Summary
Denne protokol giver de nødvendige skridt til at etablere og evaluere neonatal sepsis i 7 dage gamle mus.
Abstract
Neonatal sepsis forbliver en global byrde. En prækliniske model til skærmen effektiv profylaktisk eller terapeutisk indgreb er nødvendigt. Neonatal mus polymicrobial sepsis kan være fremkaldt ved at indsprøjte cecal gylle intraperitoneal i dag af liv 7 mus og overvåge dem for den følgende uge. Præsenteres her er de detaljerede trin er nødvendige for gennemførelsen af denne neonatal sepsis model. Dette omfatter ligeledes, at en homogen cecal gylle bestand, fortynde det til en vægt - og kuld-justeret dosis, en oversigt over den overvågning tidsplan og en definition af observerede sundhed kategorier bruges til at definere slutpunkter, human. Generation af en homogen cecal gylle bestand fra poolede donorer tillader administration i mange kuld over tid, at reducere variation mellem donorer og forhindre brug af potentielt giftige glycerol. Overvågningsstrategien anvendes giver mulighed for foregribelse af overlevelse resultatet og identifikation af mus der ville senere gå videre til døden, giver mulighed for en tidligere identifikation af human slutpunktet. To vigtigste adfærdsmæssige funktioner bruges til at definere sundhed scorer, nemlig neonatal musene evne til at rette når de placeres på deres ryg og deres grad af mobilitet. Disse kriterier kunne potentielt anvendes til adresse Human slutpunkter i andre undersøgelser af neonatal sygdom i mus, så længe en pilotundersøgelse er udført for at bekræfte nøjagtigheden. Afslutningsvis giver denne tilgang en standardiseret metode til model nyfødte sepsis hos mus, men samtidig give ressourcer til at vurdere dyrevelfærd bruges til at definere begyndelsen Human slutpunkter for angrebne dyr.
Introduction
Sepsis er en førende årsag til nyfødte smitsomme døde1. Fordi nyfødte sepsis er dårligt forstået, er der gjort lidt fremskridt i begge identifikation af udsatte nyfødte tidligt i sygdommen og udvikling af effektive behandlinger eller prophylaxes. Dette kræver anvendelsen af dyremodeller for sepsis til bedre at forstå de proces og test mulige interventioner. Derudover reagerer voksen gnavere forskelligt på sepsis, med statistisk signifikante forskelle i antallet af bakterier til at administrere for at få den samme dødelige dosis (LD) og forskelle i den resulterende host reaktion i forhold til nyfødte2. Neonatal sepsis har således, som skal undersøges i nyfødte. Flere voksne sepsis modeller har været brugt i sepsis forskning. Disse omfatter en intravenøs udfordring med specifikke organismer impliceret i voksne menneskers sepsis eller cecal ligatur og punktering (CLP). CLP er en endogen challange model hvor coecum kirurgisk er isoleret, forbundet og punkteret for at tillade lækage af tarmindhold i bughinden, i sidste ende fører til den systemiske formidling af mikrober og deres produkter3. Men den kirurgiske procedure skal udarbejde CLP er dødelig for nyfødte dyr; en alternativ metode er derfor nødvendigt at efterligne polymicrobial udfordringen af CLP til at fremkalde neonatal sepsis. Cecal gylle model for neonatal polymicrobial sepsis blev udviklet for at imødegå dette behov, hvorved cecal indholdet af dyr er høstet, suspenderet i sterile dextrose 5% i vand (D5W), og intraperitoneal indsprøjtes i nyfødte mus2. Dette er siden, blevet en stadig mere populær model til at studere sepsis hos nyfødte og voksne dyr og har betydeligt avancerede mekanistiske indblik i den sygdom proces4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
I betragtning af den stigende brug af denne model og ønske om forskere at direkte sammenligne resultater på tværs af publikationer, er der behov for de tekniske aspekter til at være godt beskrevet og standardiseret på tværs af undersøgelser. Standardisering gælder for tre aspekter af modellen, nemlig i) forberedelse af cecal gylle stock, ii) udarbejdelse af udfordring delprøver til injektion i de eksperimentelle dyr og iii) definitionen af det humane slutpunkt hvorved dyr anses nonsurvivors i udfordring eksperimenter. Specifikt, er metoder til at forberede cecal gylle bestanden ofte refereres til den oprindelige artikel at indføre model2. Et kort resumé af denne model er, at cecal indholdet fra voksne mus blev høstet, suspenderet i sterile D5W til en koncentration på 80 mg/mL og anvendes inden for 2 h til at injicere de forsøgsdyr. Denne originale model brugt mus i samme aldersgruppe, fra den samme leverandør placering, som var til huse i deres respektive forskningsfaciliteter for mindre end 2 uger før høst cecal indholdet. Brug af in-house opdrættet mus, øget selv om at reducere omkostningerne fra regelmæssige leverandør levering og giver mulighed for anvendelse af overskydende mus af en bredere vifte af køn og alder, også væsentligt donor-til-donor variabilitet. Dette motiveret udvikling af en alternativ teknik, hvorved cecal indhold fra flere mus blev samlet sammen til at forberede et stort lager, som derefter blev aliquoted og opbevares ved-80 ° C13. Denne alternative metode blev tilpasset af flere grupper14,15. Men denne tilpasning resulterede i nogle tekniske varianter, både i den opbevaring medier bruges (10% eller 15% glycerol eller D5W alene) og i strategien for filtrering til at fjerne partikler (flertrins filtrering gennem et 860 µm og derefter en 190 µm filter eller enkelte filtrations gennem 100 µm eller 70 µm filtre)13,14,15. Injektion af glycerol alene kan potentielt skade, at 25% - 50% glycerol indsprøjtninger har været brugt som en gnaver model af nyre skade16,17,18,19, 20. For at undgå utilsigtede bivirkninger af glycerol, cecal gylle stock forberedelse til mus i denne undersøgelse er frosset i D5W uden glycerol, og test af bakteriel levedygtighed fra opbevaring ved-80 ° C udføres. Den filtrering strategi, der anvendes i denne undersøgelse er en pass gennem en 70 µm filter, som ikke har været direkte sammenlignet med de andre filtrering strategier opført.
Dødelige vægt-justeret doser af injicerede cecal gylle kan variere fra anlæg til anlæg og skal titered ud til den ønskede dødelighed for enkelte grupper. Med forskellige udfordring doser ændre de ledsagende udfordring mængder af nødvendighed. Men denne metodologiske detalje er ikke blevet rapporteret før. Derudover strategier for standard procedurer, såsom intraperitoneal injektion, er sjældent udarbejdet på inden for litteraturen, men enkelte teknikker kan påvirke om nyfødte mus lække når injiceres og påvirke deres endelige resultater.
Dyrevelfærd, herunder en definition af human slutpunkt, er et centralt aspekt af denne model og i hvilken som helst model af infektion og betændelse i gnavere21. I 1998 offentliggjort den canadiske Rådet på Animal Care (CCAC) omfattende retningslinjer for human slutpunkt udvælgelse, definere den humane slutpunkt, som "nogen faktiske eller potentielle smerte, angst eller ubehag skal minimeres eller lindres ved at vælge den tidligste Endpoint er forenelige med de videnskabelige mål for forskningen"22. Andre også forsigtig at Human slutpunkter skal oprettes baseret på videnskabeligt grundlag og ikke på en subjektiv fortolkning af dyrets tilstand alene21. Mens der er et væld af ressourcer til klinisk, adfærdsmæssige, og huld tegn-baserede kriterier for human slutpunkt, selv i forbindelse med infektion og betændelse specielt21,23,24, ingen af disse , herunder CCAC retningslinjerne for human slutpunkt22, nævne nyfødte mus. Således er objektivt og videnskabeligt begrundede Human slutpunkter langt vanskeligere at etablere for nyfødte dyr, givet både deres begrænsede adfærdsterapi evner og manglende beviser fra kriterier som vægttab, der er almindeligt anvendt til voksen mus. I øjeblikket, kriterierne for human slutpunktet bruges til 5 til 12 dage gamle neonatal mus i cecal gylle litteratur alle referere tilbage til det originale manuskript, der indførte model2. I dette oprindelige papir, var definition af human slutpunkt for nyfødte dyr baseret på to kriterier; nemlig, placeringen af en mus uden for reden (spredning) og mangel på mælk steder havde været set at resultere i dødsfald inden for timer. Et komplicerende spørgsmål i tildele en human slutpunkt er at mælk steder blive svært at se i mus stammer med mørk pels, som den almindeligvis ansat C57BL/6J stamme, efter den første uge af livet, mens syge dyr er overvåget indtil den 14. dag i livet (DOL). Yderligere, døde dyr kan findes postchallenge ved anvendelsen af disse kriterier (egen observation, upubliceret); således, en strengere definition af human slutpunkt er nødvendige for at lindre lidelse til forsøgsdyr og undgå dødelighed i situationer hvor resultatet kunne præcist skimtes tidligere.
Alle tre metodologiske aspekter af cecal gylle model præsenteres i en standard operating procedure beskriver forberedelse af cecal gylle bestand, en metode til indsprøjtning forsøgsdyr der holder konstanten injektion volumen mellem doser og reducerer risikoen for lækager, og en definition af human slutpunkt for 7 til 12 dage gamle mus baseret på et system af adfærdsmæssige modellering. Adfærdsmæssige oplysninger af mus sundhed scorer fra over 240 forsøgsdyr blev indsamlet og grupperet efter sidste overlevelse resultatet, demonstrerer en tegn-drevet definition af human slutpunkt. Lidelser af forsøgsdyr er reduceret ved at identificere døende neonatal mus på det tidligst mulige tidspunkt, mens biologisk betydelig overlevelse resultater kan udledes ved at observere nøglevariabler. Den visuelle repræsentation af både cecal gylle forberedelse og neonatal mus adfærd vil tjene som en fremragende ressource til enhver gruppe studerer sepsis eller nyfødte udfordring model dyr.
Protocol
Alle eksperimenter i denne protokol er blevet godkendt af University of British Columbia animalsk omhu Udvalget under protokolnummer A17-0110.
1. værktøj sterilisation
- I en biologisk sikkerhed kabinet (BSC), tænde og Forvarm varm perle sterilizer til 250 ° C, mindst 30 min før brug.
- Dyp værktøjerne i 70% ethanol.
- Dykke værktøjer ind i forvarmet varm perle sterilizer for et minimum af 1 min.
Bemærk: Håndtag af værktøjerne vil få varme og kan brænde hvis venstre i varm perle sterilizer for over 1,5 min. - Spray en mat papir håndklæder med 70% ethanol til at sterilisere den.
- Fjerne værktøjerne fra hot perle sterilizer uden at røre den steriliserede del af værktøjet til nonsterile håndtag for andre undersøiske værktøjer og placere dem på ethanol-sprøjtede papirhåndklæder.
- Vente 30 s til 2 min for værktøjer til at køle ned, før du bruger dem til dissektion.
2. cecal gylle forberedelse
- Preweigh 15 mL centrifugeglas (et rør til hver fem mus at være euthanized).
- Aflive cecal gylle donorer efter lokale dyrs pleje retningslinjer eller bruge protokollen nedenfor.
Bemærk: Op til 40 C57BL/6J mus mellem 6 og 12 uger gamle blev brugt til cecal gylle forberedelse, med op til fem mus at være euthanized ad gangen.- Overføre mus til dødshjælp kammer og sæt isofluran anæstesi maskine til 5% ilt perfusion.
- Overvåge mus for at observere tabet af evnen til at flytte og se dem ind i kirurgisk flyet af anæstesi og endelig stoppe vejrtrækningen.
- Fjerne en mus fra eutanasi kammer, klemme sin pote og overhold eventuelle ben retraktion eller indånding. Hvis enten er til stede, returnere musen til dødshjælp kammer; ellers Fortsæt.
- Uhelbredeligt aflive mus af skarpe cervikal dislokation.
- Udføre coecum dissektion, ved hjælp af værktøjer til presterilized og afkølet (se punkt 1) i et BSC.
- PIN benene på mus til en ekstruderet polystyrenskum bord med 23 G nåle, så musen har sit underliv op. Sikre og derefter spray maven med 70% ethanol.
- Brug steril pincet og saks, skære igennem huden, løsne hud fra peritoneal foring med saksen og skåret åben et rektangulært område fra lysken til brystbenet, og venstre side til højre side. Fjern eventuelle pels fra bughinden.
- Skifte til et nyt par af sterile redskaber til at skære igennem bughinden, hvilket gør en rektangulær åbning, som det var tilfældet for huden, skifte værktøjer hvis dem brugt kontakt huden.
- Identificere coecum, som bør kører til venstre mod højre på tværs af kroppen. Forstyrre bindevæv for at identificere coecum grenene fra tarmene og skære coecum fra tarmene. Placer coecum på en steriliseret ark vejer papir.
Bemærk: Vejning papir kan være steriliseret, enten ved at sprøjte det med 70% ethanol på begge sider og overlade det til tørre, eller af UV-bestråling. Alternativt kan blive dissekeret coecum på en steril Petri plade.
- Cecal indhold ekstrudering
- I et BSC, skal du bruge sterile redskaber til at skære igennem begge ender af coecum.
- Hold i midten af coecum med steril pincet og bruge en flad sterile metal spatel til forsigtigt skubbe cecal indholdet ud af snittet ender, ved hjælp af en rullende bevægelse og undgå en skrabning bevægelse, der kunne rive epitel. Indsamle indhold og placere dem i en preweighed 15 mL-centrifugerør.
- Pool cecal indholdet fra højst fem mus ind i det samme rør. Veje røret igen, når hele indholdet er blevet tilføjet.
Bemærk: Forventer et gennemsnit på 300 mg, og op til 390 mg cecal gylle pr. mus, der kræver 1,8 til 2,4 mL af D5W til resuspension pr. mus; Derfor, ved hjælp af mere end fem mus i dette trin kan resultere i at overfylde 15 mL-centrifugerør. - Tørre værktøjer ren med en ethanol-sprøjtede køkkenrulle og plastikimplantater dem ved at gentage trin 1,2-1,6.
- Cecal gylle filtrering
- Vejer centrifugeglasset fyldt med cecal indholdet og beregningen af D5W til at tilføje til cecal indholdet ved at dividere vægten af cecal indholdet af den ønskede stock koncentration i milligram pr. milliliter, som i nedenstående ligning.
- I et BSC, skal du tilføje den nødvendige mængde af iskolde D5W til 15 mL centrifugeglas indeholdende cecal indholdet.
- Vortex 15 mL centrifugeres tube lodret og vandret i 30 s. Check for partikelemission på mere end 1-3 mm i diameter, og hvis til stede, fortsat vortexing, indtil alle store partikler er synligt forsvundet.
- Placer en steril 70 µm celle si i et 50 mL-centrifugerør, der er placeret på is. Der afpipetteres 4 mL resuspenderet cecal gylle i celle sien og derefter til collection tube. Resuspend partikler af pipettering op og ned 2 x-3 x. Forsigtigt presse boblerne til at øge den filtrering hastighed mens omrøring indholdet med pipette spids, indtil der ingen flere dråber filtreres.
Bemærk: Når blanding, der kan være partikler stor nok til at sætte 5 mL pipette. I dette tilfælde gentage vortexing fra trin 2.5.3, og hvis løsningen ikke stadig bryde ud, bruge pipetten til at trykke partikler mod væggen i centrifugeglasset. - Gentag trin 2.5.4, ændre celle sier mellem hver tube cecal gylle og pool alt indhold ind i samme 50 mL centrifugeres samling røret holdes på is eller i en anden 50 mL-centrifugerør Hvis filtratet overstiger is niveau i boksen is.
- Vejer centrifugeglasset fyldt med cecal indholdet og beregningen af D5W til at tilføje til cecal indholdet ved at dividere vægten af cecal indholdet af den ønskede stock koncentration i milligram pr. milliliter, som i nedenstående ligning.
- Alikvot cecal gylle.
- Hvis det er relevant, kombinere flere 50 mL cecal gylle filtratet rør fra trin 2.5.5 til en større steril beholder (f.eks. en 1.000 mL opbevaring flaske). Derefter, vortex for 15 s og sted 20 mL i en ny 50 mL-centrifugerør.
- Vortex cecal gylle bestand, der er i 50 mL-centrifugerør for 5-10 s og alikvot 500 µL til tre 2 mL kryogene hætteglas, der har en gummipakning at forhindre fordampning over tid. Umiddelbart Placer master lager og aliquoted kryogene hætteglas på is.
- Gentag trin 2.6.1 og 2.6.2 indtil alle cecal gylle har været aliquoted, vortexing master bestanden efter hver tre kryogene hætteglas at forhindre bilæggelse af eventuelle partikler og opretholde en homogen blanding.
- Fryse cecal gylle alikvoter ved-80 ° C.
Bemærk: Forvent mellem tre til fire stock hætteglas på 500 µL af hver voksen mus. Hver bestand hætteglas bør være nogenlunde nok til udfordring et kuld på otte mus på DOL 7.
3. sepsis udfordring af 7 dage gamle neonatal mus
- Adskille, identificere og vejer neonatal mus.
- I et BSC, overføre neonatal mus til et nyt bur at holde mus væk fra dæmningen og reducere stress til dæmningen.
- Fjerne og gnid del af redemateriale med handsker til at overføre den bur lugt til handsker. Derefter forme den redemateriale ind i en mindre reden og læg det i en ny bur uden dæmningen.
- Overføre neonatal mus til redemateriale i den nye bur.
- Overføre flere redemateriale for at gøre en anden, tomme reden i den nye bur.
- Lukke og fjerne den dæmning bur fra emhætten, så dæmningen ikke er fremhævet fra høre nogen af neonatal musene nød.
- For at spore individuelle neonatal mus i kuldet over tid, skal du bruge en ethanol-bevis markør til at markere et til fem prikker på forsiden eller bagsiden af halen, genanvende hver 12-24 timer efter behov.
- Veje hver mus, der vil blive udfordret, placere hver i sekundært reden efter vejning, og Gentag dette for alle mus.
- Returnere hele kuldet til dæmningen før forberede cecal gylle udfordring alikvot.
- Beregne de individuelle vægt-justeret doser af cecal gylle og krævede fortynding med D5W ved at fuldføre dette trin for hvert kuld separat, ved hjælp af beregningerne nedenfor eller bruge den medfølgende regneark (Se Supplerende fil).
- Beregne milligram af cecal gylle (en) skal indgives til hver musen ved at multiplicere vægten af musen i gram (b) af den ønskede udfordring dosis i mg af cecal gylle per gram af musen (c).
- Beregne de enkelte bind af ufortyndet cecal gylle lager kræves pr. mus i microliters (d) ved at dividere milligram af cecal gylle nødvendige per mus fra trin 3.2.1 (en) af stock cecal gylle koncentration, 160 mg af cecal gylle per milliliter af D5W (e), og at multiplicere med 1.000 µL pr. milliliter konvertere fra milliliter til microliters.
- Gennemsnit cecal gylle lager volumen kræves pr. mus (g) ved at sammenlægge mængden af cecal gylle stock (d) pr. mus i et kuld af n mus, divideret med antallet af mus (n).
- Beregn den gennemsnitlige fortyndingsfaktoren for cecal gylle bestand (h) ved at dividere den gennemsnitlige Injektionsvolumen (100 µL) den gennemsnitlige lager volumen af cecal gylle kræves pr. mus (g).
- Hver musen specifikke Injektionsvolumen i microliters (j) beregnes ved at multiplicere hver mus volumen af stock cecal gylle kræves (d) med den gennemsnitlige fortyndingsfaktoren (h), og derefter at afrunde det til de nærmeste ti (til at matche den 10 µL intervaller af injektion sprøjte).
- Beregn den gennemsnitlige nødvendige volumen af D5W til at fortynde cecal gylle stock (k) ved at trække den gennemsnitlige cecal gylle bestand (g) fra den gennemsnitlige Injektionsvolumen (100 µL).
- Beregn det samlede beløb af cecal gylle lager i microliters (l) ved at multiplicere den gennemsnitlige bestand cecal gylle pr. mus i microliters (g) af antallet af mus i dette kuld (n) og multiplikation med 1,4 til skabe ekstra.
- Beregn det samlede beløb af D5W i microliters (m) skal fortyndes cecal gylle lager ved at multiplicere den gennemsnitlige nødvendige volumen af D5W (k) efter antallet af mus (n) og multiplikation med 1,4 til skabe ekstra.
- Beregne milligram af cecal gylle (en) skal indgives til hver musen ved at multiplicere vægten af musen i gram (b) af den ønskede udfordring dosis i mg af cecal gylle per gram af musen (c).
- Forberede udfordring delprøve efter beregningen af stock cecal gylle kræves (l fra trin 3.2.7). I et BSC, tø det krævede antal cecal gylle stock hætteglas ved stuetemperatur, pipettering indholdet til mix.
- Når der er ikke mere synlige iskrystaller præsenterer i den optøede cecal gylle, overføre det beregnede beløb af cecal gylle stock (l fra trin 3.2.7) til en steril 1,8 mL microcentrifuge tube.
- Fortyndes til den nødvendige koncentration ved at tilføje iskold D5W som beregnet i trin 3.2.8 (m). Gemme udfordring alikvot på is.
- Før pålæsning af sprøjten, bland microcentrifuge rør ved at bladre det 20 x, efterfulgt af 3 x udarbejde og udvise 300-500 µL af cecal gylle med en 500 cc 28 G ½ tomme insulin sprøjte.
- Udarbejde omtrent 150 µL fortyndede cecal gylle ind i samme sprøjten.
- Svirp i sprøjten for at løsne bobler fra stemplet, trække tilbage lidt på sprøjten og derefter ekskludere boblerne.
- Undvære den overskydende cecal gylle tilbage ind i microcentrifuge røret indtil den korrekte mængde af cecal gylle til en mus, som blev beregnet for individuelle mus i trin 3.2.5 (j), er indlæst i sprøjten.
- Intraperitoneal injicere cecal gylle, ifølge relevante lokale dyrs pleje institution retningslinjer, eller brug trinene nedenfor.
- I et BSC, skal du adskille neonatal mus fra dæmningen, som beskrevet i trin 3.1.
- Harmoniske mus af bagsiden af halsen, ved hjælp af tommel- og pegefinger.
- Sikre musens halen hen over ryggen af midten og ringfingeren eller på forsiden af ring og pinky fingrene.
- For at minimere lækager, tilt neonatal musen, så den vender nedad og indsætte nålen facet af nålen opad, mellem benet og kønsorganer, at holde nålen lavvandede og subkutane.
- Når nålen er sat til 1 cm, tryk på nedad og fremad for at føle nålen punkterer bughinden. Langsomt trykkes stemplet, holder spidsen af nålen så stabil som muligt, da laterale bevægelser kunne beskadige musens organer.
- Forsigtigt trække nålen 5-10 s, efter den samme rute ud som i afslappende den midterste finger under fjernelse at reducere spændinger i musens krop.
- For at kontrollere for lækager, hold musen i et par sekunder efter fjernelse af nålen, at give tid til injektionsstedet til at lukke, og observere nogen lækage eller udbuling ved injektionsstedet, på hvilket tidspunkt musen ikke bør anvendes i analysen.
Bemærk: Udbuling af huden på injektionsstedet angiver en mislykket intraperitoneal injektion med injectant at være subkutane. - Placer musen på et stykke køkkenrulle og lad musen til at tage et skridt. Hvis musen er immobile for 5 s, Tryk let på halen.
- Afhente musen og kontrollere for enhver lækage af cecal gylle på injektionsstedet. Hvis der er en utæthed, udelukke musen fra analysen og aflive mus.
4. med musen kontrol
- Overvåge mus regelmæssigt for at tjekke dem for ankommer til en human slutpunkt.
- Observere musene 2 h postchallenge for nogen injektion-relaterede komplikationer.
- Overvåge mus 12 h postchallenge for sepsis-relaterede sygelighed og identifikation af mus på en human slutpunkt (Se trin 4.2-4.3 for kriterier).
- Efterfølgende overvåge hver 4-6 h for de første 2 dage, medmindre 8 h natten over, hvornår neonatal musene er uden opsyn.
- Ud over 2 dage postchallenge, overvåge 1 x-2 x per dag. Hvis syg mus eller mus hvis sundhed score falder overholdes, derefter øge den overvågning frekvens til hver 4-6 h.
- Overvågning neonatal mus
- Overfør strøelse materiale til et nyt bur for enhver procedure, der omfatter neonatal mus, som beskrevet i trin 3.1 (af samme grunde som nævnt der). Nøje kontrollere for eventuelle nyfødte, der er trukket fra nest samtidigt med at barnepleje. En mus, der er trukket ud af kuldet, mens ammende ikke bør anses for at være spredt mus.
- Når du fjerner toppen af reden, identificere enhver spredning af neonatal mus enten fra reden eller fast i den redemateriale men væk fra deres littermates, bortset fra mus trækkes væk fra kuldet samtidigt med at barnepleje. Henvise til human slutpunktet kriterier i trin 4.5 Hvis musen er fundet spredt.
- Måle mus oprettende reflekser og mobilitet.
- På et stykke køkkenrulle, placere en mus på ryggen og overvåge for sin evne til at rette sig selv inden for højst 4 s. Når de placeres på ryggen, vil musen falde til enten venstre eller højre side, som er når 4 s optællingen begynder.
Bemærk: For at blive klassificeret i gruppen "Rettigheder", skal musen være i stand at få mindst tre af fire paw puder på papir håndklæde for 1 s. Det er stadig grupperet som værende i stand til at rette sig selv hvis det falder over.- Hvis musen kan lige selv, derefter vente 8 s til at bestemme dets grad af mobilitet.
- Kategorisere musen som "Rettigheder-mobil", hvis det kan lige sig og udforske sin miljø ved at tage flere skridt i en række.
- Kategorisere musen som "Rettigheder-sløv", hvis det kan lige sig selv og tage et par skridt til at udforske omgivelserne. Mus i denne gruppe kan falde over mens du tager et skridt, se rystende på deres fødder og pause mellem trin.
- Kategorisere musen som "Rettigheder-Nonmobile", hvis det kan lige selv men ikke bevæger sig meget rundt. Det kan stadig falde over, og hvis det ikke tage skridt inden for 8 s, det er grupperet som rettigheder-Nonmobile.
- Hvis musen ikke kunne lige selv, derefter kategorisere sine mobilitet, baseret på den observerede hip bevægelse.
Bemærk: Undgå at gentage overvågning eller øge længden af tid musen bruger på deres ryg, fordi dette kunne påvirke pointsystemet og human slutpunkt, som en mus, der undlader at rette sig selv inden for 4 s kan undertiden gøre det hvis givet mere tid.- Kategorisere mus som "Fail til ret (FTR)-mobil" Hvis det ikke er i stand til at rette sig selv og viser hip bevægelse, der overstiger 90° vinkel fra vandret. Nogle mus kan lige selv givet mere end 4 s men bør stadig blive kategoriseret som FTR, med mobilitet score baseret på hip bevægelse.
- Kategorisere musen som "FTR-sløv", hvis det ikke er i stand til at rette sig selv og viser hip flytning under 90° vinkel fra vandret.
- Kategorisere mus som "FTR-Nonmobile" Hvis det ikke er i stand til at rette sig selv og har ben at ryste eller vibrere men ingen hip bevægelse. Lemmer kan udvide eller trække men gør ikke have sideværts bevægelse. Musen er synligt syg og har nået humane slutpunktet.
- På et stykke køkkenrulle, placere en mus på ryggen og overvåge for sin evne til at rette sig selv inden for højst 4 s. Når de placeres på ryggen, vil musen falde til enten venstre eller højre side, som er når 4 s optællingen begynder.
- Gentag trin 4.3 på anden siden af musen, registrering af begge sider.
Bemærk: Se Supplerende fil til registrering af observationer. - Afgøre, om musen er på en human slutpunkt og kræver eutanasi som beskrevet i tabel 1, og nedenfor.
- Kategorisere mus i forskellige oprettende og mobilitet niveauer baseret på overvågning observationer noterede i trin 4.3 og 4.4. Musens mobilitet måles for hver side, og den mobile adfærd bruges til at bestemme, om musen kræver aktiv dødshjælp.
- Tildele en mus med en oprettende refleks af enten a FTR-Nonmobile eller b FTR-sløv og fandt adskilt fra reden skal på en human slutpunkt.
- I overvågning tidspunkter ud over 20 h postchallenge, klassificere enhver mus med en oprettende refleks af "fail til højre" på begge sider som værende på en human slutpunkt, fordi de præsenterede data forudsige med stor nøjagtighed at disse mus til sidst bukker under for sygdom, ikke og Genskab.
- Separat mus, der skal aflives, som bestemt i trin 4.5. Hvis det overvågede mus ikke er set som på en human slutpunkt, læg det i den anden tomme reden i den nye bur uden dæmningen, og fortsætte med de andre neonatal mus.
- Når hele kuldet er blevet overvåget, flytte halvdelen af den redemateriale ind i buret med dam, reformere en rede med plads i midten til neonatal musene.
Bemærk: En forkert udformet reden kunne forårsage mus til scatter og reducere mængden af tilgængelige pleje, at dæmningen kan tilbyde. - Overføre neonatal musene tilbage ind i buret med dæmningen.
- Omslut kuldet i reden ved at sætte den sidesten redemateriale over kuldet og forsigtigt klemme det omkring låget til sikre redebygningsmateriale i sted.
- Aflive neonatal musene adskilt i trin 4.6 ifølge lokale institution krav.
5. titrering af cecal gylle
- Udfordre mus på den ønskede udfordring dosis (afsnit 3) og overvåge resultater (afsnit 4).
- Observere om det endelige resultat resulterer i de ønskede LD, og hvis ikke, skal du gentage punkt 3 og 4 med et nyt kuld på en højere eller lavere udfordring dosis, justere det med 5-10%.
Bemærk: Udfordring doser kan være magen til figur 1B , men skal være titered i hver facilitet og stamme af mus. - Også, observere om musene opnå en human slutpunkt hurtigere eller langsommere end den forventede kinetik i figur 1B, og Gentag punkt 3 og 4 med et nyt kuld på en højere eller lavere udfordring dosis, justere det med 5-10%.
Representative Results
Cecal gylle levedygtighed opbevares ved-80 ° C kan testes over tid ved seriel fortynding og plating delprøver af cecal gylle bestand på 5% får blod tryptic soja agar efterfulgt af 24 h af aerobe inkubation ved 37 ° C. Efterfølgende optælling af bestemmelse kolonidannende enhed (CFU) indholdet af et cecal gylle forberedelse fandtes ikke for at ændre over en periode på 6 måneder, og levedygtighed blev ikke ramt af langvarig opbevaring ved-80 ° C (figur 2). Hver donor mus resulterede i gennemsnit i nok cecal gylle til at udfordre tre til fire kuld (data ikke vist).
Mus udfordret på DOL 7 med cecal gylle til at fremkalde polymicrobial sepsis begyndte at kommer til human slutpunktet inden for 12 timer af udfordringen, og polymicrobial sepsis var for det meste løst af 48 h postchallenge, som bemærket i en Kaplan-Meier overlevelse kurven kombineret fra data fra mere end 200 udfordret mus (figur 1A). Dødelighed var afhængige af den udfordring dosis, med en 5% ændring i udfordring dosis resulterer i en omtrent 15% forskel i overlevelsen (figur 1B). Kropsvægt mus blev målt ved hvert kontrolbesøg. Vægttab blev set i alle angrebne dyr, er ikke-diskriminerende mellem mus, der endte med overlevende og dem, der ikke under første 24 h postchallenge (figur 1 c). Efter 24 h begyndte mest overlevende dyr at genvinde deres vægt, mens alle nonsurvivors fortsatte med at tabe sig og flyttede til deres Human slutpunkt. Men en lille del af overlevende dyr, der havde bevaret deres oprettende refleks fortsatte også med at tabe sig eller har undladt at vinde vægt, indtil slutningen af forsøget, selv at miste så meget som 20% af deres oprindelige kropsvægt inden for 40 h udfordring. Da der var en overlapning af vægttab mellem mus, der endte med overlevende og dem, der gjorde ikke, ændring i vægt eller en tærskel på vægttab kunne ikke bruges som et kriterium for human slutpunkt samtidig bibeholde mål præcist opdeling overlevende fra nonsurvivors.
Opførsel af mus blev overvåget som skitseret i protokollen og i tabel 2. Snapshots af sundhed kategorier vises (figur 3A-C). Disse fotos viser forskellige sundhedsmæssige kategorier af mus som ikke lige selv efter at blive placeret på ryggen og skitsere forskellen mellem FTR-mobiltelefon og FTR-sløv, hvilket er en vigtig forskel. Ubestridte sund mus i denne alder vise ikke FTR-sløv aktivitet; Derfor, denne sundhed kategori er en markør af sygdom og et svar til at udfordre. Syg mus vises FTR-sløv symptomer (figur 3B) og kunne relatere mod FTR-Nonmobile (figur 3 c), hvor den øverste ben forbliver parallelt med bunden benet, med lidt at nul hip vuggende bevægelse, som er et af kriterierne for Human slutpunkt. Mus kan også gendanne, at få øget hip bevægelse og bliver FTR-Mobile (figur 3A). Den oprettende refleks og mobilitet noder blev bestemt for både venstre og højre side af hver mus, og den højeste score blev udnyttet til at afgøre, om musen havde nået en human slutpunkt. Adfærdsmæssige oplysninger blev indsamlet fra over 240 dyr udfordret med en dødelig dosis 60 (LD60) cecal gylle, og 144 Human slutpunkter blev observeret (figur 3D-F og tabel 1). Dette beviser-driven tilgang blev brugt til at definere og forfine den humane slutpunkt på tværs af fire sygdom stadier, kategoriseret eksperimentatorer baseret på begge adfærdsmæssige forskelle mellem overlevende og nonsurvivors og brøkdel af human slutpunkter nåede under hver tidsramme. Ved tidlige forsøg fandtes FTR-Nonmobile mus, der havde ingen hip bevægelse konsekvent døde inden for 4-6 h af denne adfærd, overholdes. I samlingen af de oplysninger, der præsenteres blev en FTR-Nonmobile sundhed score anvendt som kriterium for en human slutpunkt. Fra 12-21 h postchallenge, mens FTR-Nonmobile mus blev aflivet, både overlevende og nonsurviving dyr vises meget lignende adfærdsmønstre og kunne ikke fornemme på anden måde (figur 3D). Fra 21-48 h postchallenge, fleste overlevende mus genvandt deres oprettende refleks, mens færre end 1% af de FTR adfærd observeret var i dyr, der ville gå på at overleve eksperimentet (figur 3). Mus der har kunnet rette fra begge sider blev dermed, et yderligere kriterium for human slutpunkt i løbet af denne tid. Mellem 12 og 20 h postchallenge, blev 12,5% af det samlede antal Human slutpunkter observeret, versus 80,5% mellem 20 og 48 h, og 7% efter 48 h (tabel 1). Et særkende mellem mus der endte med at overleve og til sidst forværret til en human endpoint var tabet af den oprettende refleks, uafhængig af hip mobilitet (figur 3F). Ja, mellem 20 og 48 timer efter udfordringen, ialt 121 mus havde undladt at sig ret fra begge sider, med 116 af disse mus til sidst udvikler sig til en human slutpunkt, (som repræsenterer en 96% nøjagtighed i at identificere mus, der ikke ville gendrive). Ud over 48 timer efter udfordringen, blev 11 mus observeret for at undlade at rette fra begge sider, og 10 af disse skred til en human slutpunkt (en 91% nøjagtighed). Over 20 h efter udfordringen anslår antallet af mus der mistede den oprettende refleks for begge parter det endelige resultat med en nøjagtighed på mere end 90%; Derfor er dette blevet føjet til human slutpunkt kriterier til at identificere nonrecovering mus tidligere og reducere mus lidelser (tabel 1).
Hyppigheden, mus brug for overvågning af ændringer over tid, på grund af forskellige satser for død postchallenge, og er skitseret i tabel 1. En mus blev anset for at være ved sin humane slutpunkt på ethvert tidspunkt, hvis det havde undladt at rette sig selv og vises nonmobile hofte bevægelse på begge sider, eller hvis musen blev fundet spredt fra reden, var ikke i stand til at rette sig selv, og havde sløv hip bevægelse. Mus med en af disse betingelser ikke var forventes at være i stand til at slutte sig til kuldet og er blevet observeret for at være FTR-Nonmobile inden for 4-6 h. starter 20 h efter udfordringen, blev en ny Human slutpunkt tilføjet fordi de præsenterede oplysninger viser, at den store størstedelen af mus der FTR fra begge sider ender med at bukke under for sygdommen.
Videoer, tabeller og ressourcer præsenteres i dette håndskrift er en effektiv undervisning ressource for den korrekte adfærdsmæssige tildeling af udfordret mus. Syv eksperimentatorer blev bedt om at se uddannelse video og Læs tabellerne og protokollen før tildeling adfærd til 60 angrebne dyr. Identifikation af human slutpunkt tildeling var nøjagtig både for karakteristiske FTR-Nonmobile mus fra mus, vises anden adfærd (figur 4A) og FTR mus fra mus, der var i stand til at rette sig selv inden for den tilladte tidsramme ( Figur 4B).
Figur 1 : Kaplan-Meier overlevelse kurven, cecal gylle dosis titrering og vægtændring efter cecal gylle udfordring. (A) overlevelse resultatet af neonatal C57BL/6J mus udfordret med en intraperitoneal cecal gylle indsprøjtning på DOL 7. Data for denne figur blev kombineret fra uafhængige eksperimenter ved hjælp af flere udfordring doser, lige fra 0,7 1,3 mg af cecal gylle pr. gram vægt blev administreret til disse mus. (B) Neonatal mus udfordret med 0,80 til 0,95 mg af cecal gylle pr. gram vægt fra én cecal gylle forberedelse vise en dosis-afhængige relation mellem mængden af cecal gylle i betragtning og procentdelen af overlevelse. ()C) procentdelen af ændring i vægt i forhold til vægten, udfordring, med den stiplede linje angiver en 20% tab vægt fra tidspunktet for udfordringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : CFU koncentration i cecal gylle stock opbevares ved-80 ° C ændrer ikke over en periode på 6 måneder. Effekt af cecal gylle alder på CFU koncentration blev testet ved hjælp af lineær regression. Hvert punkt repræsenterer en alikvot af det samme cecal gylle forberedelse, seriefremstillede fortyndet og forgyldt over en periode på 6 måneder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hip mobilitet kategorier af mus, der undlader at rette sig selv og af animalsk opførsel på forskellige tidspunkter, postchallenge. Mus, der har været udfordret med sepsis, når de placeres på ryggen, vil vise tegn på sygelighed, der kan måles ved graden af hofte bevægelser. (A) A fail til ret (FTR)-mobil mus viser hip vuggende bevægelse af deres øverste ben overstiger 90 ° vinkel fra vandret. (B) en FTR-sløv mus viser hip vuggende bevægelse men ikke overstiger 90 ° vinkel fra vandret på ethvert tidspunkt i løbet af 4 s af overvågning. (C) nogle FTR-Nonmobile mus vil udvide deres ben, bøjning på knæ, men vil vise meget lille (mindre end 10 ° vinkler) til nul hofte vuggende bevægelse, og benene vil forblive parallelt med hinanden. (D) dyrs adfærd 12-21 h postchallenge viser, at kun FTR-Nonmobile adfærd separate overlevende fra nonsurvivors. (E) fra 21 til 48 h postchallenge, kun 4 ud af 592 observerede FTR adfærd (0,67%) tilhører overlevende, giver mulighed for den oprettende refleks at forudsige det endelige resultat og bruges som en ny criterium for human slutpunkt. (F) ud over 48 h efter infektion, 6 ud af 131 mus (4.55%), der havde en oprettende refleks endte med at blive en del af gruppen FTR og blev ofret ved udgangen af eksperimentet, begrunder vedvarende overvågning i hele forløbet af recovery. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Instruktions ressourcer resultere i nøjagtig adfærdsmæssige klassificering af uafhængige eksperimentatorer. Eksperimentatorer uddannet ved at se video ledsager denne protokol kategoriseret videoer af 60 neonatal mus i forskellige sundhedsmæssige grupper. (A) evne til at skelne en human slutpunkt blev fastlagt og 97% af adfærd i gennemsnit var præcist kategoriseret som FTR-Nonmobile eller ej, mens kun 1% af FTR-Nonmobile mus var fejlidentificerede. To procent af musene var fejlagtigt identificeret som FTR-Nonmobile. (B) identifikation af anden Human slutpunktet criterium korrekt skelne mellem FTR mus eller dem, der har evnen til at rette inden 4 s for at blive placeret på ryggen var tildelt korrekt i 97% af partiturer, mens kun 0,96% af musene var fejlagtigt tildelt som oprettende selv og 2% af mus blev fejlagtigt tildelt som FTR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sygdom Stage | A: høj sygelighed, ingen dødelighed | B: høj sygelighed, lav dødelighed | C: høj sygelighed, høj dødelighed | D: lav sygelighed, lav dødelighed |
| Timer sende udfordring | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Overvågning frekvens | 2 h post udfordring | hver 4−6 h | Hver 4−6 Hansen, 8 h, automatiseret natten over | 1−2 gange dagligt, mere hvis det er nødvendigt |
| Andel af total Human slutpunkter observeret | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Procentdel af human slutpunkter observeret | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Human slutpunkt kriterier | 1. FTR−Nonmobile på begge sider | 1. FTR−Nonmobile på begge sider | ||
| 2. spredt fra reden og er FTR−Lethargic | 2. spredt fra reden og er FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR på både venstre eller højre side (med nogen mobilitet score) | ||||
Tabel 1: hyppigheden af overvågning og human slutpunkt kriterier i de forskellige stadier af sygdommen. Overvågning frekvens, Human slutpunkter observeret, procentdelen af human slutpunkter og human slutpunkt kriterier i forskellige stadier af sygdommen.
| Oprettende refleks | Mobilitet | Frist, lige efter at blive placeret på ryggen | Frist til foranstaltning mængde bevægelse (mobile / sløv / nonmobile) | Mobilitet scoring kriterier |
| Rettigheder | Mobiltelefon | 4 s | En yderligere 8 s | Med musen tager flere trin i en række, opretholdelse af fremdrift, og udforsker omgivelserne. Hvalpen vil ikke falde over. |
| Sløv | Musen kan tage et skridt, men stop og pause før du tager en anden. Pup kan falde over. | |||
| Nonmobile | Med musen tager ikke nogen trin efter oprettende selv. Pup kan falde over. | |||
| Ikke ret | Mobile hofter | De samme 4 s bruges til at måle oprettende refleks | Har energisk hip bevægelse med låret roterende ud over 90° fra vandret mindst én gang inden for 4 s. | |
| Sløv hofter | Hip flytning op til men ikke over 90° fra vandret. | |||
| Nonmobile hofter | Lemmer kan flytte ved udvidelse og tilbagetrækningskraften men hofterne roterer ikke. Hvalp ser meget syg. |
Tabel 2: overvågning af bordet og kriterier ved fastsættelsen af sundhed score af mus. De angivne kriterier blev anvendt til at definere sundhed artsgrupper til mus og reducere individuelle afvigelse i tildeling af sundhed scorer.
Discussion
Postnatal neonatal mus har meget begrænset mobilitet og undlader at rette sig efter at være placeret på deres ryg, selv når uantastet. Af DOL 7, alder af mus udfordret i denne model, en vifte af bevægelse spænder fra rettigheder-mobiltelefon til FTR-Mobile blev observeret i uantastet mus, med en væsentlig forskel, nemlig at en uantastet musen i denne alder ikke vise FTR-sløv adfærd. Kun mus udfordret med polymicrobial sepsis blev observeret for at blive FTR-sløv; denne reaktion kan derfor være en markør af sygdommens sværhedsgrad. Bliver opmærksomme på cutoff af en 90° vinkel fra vandret til hip bevægelse giver mulighed for den konsekvente og nøjagtige tildeling af sløv eller mobile hip bevægelse i mus. Tidsrammen på 4 s for at se, hvis en mus kan lige selv blev valgt fordi uantastet mus var i stand til konsekvent lige selv inden for denne tidsramme. Gentaget måling af samme mus blev undgået, mens tid til at rette og måling af hofte mobilitet var begrænset til 4 s, for at undgå alt for trættende med musen, som ellers kunne påvirke dens evne til at skaffe mad og varme og kunne påvirke dens Prognosen til at blive bedre. Oprettende sig fra både venstre og højre side blev observeret, og den højeste af scores, blev brugt til at bestemme, hvis musen var på en human slutpunkt, fordi nogle mus blev fundet til at vise FTR-Nonmobile på den ene side endnu har en højere mobilitet på den anden side og b e købedygtig genoprette til sidst.
Pointsystemet anvendes til at evaluere mus sundhed påberåbt sig anvendelsen af kategorisk cutoffs for hvad er et spektrum af bevægelse, og derfor kunne være tilbøjelige til individuelle bias. Sammen blev uddannet personale til at sikre, at hver person scorede mus det samme; dog vil der sandsynligvis være en grad af subjektivitet, hvilket fører til variation. Sammenhængen i scoring blev evalueret ved at have syv forskere, der ikke havde tidligere udført neonatal mus overvågning lære de krav, der er skitseret i denne protokol og video, derefter, uafhængigt tildele adfærd og bestemme Human slutpunkt. En 97% nøjagtighed blev observeret med scoring udføres på 60 udfordret mus, hvilket tyder på, at enkelte bias ikke spille en væsentlig rolle i de adfærdsmæssige tildelinger af denne model. Den præsenteres adfærdsmæssige kontrol protokol er baseret på observationer af dyr udfordret på DOL 7, men mus yngre end 6 dage i en uantastet sund tilstand konsekvent lige ikke selv. De beskrevne humane slutpunkt kriterier kunne således ikke anvendes direkte til yngre mus. Hvis yngre mus bruges i denne eksperimentelle model, eller hvis en anderledes udfordring model med forskellige sygdom kinetik anvendes, skal derefter egnet Human slutpunkt kriterier være udviklet og afprøvet for at undgå eutanasi af mus der ville ellers, i sidste ende, Genskab. Pointsystemet viser en robust metode til at forbedre Human slutpunkt klassificering, der med test og bekræftelse, potentielt kunne anvendes til andre modeller.
Hvert præparat af cecal gylle eller brug af en ny mus stamme kræves retitration af cecal gylle dosis til at administrere for at opnå en lignende dødelig dosis. Hvert præparat blev standardiseret af udlæsning af interesse, nemlig overlevelse, snarere end at give den samme bakterietallet. Hver cecal gylle forberedelse levedygtige bakteriel koncentration varieret lidt, potentielt skyldes forskelle i donorens commensal bakterier og afvigelser i vægten tilbage i cellen sien af cecal gylle stock postfiltration. Under titrering af cecal gylle, de to første kuld var opdelt i to grupper og hver halvdel af kuldet blev udfordret med en af de to doser, så at hver af doserne vil blive testet i to kuld. Hvis den resulterende overlevelsesraten ikke svarede til det krævede niveau, så udfordring dosis var enten steg eller faldt med 5% - 10% og forsøget gentages. Flere kuld blev brugt for at tage højde for kuld på kuld forskelle, der kunne forårsage modstand eller øget følsomhed over for sepsis på tværs af et kuld. Det var vigtigt at præcist titer cecal gylle bestanden med hver ny forberedelse at sikre, at den nye titrering af cecal gylle var sammenlignelige med tidligere cecal gylle præparater. Perioder af overskydende støj og vibrationer, specielt under komprimering af asfalt og opførelsen af en nærliggende bygning og vejen, blev observeret for at øge stress i dæmninger. Dette korreleret med større procentdel af cannibalization, og påvirket dødeligheden for overlevelse eksperimenter, selv påvirker uantastet mus, der angiver, at der kan være fremmed virkninger på neonatal overlevelse, som også skal kontrolleres.
Forudgående metoder for cecal gylle stock forberedelse opført brugen af friske cecal gylle eller forberedelse af frosne cecal gylle, ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder opbevaring i glycerol, der ville uundgåeligt blive overført under udfordringen. Mens brugen af friske cecal gylle giver fordelen at have en bakteriel sammensætning tættest på oprindelige cecal indhold, er der risiko for afvigelsen mellem enkelte donor mus på grund af variationen af commensal bakterier. Mens dette blev minimeret ved hjælp af cecal donorer fra samme leverandør med minimal tid mellem ankomst og progression af eksperimentet, dette kunne blive en cost-uoverkommelige mulighed for nogle laboratorier og præsenteret en anden timing logistik udfordring i at have alder-matchede mus findes når indlede en cecal gylle eksperimentere i neonatal mus, der var 7 dage gammel. En alternativ metode til at bruge friske cecal gylle var udnyttet, hvor flere voksne donorernes cecal indholdet var samlet, genopslemmes i D5W, frosne ved-80 ° C uden glycerol, og optøet en alikvot på et tidspunkt til eksperimenter. Udnyttelse af voksen donor cecal gylle at studere neonatal sepsis kunne potentielt overføre arter af bakterier til stede i cecal gylle neonatal musen ikke har været udsat for, men det er en strategi, der giver mulighed for undersøgelse af sepsis i neonatal mus og har været brugt til at studere neonatal mus biologi i de sidste13,14,15. Cecal gylle blev fortyndet i D5W at give ernæring til bakterier, som tillod oprettelsen af en aktiv infektion, når bakterierne blev sprøjtet, og blev gjort for at efterligne tilgængelighed af næringsstoffer i bughulen under nekrotiserende enterocolitis. Glycerol blev ikke medtaget som en stabilisator i frysning bakterier på grund af de potentielle negative bivirkninger, der kunne opstå fra glycerol injektion alene. Hvis glycerol havde været inkluderet i cecal gylle forberedelse, så den potentielle skade at glycerol alene kunne fremkalde ville har brug for at blive testet ved at medtage en glycerol-only (mangler cecal gylle) injektion i mus, som ville have øget mus skik. Bakterier levedygtighed cecal gylle bestande blev testet efter frysning cecal gylle lager uden glycerol og fandtes for at være konstant, med ingen ændring i bakterier koncentration i separate delprøver af den samme cecal gylle forberedelse opbevares ved-80 ° C over en 6 månedersperiode. Dette tyder på, at opbevaring uden glycerol er muligt at yde en konsekvent biologiske resultatet. Brug af en bulk-forberedt frosne cecal gylle lager også tilladt til brug af mus avlet in-house, at reducere omkostningerne og udnytte mandlige mus, der ellers ville være overskydende fra avl, derfor mus spild.
Identifikation af mislykkede udfordringer i mus var vigtigt at undgå at tilføje ekstra støj til systemet. Efter at være undergivet en intraperitoneal injektion af cecal gylle, blev musene observeret for tilstedeværelsen af en bule under huden, som angivet en mislykket injektion, der var faktisk subkutane. Mus blev observeret for utætheder på injektionsstedet, både umiddelbart efter nålen fjernelse og tillader dem at tage et skridt efter injektionen, fordi mus ville undertiden (sjældent) lække kun efter flytning lemmer af injektionsstedet ved at tage et skridt. Tilstedeværelsen af en bule eller lækage efter injektionen resulterede i at fjerne musen fra analysen. Efter alt, kunne enten af disse resultere i et andet resultat på grund af forkert mængden af cecal gylle injiceres som en 5% forskel i udfordring dosis er blevet observeret for at påvirke efterfølgende overlevelse.
Cecal gylle udfordring eksperimenter ofte kræves varierende mål dødelige doser med varierende vægt-justeret doser. På grund af dette, kan injektionsvolumener variere fra så lidt som 20 µL og op til 100 µL. Den forholdsmæssige eksperimentelle fejl forbundet med døde nål ændrer lydstyrken også sammen med Injektionsvolumen, stigende sværhedsgrad for at direkte sammenligne forskellige doser. Med en simpel ændring af standardisere Injektionsvolumen, er denne kilde af variansen fjernes fra eksperimentet.
Neonatal musen adfærdsmæssige overvågningssystem anvendes i denne protokol er først af sin art. Forskere opsat på at udføre etiske forskning med nyfødte mus er ofte konfronteret med udfordrende manglen på ressourcer til at vurdere dyrets velbefindende i denne alder. Den præsenteres intuitiv og ensartet overvågningssystem begynder at tage denne videnskløft. Vigtigst, denne beviser-driven tilgang ikke kun øger kvaliteten af eksperimentelle data opnået men, på samme tid, reducerer også de eksperimentelle dyr lidelser.
Disclosures
Dr. James Wynn modtager støtte fra National Institutes of Health (NIH) / nationale Institut for almen medicinske videnskaber (R01GM128452) og NIH /Eunice Kennedy Shriver nationale Institut for børns sundhed og menneskelige udvikling (NICHD) () R01HD089939).
Acknowledgments
Særlig tak til Claire Harrison og Animal Care anlægget på British Columbia children's Hospital Research Institute (BCCHR) for deres støtte i den animalske arbejde, samt at Dr. Po-Yan Cheng for deres vejledning og input på animalsk kontrol og velvære.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
