לא לוקח שום צעדים לאחר מתקנת את עצמה. גור יפלו. | |||
| לא נכון | הירכיים ניידים | 4 באותו s למדידת שקמה בעצמה אחרי שמפילים רפלקס | יש תנועה היפ אנרגטי עם הרגל העליונה סיבוב מעבר 90° מאופקי לפחות פעם אחת בתוך 4 s. | |
| הירכיים אדיש | תנועת הירך עד, אך לא מעבר 90° מ אופקי. | |||
| הירכיים nonmobile | הגפיים יכולים לנוע על-ידי הרחבת היציבה אבל הירכיים לא יסתובב. גור נראה חולה מאוד. |
בטבלה 2: ניטור טבלת קריטריונים לקביעת הציון בריאות של עכברים. הקריטריונים ובלבד שימשו להגדרת קבוצות קטגוריות בריאות לעכברים, ועל מנת לצמצם את השונות בודדים הקצאת עשרות בריאות.
Discussion
לאחר הלידה neonatal עכברים יש מאוד מוגבל ניידות ולהיכשל לתקן את עצמם לאחר להצבה על הגב שלהם, גם כאשר לאתגר. על ידי 7 עוד לא יודעיםעליהם כלום, הגיל של עכברים תיגר במודל זה, טווח התנועה פורש מן הזכויות-Mobile אל כותרת תחתונה של דוח-Mobile נצפתה בעכברים לאתגר, עם הבדל חשוב, כלומר העכבר לאתגר בגיל זה אינם מציגים התנהגות כותרת תחתונה של דוח-אדיש. רק עכברים הם אתגר polymicrobial אלח דם נצפו להפוך כותרת תחתונה של דוח-אדיש; לכן, תגובה זו יכולה להיות סמן של חומרת המחלה. להיות קשוב כדי החיתוך של זווית בת 90° מאופקי לתנועה היפ מאפשר עבור ההקצאה עקבי ומדויק של תנועת הירך אדיש או ניידים בעכברים. מסגרת זמן של 4 s כדי לראות אם עכבר יכול נכון עצמו נבחר כי עכברים לאתגר הצליחו לתקן את עצמם באופן עקבי בתוך פרק הזמן. חזר על מדידה של העכבר אותו היה נמנע, תוך הזמן לתקן את עצמם ואת מידת הניידות היפ היה מוגבל ל- 4 s, כדי למנוע יתר על המידה מעייף את העכבר, אחרת עלול להשפיע על יכולתו להשיג מזון וחום, יכול להשפיע על שלה פרוגנוזה להחלים. מתקנת את עצמה מן הן משמאל והן מימין נצפו, גבוה יותר של הציונים נעשה שימוש כדי לקבוע אם העכבר היה נקודת קצה של הומאניות, כי עכברים נמצאו כדי להציג כותרת תחתונה של דוח-Nonmobile מצד אחד ועדיין יש ניידות גבוהה יותר על הצד האחר ו- b e מסוגל לשחזר בסופו של דבר.
מערכת התוצאות המשמשים להערכת בריאות העכבר הסתמכה על היישום של קטגורית המכנסונים מהו ספקטרום של התנועה, לכן, יכול להיות נוטה הטיה בודדים. צוות מיומן יחד כדי להבטיח שלכל אדם הבקיע העכברים זהה; עם זאת, ככל הנראה יישאר רמה של הסובייקטיביות שמוביל וריאציה. מרקם של הניקוד הוערך על ידי שבעה חוקרים לא בעבר ביצעה את העכבר neonatal ניטור ללמוד בדרישות המתוארות ב פרוטוקול זה ווידאו, ואז, באופן עצמאי להקצות התנהגויות, לקבוע אנושי נקודת הקצה. הדיוק 97% נצפתה עם הניקוד מתבצע על עכברים מאותגר 60, רומז כי הטיה בודדים לא לשחק תפקיד משמעותי בתיבה הקצאות התנהגותית של מודל זה. פרוטוקול ניטור התנהגותיים שהוצגו מבוסס על תצפיות על בעלי חיים תיגר על 7 עוד לא יודעיםעליהם כלום, עדיין עכברים צעיר יותר 6 ימים במצב בריא לאתגר לא עקבי צודק עצמם. לפיכך, הקריטריונים המתוארים קצה הומאני לא היתה אפשרות להחיל ישירות על עכברים צעירים. אם עכברים צעירים נעשה שימוש במודל ניסיוני זה או אם דגם אתגר שונה עם מחלות שונות קינטיקה מוחל, קריטריונים מתאימים קצה אנושי חייב להיות שפותחה ואז הטיס כדי למנוע המתת החסד של עכברים זה היה אחרת, בסופו של דבר, לשחזר. מערכת התוצאות מציג שיטה חזקה לשיפור קצה הומאני סיווג זה, עם בדיקה ואישור, יכול באופן פוטנציאלי לחול על דגמים אחרים.
כל הכנה של cecal slurry או השימוש בזן העכבר חדש נדרש את retitration של המנה cecal slurry לניהול להשגת מנה קטלנית דומה. בכל אופן ההכנה היה טופל על ידי המדידה של עניין, כלומר הישרדות, ולא נותן את ספירת חיידקים אותו. ריכוז של אופן ההכנה cecal slurry בכל חיידקי קיימא מגוונות מעט, פוטנציאלית, בגלל ההבדלים חיידקים commensal של התורם או עקב סטיות במשקל הותיר מסננת תא של postfiltration מניות cecal slurry. במהלך טיטרציה של slurry cecal, שתי המלטות חולקו לשתי קבוצות, חצי אחד של הגורים לערער לאחד שתי מנות כך כל אחת המנות לבדוק שתי המלטות. אם שיעור ההישרדות וכתוצאה מכך לא תאמה ברמה הנדרשת, לאחר מכן המינון אתגר היה עלה או ירד על ידי 5% - 10%, חזר על הניסוי. המלטות מרובות שימשו להביא בחשבון הבדלים המלטה-כדי-המלטה עלול לגרום התנגדות או גדלה הרגישות אלח דם על פני בהמלטה. זה היה חשוב במדויק כייל המניה cecal slurry עם כל הכנה חדש כדי להבטיח כי טיטרציה החדש של cecal slurry היה להשוות ההכנות cecal slurry הקודם. תקופות של עודף רעש ורעידות, במיוחד במהלך הדחיסה של אספלט לבין הבנייה של הבניין הסמוך ו road, נצפו כדי להגדיל את הלחץ הסכרים. זה בקורלציה עם שיעור מוגבר של קניבליזציה, מושפעות תמותת הניסויים הישרדות, אפילו להשפיע על עכברים לאתגר, המציין כי יכול להיות מיותר משפיע על הישרדות neonatal זה גם צריך להיות מבוקר על.
שיטות מוקדמת להכנה מניות cecal slurry כלל את השימוש slurry cecal טריים או הכנת slurry cecal קפואים, תוך שימוש במגוון שיטות, כולל האחסון של גליצרול זה בלתי נמנע יועברו במהלך האתגר. בעוד השימוש של slurry cecal טרי מספק את היתרון של בעל הרכב חיידקי הקרוב לתוכן cecal המקורי, יש הסיכון של הסטיה בין התורמים עכברים בשל הווריאציה של חיידקים commensal. בזמן זה היה ממוזער באמצעות תורמים cecal מהספק באותו זמן מינימלי בין ההגעה והתקדמות הניסוי, זה יכול להיות אופציה שאבטחה עבור כמה מעבדות והציג עוד אתגר לוגיסטי תזמון בכך תואם גיל עכברים זמין כאשר מתחיל slurry cecal של הניסוי בעכברים neonatal שהיו בן 7 ימים. שיטה חלופית לשימוש slurry cecal טרי היה מנוצל, איפה התוכן cecal כמה תורמים למבוגרים היו איחדו, resuspended ב D5W, קפוא ב- 80 ° C ללא גליצרול, ו הקרת aliquot אחד בכל פעם על ניסויים. הניצול של התורם למבוגרים slurry cecal ללמוד אלח דם neonatal פוטנציאלי יכול להעביר מינים של חיידקים המצויים slurry cecal זה העכבר neonatal לא נחשף, אך זו אסטרטגיה המאפשרת לצורך המחקר של אלח דם בעכברים neonatal ו שימש ללמוד ביולוגיה העכבר neonatal14,13,האחרונות15. Cecal slurry היה מדולל ב D5W לספק תזונה של חיידקים, אשר אפשרה הקמתה של זיהום פעיל פעם אחת החיידקים הוזרקו ולאחר נעשתה כדי לחקות את זמינות החומרים המזינים בחלל הצפק במהלך שדעתו enterocolitis. גליצרול לא נכללה כסוכן מייצב קפואים חיידקים בגלל פוטנציאל שלילי תופעות הלוואי שעלולות לנבוע הזרקת גליצרול לבד. אם היה כבר נכלל גליצרול בהכנת cecal slurry, ואז הנזק האפשרי הזה גליצרול לבד שיכולים לזרז הייתי צריך להיבדק על-ידי הכללת של גליצרול בלבד (חסר cecal slurry) הזרקה בעכברים, אשר הגדילו עכבר השימוש. הכדאיות חיידקים של המניות cecal slurry נבדקה לאחר הקפאה המניה cecal slurry ללא גליצרול, נמצאה להיות קבועה, ללא כל שינוי בריכוז חיידקים ב aliquots נפרדים של הכנת cecal slurry אותו המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס מעל 6 תקופת החודש. הדבר מצביע על כי האחסון מבלי גליצרול הוא ריאלי במתן תוצאה ביולוגי עקבי. השימוש בצובר-מוכן קפוא cecal slurry מניות מותר גם לשימוש של עכברים שגודלו באתר, להפחית את עלות, ניצול עכברים זכרים שאחרת היה עודף של הרבייה, ולכן צמצום בזבוז העכבר.
הזיהוי של אתגרים שנכשלו בעכברים היה חשוב להימנע מהוספת רעש נוסף למערכת. לאחר שעברו זריקה בקרום הבטן של cecal slurry, נצפו העכברים לנוכחות של בליטה מתחת לעור, אשר הצביע זריקה כושל זה היה למעשה תת עורית. עכברים נצפו דליפות במקום ההזרקה, מיד לאחר הסרת מחט וגם לאחר המאפשר להם לקחת צעד אחרי הזריקה, כי עכברים לפעמים דליפה (לעתים רחוקות) רק לאחר המעבר את האיבר של ההזרקה על ידי לקיחת צעד. הנוכחות של הבליטה או דליפה בעקבות הזריקה הביא הסרת העכבר מניתוח. אחרי הכל, מהם יכול לגרום תוצאה שונה עקב כמות שגויה slurry cecal מוזרק כמו הבדל 5% במינון אתגר נצפתה להשפיע על הישרדות עוקבות.
אתגר cecal slurry ניסויים לעתים קרובות נדרש בדרגות שונות היעד קטלניים במינונים והונגריות מינונים ההוראה לפי משקל. בגלל זה, הזרקת כרכים יכולים לנוע מ קטנה כמו 20 µL ועד 100 µL. השגיאה ניסיוני מידתית הקשורים עם המחט מת נפח משנה גם יחד עם אמצעי האחסון הזרקה, הגדלת הקושי להשוות ישירות מינונים שונים. עם שינוי פשוט של האחדת האחסון הזרקה, מקור זה השונות יוסר מן הניסוי.
מערכת ניטור התנהגותית של העכבר neonatal, בשימוש פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו. חוקרים נחוש אתית ערך ניסוי עם עכברים היילוד לרוב עומדים בפני חוסר משאבים כדי להעריך את רווחתו של בעל החיים בגיל זה מאתגר. מערכת ניטור אינטואיטיבי ועקבית הציג מתחיל לפנות את הפער בידע הזה. חשוב, גישה זו מבוססת על ראיות לא רק מגביר את האיכות של המידע מהניסוי שהושג אלא, במקביל, גם מפחית את סבלם של בעלי החיים ניסיוני.
Disclosures
ד ר ג'יימס וויין מקבל תמיכה של מוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) / לאומי המכון למדעי הרפואה הכללית (R01GM128452) ו- NIH / מכוןיוניס קנדי שרייבר הלאומי (ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) R01HD089939).
Acknowledgments
תודה מיוחדת קלייר הריסון חיה אכפת המתקן ב החולים מחקר מכון (BCCHR קולומביה הבריטית לילדים) על תמיכתם בעבודה בבעלי חיים, כמו גם ד ר צ'אנג פו-יאן להנהגה שלהם קלט על פיקוח על בעלי חיים ורווחתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
