Summary
이 프로토콜 설정 하 고 평가 하는 신생아 패 혈 증 7-하루-오래 된 쥐에 필요한 단계를 제공 합니다.
Abstract
신생아 패 혈 증에는 글로벌 부담이 남아 있다. 전 임상 모델 화면 효과적인 예방 또는 치료 개입을 필요 합니다. 신생아 마우스 polymicrobial 패 혈 증은 생활 7 쥐의 날에 intraperitoneally cecal 슬러리를 주입 하 고 다음 주에 대 한 그들을 감시 하 여 유도 될 수 있다. 여기에 제시 하는 것은이 신생아 패 혈 증 모델의 구현에 필요한 자세한 단계입니다. 이 체중 및 쓰레기 조정 복용량, 모니터링 일정의 개요와 인간적 끝점을 정의 하는 데 사용 하는 관찰 된 건강 카테고리의 정의에 그것을 diluting 균질 cecal 슬러리 재고를 만드는 포함 됩니다. 균질 cecal 슬러리 주식 풀링된 기증자에서의 세대 시간이 지남에, 기증자, 사이의 편차를 줄이고 잠재적으로 유독한 글리세롤의 사용을 방지 많은 새끼로 관리 할 수 있습니다. 사용 되는 모니터링 전략은 생존 결과의 기대와 죽음, 자비 롭 끝점의 이전 id에 대 한 수 있도록 진행 나중 것이 쥐의 식별에 대 한 수 있습니다. 두 가지 주요 행동 기능 건강 점수, 즉, 그들의 뒤 및 이동성의 그들의 수준에 둘 때 스스로 오른쪽 신생아 쥐의 기능을 정의 하는 데 사용 됩니다. 이 기준은 적용할 수 있습니다 잠재적으로 쥐, 신생아 질병의 다른 연구에 인간적 끝점 주소에 파일럿 연구 정확도 확인 하기 위해 수행. 결론적으로,이 방법은 도전된 동물에 대 한 초기 인간적 끝점을 정의 하는 데 사용 하는 동물 복지를 평가 하기 위해 자원을 제공 하는 동안 모델 생쥐, 신생아 패 혈 증에는 표준화 된 방법의 제공 합니다.
Introduction
패 혈 증은 인간의 신생아 감염 사망자1의 주요 원인입니다. 신생아 패 혈 증을 제대로 이해 하 고, 때문에 작은 진행 위험 신생아 질병 동안 일찍 식별 및 효능 치료 또는 prophylaxes의 개발 했다. 이 프로세스 및 테스트 가능한 개입을 더 잘 이해 하는 패 혈 증의 동물 모델의 사용을 필요로 합니다. 또한, 성인 설치류는 패 혈 증, 신생아2비교 결과 호스트 응답에 차이와 같은 치 사 량 (LD)를 관리 하는 박테리아의 수에 통계적으로 유의 한 차이를 다르게 응답. 따라서, 신생아 패 혈 증 신생아에서 공부 될 수 있다. 여러 성인 패 혈 증 모델 패 혈 증 연구에 사용 되었습니다. 특정 유기 체 성인 인간의 패 혈 증 또는 cecal 결 찰과 펑크 (CLP)에 연루 된 정 맥 도전 포함 됩니다. CLP 결국 미생물과 그들의 제품3의 체계적 보급에 이어지는 어디 맹 수술 절연, 출혈, 이며, 복 막으로 장 내용의 누설 수 있도록 구멍이 생 도전 모델입니다. 그러나, CLP를 설정 하는 데 필요한 수술은 치명적인 신생아 동물; 따라서, 다른 방법 polymicrobial 도전 CLP 신생아 패 혈 증 유발을 모방 하는 데 필요한입니다. Polymicrobial 신생아 패 혈 증에 대 한 cecal 슬러리 모델에 의하여 동물의 cecal 내용을 수확, 물 (D5W)에 메 마른 포도 당 5%에 그리고 intraperitoneally 신생아 쥐2에 주입이 필요를 해결 하기 위해 개발 되었다. 이, 이후, 패 혈 증 신생아 및 성인 동물을 공부 하는 점점 인기 있는 모델 고 실질적으로 질병의 과정4,,56,7 기계적 통찰력을 전진 했다 ,8,9,10,11,12,13,,1415.
이 모델의 증가 사용 및 게시 결과 직접 비교할 연구자의 욕망을 감안할 때, 연구에서 잘 설명 하 고 표준화 하도록 기술적 측면에 대 한 필요가 있다. 표준화에 적용 모델의 세 가지 측면 즉, i) cecal 슬러리 주식, ii) 실험 동물에 주입에 대 한 도전 aliquots의 준비 및 iii) 인간적 끝점의 정의의 준비에 의하여 동물 도전 실험에서 nonsurvivors 간주 됩니다. 특히, cecal 슬러리 재고를 준비 하는 방법은 모델2를 소개 하는 원래 기사에 자주 참조 됩니다. 그 모델에 대 한 간단한 요약이입니다 성인 쥐에서 cecal 내용을 했다 수확, 80 mg/mL의 농도에 살 균 D5W에 실험 동물 주사를 2 시간 이내 사용. 이 원래 모델 cecal 내용을 수확 전에 2 주 미만 대 한 그들의 각각 연구 시설에서 지 내게 했다 동일한 공급 업체 위치에서 같은 나의 마우스를 사용. 사내 자란된 쥐를 사용 하 여 일반 공급 업체 납품 및 광범위 한 성별과 나이의 초과 마우스의 사용에 대 한 허용에서 비용을 줄이고 있지만 또한 실질적으로 기증자 기증자 가변성 증가. 이 여러 마우스에서 cecal 내용을 aliquoted 다음 되었고13-80 ° C 저장 된 큰 주식 준비 하 함께 풀링된 했다 그것에 의하여, 대체 기술의 개발 동기. 이 대체 방법은 여러 그룹14,15적응 했다. 그러나, 그 적응 결과 저장 매체 사용 (10% 또는 15% 글리세롤 또는 D5W 혼자) 및 미 립 자를 제거 하 여과의 전략에 몇 가지 기술적인 변화 (860 µ m와, 그럼, 190 µ m을 통해 다단계 여과 필터, 또는 개인 100 µ m 또는 70 µ m 필터를 통해 filtrations)13,,1415. 글리세롤 혼자의 주입 입힐 수 있는 잠재적으로, 그 25%-50% 글리세롤 주사 신장 상해16,17,,1819의 설치류 모델으로 사용 되었습니다. 20. 글리세롤의 의도 하지 않은 부작용을 피하기 위해,이 연구는 쥐에 대 한 cecal 슬러리 재고 준비에에서 얼 D5W 글리세롤, 없이 그리고-80 ° C에 저장에서 세균 생존 능력의 테스트가 수행 됩니다. 이 연구에 사용 된 여과 전략 나열 된 다른 여과 전략을 직접 비교 하지는 70 µ m 필터를 통해 패스입니다.
치명적인 무게 조정 복용량 주입된 cecal 슬러리의 시설에서 시설 다를 수 있습니다 고 개별 그룹에 대 한 원하는 치에 밖으로 titered 이어야 한다. 다른 도전 복용량과 함께 도전 볼륨 필요성에 의해 변경. 그러나,이 방법론 세부 되지 전에 보고 되었습니다. 또한, 복 주입 등의 표준 절차를 위한 전략 거의 문학, 내에 정교 하지만 개별 기술 여부 신생아 마우스 주입 했을 때 누설 하 고 그들의 최종 결과 영향을 영향을 미칠 수 있습니다.
동물 복지, 인간적 끝점의 정의 포함 하 여이 모델의 및 설치류21염증과 감염의 어떤 모형 든 지에 중앙 측면 이다. 1998 년에 캐나다 위원회 동물 케어 (CCAC)에 "어떤 실제 또는 잠재적인 고통, 고통, 또는 불편 최소화 하거나 해야 초기 선택 하 여 완화로 인간적 끝점 정의 인간적 끝점 선택에 대 한 광범위 한 지침 게시 끝점을 연구의 과학적 목표와 호환 은"22. 다른 또한 주의 자비 롭 끝점을 설정 해야 합니다 그 동물의 상태 혼자21의 주관적 해석 보다 과학적인 정당화에 기반. 그러나 거기에 다양 한 리소스에 대 한 임상, 행동, 그리고 감염 및 염증에도 인간적 끝점에 대 한 신체 조건 로그인 기반 기준 특히21,,2324, 이러한 신생아 쥐 언급 인간적 끝점22, CCAC 지침을 포함 하 여. 따라서, 객관적으로, 과학적으로 정당화 인간적 끝점은 체중 감소, 성인을 위해 일반적으로 사용 되는 같은 기준에서 그들의 제한 된 행동 기능 및 증거의 부족을 주어 신생아 동물에 대 한 설정 하기가 훨씬 더 어렵습니다. 쥐입니다. 현재, 모델2를 도입 하는 원래 원고를 다시 참조 하는 모든 cecal 슬러리 문학에서 5에 12-일 된 신생아 쥐에 대 한 사용 하는 인도적인 끝점 조건입니다. 이 원래 종이에 신생아 동물에 대 한 인간적 끝점의 정의 두 기준;에 근거 했다 즉, 둥지 (산란) 외부 마우스의 위치와 우유 명소의 부족 했다 죽음 시간 이내에 결과를 보아 왔다. 인간적 끝점을 할당 복잡 문제는 우유 명소 아픈 동물 생활 (DOL)의 14 날까지 모니터링 하는 동안, 생활의 첫 번째 주 후 일반적으로 고용된 C57BL/6J 스트레인 같은 어두운 모피와 마우스 긴장에서 볼 어려워 합니다. 또한, 죽은 동물 찾을 수 있습니다 postchallenge 이러한 기준을 적용 하는 때 (자신의 관찰; 미 출판); 따라서, 인간적 끝점의 더 엄격한 정의 실험 동물에 게 고통을 완화 하 고 어디 결과 수 정확 하 게 분별 수 이전 상황에서 사망률을 방지 하는 데 필요한.
Cecal 슬러리 모델의 모든 세 가지 방법론적 측면 cecal 슬러리의 준비 적 표준 운영 절차에 제공 됩니다, 복용량 사이 주입 볼륨 상수 계속 실험 동물에 주입 하는 방법 및 누수, 위험과 행동 모델링의 시스템에 따라 7-를 12-하루-오래 된 마우스에 대 한 인간적 끝점의 정의 줄일 수 있습니다. 마우스 건강 점수 240 실험 동물에서의 행동 정보 수집 되었고 결과별 최종 생존, 인간적 끝점의 증거 기반 정의 보여주는. 생물학적으로 중요 한 생존 결과 주요 변수를 관찰 하 여 유추 하실 수 있습니다 하는 동안 초기 가능한 시간 시점에서 죽어가는 신생아 쥐를 식별 하 여 실험 동물의 고통을 감소 된다. Cecal 슬러리 준비와 신생아 마우스 동작의 시각적 패 혈 증 또는 신생아 도전 모델 동물을 공부 하 고 어떤 그룹에 우수한 자원으로 될 것입니다.
Protocol
이 프로토콜에서 모든 실험 프로토콜 번호 A17-0110에서 브리티시 컬럼비아의 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 도구 살 균
- 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 설정 하 고 250 ° C, 사용 하기 전에 적어도 30 분을 뜨거운 비드 소독 기를 예 열 합니다.
- 70% 에탄올에 도구를 찍어.
- 최소 1 분 데워 뜨거운 비드 소독 기에 도구를 잠수함.
참고: 도구 핸들 뜨거운 얻을 것 이다 및 1.5 분 이상에 대 한 뜨거운 비드 소독 기에 남아 있는 경우 구울 수 있습니다. - 종이 타 올의 매트 그것을 소독을 70% 에탄올 스프레이.
- 다른 잠수 도구 nonsterile 핸들을 도구의 소독된 부분을 건드리지 않고 뜨거운 비드 소독 기에서 도구를 제거 하 고 에탄올 살포 종이 타월에 넣어.
- 30에 대 한 대기를 해 부에 대 한 그들을 사용 하기 전에 도구에 대 일 분 s.
2. cecal 슬러리 준비
- 15 mL 원심 분리기 튜브 (모든 5 마우스를 안락사 되 고 1 개의 관) preweigh
- 현지 동물 보호 지침에 따라 cecal 슬러리 기증자를 안락사 하거나 아래 프로토콜을 사용 합니다.
참고: 6과 12 주 사이 40 C57BL/6J 마우스까지 오래 사용 되었다 cecal 슬러리 준비를 위해 최대 5 개의 마우스를 한 번에 안락사 되 고.- 안락사 약 실에 쥐를 전송 고 5% 산소 관류와 isoflurane 마 취 기계를 설정 합니다.
- 이동 하 고 마 취의 수술 평면 입력 그들을 보고 능력의 감소를 관찰 하 고 마지막으로 호흡을 중지 하려면 마우스를 모니터링 합니다.
- 안락사 상공에서 마우스를 제거 하 고 그것의 발을 꼬집어 다리 철회 또는 흡입 관찰. 중 경우 돌아가기 마우스 안락사 챔버; 그렇지 않으면, 계속.
- 날카로운 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사 말기.
- 맹 해 부, BSC에 presterilized 및 냉각 도구 (섹션 1을 참조)을 사용 하 여 수행 합니다.
- 마우스는 마우스의 복 부 23 G 바늘을 사용 하 여 압출된 발포 폴리스 티 렌 보드를의 다리를 고정 합니다. 보안 및 다음 70% 에탄올과 복 부를 스프레이.
- 소독 집게와가 위를 사용, 피부를 통해 잘라, 위와 컷된 오픈을 흉 골, 사 타 구니에서 사각형 영역으로 복 막 안 대기 및 왼쪽에서 오른쪽에 피부를 풉니다. 복 막에서 어떤 모피를 제거 합니다.
- 살 균 도구 전환 도구 연락처 사용 하는 경우 피부는 피부에 대해 수행 된 직사각형 개통을 만드는 복 통과를 한 켤레로 전환.
- 실행 해야 왼쪽 오른쪽 몸 전체 맹을 식별 합니다. 창 자에서 맹 분기를 식별 하는 창 자에서 맹 자를 결합 조직 방해. 맹 종이 무게의 멸 균된 시트에 놓습니다.
참고: 종이 무게 수 수 살 균 하거나 양쪽과 두면 건조,에 70% 에탄올을 분사 하 여 UV 방사선. 또는, 맹 멸 균 페 트리 접시에 해 부 될 수 있다.
- Cecal 콘텐츠 압출
- BSC, 살 균 도구 사용 하 여 맹의 두 끝을 통해 잘라.
- 소독 집게와 맹의 중간을 누른 부드럽게 밀어 컷 중 cecal 내용을 종료, 롤링 모션 및 상피를 찢 어 수 근 근이 살아가고 모션 피하 사용 하 여 평면 살 균 금속 주걱을 사용 합니다. 내용을 수집 하 고 preweighed 15 mL 원심 분리기 튜브에 넣어.
- 같은 관으로 최대 5 쥐에서에서 cecal 내용을 풀. 모든 내용이 추가 된 후 다시 튜브 무게.
참고: 300 밀리 그램의 평균을 기대 하 고 최대 1.8 2.4 mL D5W 마우스; 당 물의 resuspension 요구 마우스 당 cecal 슬러리의 390 밀리 그램, 따라서,이 단계 5 개 이상의 마우스를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브 overfilling에 발생할 수 있습니다. - 에탄올을 뿌려 서 종이 타월로 청소 도구를 닦 고 단계 1.2-1.6을 반복 하 여 그들을 resterilize.
- Cecal 슬러리 여과
- Cecal 내용으로 가득 원심 분리기 튜브 무게 하 고 원하는 재고 농도 아래 방정식에서 밀리 리터 당 밀리 그램에 의해 cecal 내용의 무게를 나누어 cecal 내용에 추가할 D5W의 양을 계산.
- BSC에서 cecal 내용을 포함 하는 15 mL 원심 분리기 튜브를 얼음 처럼 차가운 D5W의 필요한 금액을 추가 합니다.
- 소용돌이 15 mL 튜브 수직과 수평의 직경, 1-3 m m 이상의 미 립 자에 대 한 30 s. 검사 원심 그리고 있으면, 계속 vortexing까지 모든 큰 입자는 눈에 띄게 사라졌다.
- 얼음에 50 mL 원심 분리기 튜브로 살 균 70 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 셀 스 트레이너로 그리고, 컬렉션 튜브 resuspended cecal 슬러리의 4 mL를 플라스틱. 2 x-3 x 위아래로 pipetting으로 미 립 자 resuspend. 부드럽게 속도를 높이려면 필터링 필터링 없음 더 많은 방울까지 내용을 피 펫 팁을 교 반 하면서 거품을 압출 성형.
참고: 때, 있을 수 있습니다 미 립 자 5 mL 피 펫을 연결 하기에 충분. 이 경우에, 단계의 2.5.3, vortexing를 반복 하 고 솔루션 여전히 휴식 하지 않습니다 떨어져를 사용 하 여 피펫으로 원심 분리기 튜브의 벽에 입자를 누릅니다. - 단계를 반복 2.5.4, cecal 슬러리의 각 튜브와 수영장 사이 세포 멤브레인 변경 모든 내용을 동일한 50 mL 원심 분리기 컬렉션 튜브, 얼음에 보관 또는 두 번째 50 mL 원심 분리기 튜브는 filtrate의 볼륨 얼음 상자에 얼음 수준을 초과 하는 경우.
- Cecal 내용으로 가득 원심 분리기 튜브 무게 하 고 원하는 재고 농도 아래 방정식에서 밀리 리터 당 밀리 그램에 의해 cecal 내용의 무게를 나누어 cecal 내용에 추가할 D5W의 양을 계산.
- 약 수 cecal 슬러리입니다.
- 해당 되는 경우 더 큰 살 균 컨테이너 (예: 1000 mL 보관 병)으로 단계 2.5.5에서에서 여러 50 mL cecal 슬러리 filtrate 관 결합. 15 s와 장소 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브로 20 mL에 대 한 다음, 소용돌이.
- 5-10 s, 그리고 시간이 지남에 증발을 방지 하는 고무 물개는 3 2 mL 극저온 튜브에 aliquot 500 µ L의 50 mL 원심 분리기 튜브에 cecal 슬러리 주식 소용돌이. 즉시 얼음에 마스터 주식과 aliquoted 극저온 유리병을 놓습니다.
- 때까지 cecal 슬러리의 모든 aliquoted, 2.6.1과 2.6.2 단계 반복 vortexing 모든 3 극저온 튜브 어떤 입자의 침전을 방지 하 고 균질 혼합물을 유지 후 마스터 주식.
- -80 ° c.에 cecal 슬러리 aliquots를 고정
참고: 각 성인 마우스에서 500 µ L에서 3 ~ 4 주가 튜브 사이 기대 합니다. 각 재고 유리병 돌 7에서 8 마우스의 도전 한 담가를 대략 충분히 해야 합니다.
3. 패 혈 증 7 일 된 신생아 쥐의 도전
- 분리, 식별, 그리고 신생아 마우스 무게.
- BSC에 새로운 감 금 소는 댐에서 생쥐를 유지 하 고 스트레스를 줄이기 위해을 신생아 쥐 전송.
- 제거 하 고 장갑에 감 금 소의 냄새를 전송 하는 장갑과 둥지 재료의 일부를 문 지 르 세요. 그리고 작은 둥지에 둥지 재료를 금형 댐 없이 새 감 금 소에 배치 합니다.
- 신생아 쥐 새 장에 중첩 자료 전송.
- 새 장에 두 번째, 빈 둥지를 만들기 위해 더 많은 중첩 자료 전송.
- 닫고 댐 신생아 쥐의 조 난의 청문회에서 강조 하지 후드에서 댐의 케이지를 제거 합니다.
- 시간이 지남에 쓰레기 내 개별 신생아 쥐를 추적, 앞 또는 필요에 따라 모든 12 24 h를 다시 적용 하는 꼬리의 반전에 1-5 점 표시는 에탄올 증거 지정을 사용 합니다.
- 도전 될 것 이다, 무게, 후 중첩 보조에 각각을 배치 하 고 모든 마우스에 대 한 반복이 각 마우스 무게.
- Aliquot cecal 슬러리 도전 준비 하기 전에 전체 쓰레기를 반환 합니다.
- 별도로 각 담가 대해이 단계를 완료, 다음 계산을 사용 하 여 또는 제공 된 워크시트를 사용 하 여 cecal 슬러리 D5W로 필요한 희석의 개별 무게 조정 복용량을 계산 ( 보조 파일참조).
- 마우스 (c)의 그램 당 cecal 슬러리의 밀리 그램에서 원하는 도전 복용량에 의해 cecal 슬러리의 (한) 그램 (b)에 마우스의 무게를 곱하여 각 마우스에 게 투여 밀리 그램을 계산 합니다.
- 주식 cecal 슬러리 농도, cecal 슬러리의 160 mg microliters (d)에 마우스 마우스 단계 3.2.1 (a)에서 당 필요한 cecal 슬러리의 밀리 그램을 분할 하 여 필요한 undiluted cecal 슬러리 주식의 개별 볼륨 계산 밀리 D5W의 당 (e), 고 microliters 밀리 리터에서 변환할 밀리 리터 당 1000 µ L을 곱한.
- 평균 cecal 슬러리의 스톡 볼륨 n 쥐, 생쥐 (n)의 수로 나눈의 담가에서 마우스 당 cecal 슬러리 주식 (d)의 볼륨을 요약 하 여 마우스 (g) 당 필요한.
- 마우스 (g) 당 필요한 cecal 슬러리의 평균 재고량에 의해 평균 주입 볼륨 (100 µ L)으로 나누어 cecal 슬러리 주식 (h)에 대 한 평균 희석 비율을 계산 합니다.
- 각 마우스의 특정 주입 볼륨 microliters (j)에서 평균 희석 요인 (h), 각 마우스의 양의 재고 cecal 슬러리 필요 (d)를 곱하여 계산 하 고 다음 가장 가까운 10 반올림 (일치 하는 10 µ L 씩 주사 주사기의).
- 평균 주입 볼륨 (100 µ L)에서 평균 cecal 슬러리 주식 (g)를 빼서 D5W 희석 cecal 슬러리 주식 (k)의 평균 필요한 볼륨을 계산 합니다.
- 이 쓰레기 (n)에 쥐의 숫자로 microliters (g)에 마우스 당 평균 재고 cecal 슬러리를 증식 하 고 여분의 만들려고 1.4 곱한 여 microliters (l)에서 cecal 슬러리 재고의 총 금액을 계산 합니다.
- Microliters (m) 평균 필요한 양의 D5W로 cecal 슬러리 주식 희석 하는 데 필요한 D5W의 총 금액을 계산 (k) 마우스 (n)와 여분의 만들려고 1.4를 곱한 수로.
- 마우스 (c)의 그램 당 cecal 슬러리의 밀리 그램에서 원하는 도전 복용량에 의해 cecal 슬러리의 (한) 그램 (b)에 마우스의 무게를 곱하여 각 마우스에 게 투여 밀리 그램을 계산 합니다.
- 재고 cecal 슬러리 필요한 (l 단계의 3.2.7)의 양을 계산 후 도전 약 수를 준비 합니다. BSC, 실내 온도에, 혼합 내용을 pipetting cecal 슬러리 재고 튜브의 필요한 수를 녹여.
- 더 이상 볼 수 있을 때 얼음 결정 해 동된 cecal 슬러리에, 메 마른 1.8 mL microcentrifuge 튜브를 cecal 슬러리 주식 (3.2.7 단계에서l )의 계산된 금액을 전송 합니다.
- 3.2.8 (m) 단계에서 계산한 차가운 D5W를 추가 하 여 필요한 농도를 희석. 얼음에 도전 약 수를 저장 합니다.
- 그것을 터치 하 여 microcentrifuge 튜브 주사기를 로드 하기 전에 혼합 다음 그리기 및 500 cc 28 G ½ 인치 인슐린 주사기 cecal 슬러리의 300-500 µ L를 추방의 3 x 20 x.
- 같은 주사기에 희석된 cecal 슬러리의 대략 150 µ L를 그립니다.
- 플런저에서 거품을 꺼내, 다시 약간에 주사기, 그리고 다음 거품을 추방에 주사기를 터치 합니다.
- 분배 초과 cecal 슬러리 microcentrifuge 튜브에 다시 한 마우스에 대 한 cecal 슬러리의 정확한 금액까지 단계 3.2.5 (j)에서 개별 마우스 주사기에 로드 된에 대 한 계산 이었다.
- Intraperitoneally 관련 현지 동물 보호 기관 지침에 따라 cecal 슬러리를 주입 하거나 아래에 설명 된 단계를 사용 합니다.
- 3.1 단계에서 설명한 대로, BSC에 댐에서 신생아 쥐를 구분 합니다.
- 아저씨는 목의 뒤쪽으로 마우스 엄지 및 집게 손가락을 사용 하 여.
- 중, 반지 손가락, 또는 반지와 pinky 손가락의 앞 뒷면에 걸쳐 마우스의 꼬리를 보호 합니다.
- 누수를 최소화 하기 위해 신생아 마우스를 아래로 얼굴 기울기 하 고 다리와 성 기, 바늘 얕은 피하 유지 사이 향하도록 바늘의 바늘 경사를 삽입 합니다.
- 넣으면 바늘은 1 cm, 아래쪽으로 누르고 바늘 찔린 복 느낌을 전달 합니다. 서서히 우울 플런저, 유지는 바늘의 팁 가능한, 안정 측면 움직임 마우스의 장기 손상 될 수 있습니다.
- 신중 하 게 바늘에 철회로, 가운데 손가락을 편안 하 게 마우스의 시체에서 긴장을 줄이기 위해 제거 하는 동안 밖으로 동일한 경로 따라 5-10 s.
- 누수를 확인 하려면 마우스를 닫습니다, 사출 사이트에 대 한 시간을 허용 하는 바늘의 제거 후 몇 초 동안 누른 어떤 누설 또는 사출 사이트에서 어느 지점에 마우스 사용 하지 않아야 분석에 불 룩 한 관찰.
참고: 주사 사이트에서 피부의 불 룩 피하 되 고 injectant와 실패 한 복 주입을 나타냅니다. - 종이 타월에 마우스를 놓고 마우스 단계를 허용 합니다. 마우스 5 모바일 없으면 s, 다음 꼬리를 가볍게 누릅니다.
- 마우스를 선택 하 고 주사 사이트에서 cecal 슬러리의 어떤 누설에 대 한 확인. 누설이 있는 경우에, 분석에서 마우스를 제외 하 고는 마우스를 안락사.
4입니다. 마우스 모니터링
- 마우스 인간적 끝점에 도착 한 그들을 검사를 정기적으로 모니터링 합니다.
- 쥐 2 h postchallenge 주입 관련 합병증에 대 한 관찰.
- 패 혈 증 관련 사망률 및 자비 롭 끝점에서 마우스의 식별에 대 한 마우스 12 h postchallenge 모니터링 (참조 기준 4.2-4.3 단계).
- 그 후 처음 2 일, 하룻밤에 8 h 제외 때 신생아 마우스는 참석에 대 한 모든 4-6 h를 모니터링 합니다.
- 2 일 postchallenge 넘어 하루 1 x-2 x를 모니터링 합니다. 만약 아픈 쥐 또는 쥐의 건강 점수 감소 관찰 된다, 모든 4-6 h 모니터링 주파수를 증가 다음.
- 신생아 쥐 모니터링
- 3.1 단계에서 설명한 대로 전송 새 케이지를 소재 침구를 신생아 쥐를 포함 하는 모든 프로시저에 대 한 (같은 이유 언급 거기). 신중 하 게 간호 하는 동안 둥지에서 끈 모든 신생아에 대 한 확인 합니다. 간호 하는 동안 쓰레기에서 끈 어떤 쥐 쥐 흩어져 있을 하지 고려 되어야 한다.
- 상단의 제거 둥지, 신생아 쥐의 어떤 산란 둥지에서 중 식별 또는 중첩 물자에서 하지만 간호 하는 동안 쓰레기에서 드래그 하는 마우스를 제외 하 고 그들의 littermates에서 붙어. 4.5 단계에서 기준 마우스 발견 되 면 흩어져 인간적 끝점을 참조 하십시오.
- 쥐의 righting 반사와 이동성을 측정 합니다.
- 종이 타월에 그것의 뒤에 마우스 놓고 오른쪽 자체으로 4의 최대 능력에 대 한 모니터링 s. 그것의 뒤에 배치 하는, 마우스를 왼쪽 이나 오른쪽, 4 s 카운트 시작 때 떨어질 것 이다.
참고: "권리" 그룹으로 분류 될, 마우스 수 있어야 합니다 적어도 3 4 패드 1 종이 타월에 발 s. 그것은 여전히 떨어지면 자체 오른쪽 수로 그룹화 됩니다.- 마우스 자체 마우스 오른쪽 수 있습니다, 만약 기다립니다 8 이동성의 그것의 수준을 결정 하는 s.
- 그것 자체 오른쪽 수 고 한 행에서 여러 단계를 복용 하 여 그것의 환경을 탐험 하는 경우에 "권리-모바일"로 마우스를 분류 합니다.
- 그것 자체 오른쪽 수 고의 환경을 탐구 하는 몇 가지 단계 "권리 기 면"로 마우스를 분류 합니다. 이 그룹에 있는 마우스 수 있습니다 단계를 복용 하는 동안가, 그들의 발에 흔들리는 모양과 단계 사이의 일시 중지.
- 자체 오른쪽 수 있지만 많이 움직이지 않는 마우스 "권리-Nonmobile"로 분류 합니다. 그것은 아직도,가 수 있습니다 8 내 어떤 조치를 취할 하지 않습니다 경우 s, 권리-Nonmobile로 그룹화 됩니다.
- 마우스 자체를 바로 하지 수, 경우 다음 관찰된 엉덩이 움직임에 따라 그것의 기동성을 분류할 수 있습니다.
참고: 모니터링을 반복 하지 않도록 하거나 마우스는 채 점 시스템 및 자비 롭이 영향을 미칠 수 있기 때문에 그들의 뒤에 소비 하는 시간의 길이 증가, 마우스 오른쪽으로 자체 4 s 수에 내에서 때로는 실패 그렇게 할 더 많은 시간이 주어진 경우.- 분류로 마우스 "오른쪽 (FTR) 실패-모바일" 그것은 자체 오른쪽 수 고 수평에서 90도 각도 초과 하는 엉덩이 운동 표시 됩니다. 일부 마우스 수 있습니다 마우스 오른쪽 스스로 경우 이상 4 s 엉덩이 움직임에 따라 이동성 점수 FTR로 아직도 분류 될만.
- 그것 자체 오른쪽 수 고 수평 90 ° 각도 아래 엉덩이 운동 표시 마우스 "FTR 기 면"으로 분류 합니다.
- "FTR-Nonmobile" 그것은 자체 오른쪽 수 있고 다리를 흔들거나 진동 하는 경우 하지만 엉덩이 운동으로 마우스를 분류할 수 있습니다. 사지 연장 수 있습니다 또는 철회만 할 수 없는 측면 운동. 마우스 눈 병 이며 인간적 끝점에 도달 했습니다.
- 종이 타월에 그것의 뒤에 마우스 놓고 오른쪽 자체으로 4의 최대 능력에 대 한 모니터링 s. 그것의 뒤에 배치 하는, 마우스를 왼쪽 이나 오른쪽, 4 s 카운트 시작 때 떨어질 것 이다.
- 4.3 기록 양쪽 모두 마우스의 반대편에 단계를 반복 합니다.
주: 관측 기록에 대 한 추가 파일 을 참조 하십시오. - 마우스 인간적 끝점에는 아래 표 1에 설명 된 대로 안락사 필요 있는지 확인 합니다.
- 다른 righting에 쥐를 분류 하 고 이동성 레벨 단계 4.3 및 4.4에 모니터링 관측에 따라. 마우스의 이동성은 각 측면에 대 한 측정 그리고 모바일 행동 마우스 안락사 필요한 지 여부를 결정 하기 위해 사용 됩니다.
- 인간적 끝점에 둥지에서 분리 어떤 생쥐를 righting FTR-Nonmobile (a) 또는 (b) FTR 기 면의 반사 및 발견에 할당 합니다.
- 20 h postchallenge 넘어 시간 포인트 모니터링, 분류 인간적 끝점에서 것으로 양쪽에 "오른쪽 실패"의 righting 반사와 어떤 마우스 표시 데이터가이 쥐 결국 질병에 굴복을 하지 않는 높은 정확도로 예측 하기 때문에 복구할 수 있습니다.
- 4.5 단계에서 결정 된 대로 안락사 될 수 있는 별도 마우스 모니터 마우스 인간적 끝점에서 나타나지 않습니다 경우 댐 없이 새로운 장에 두 번째 빈 둥지에 그것을 배치 하 고 다른 신생아 쥐 계속 합니다.
- 일단 전체 쓰레기 모니터링 되 고, 댐, 신생아 쥐에 대 한 중간에 공간이 둥지 개혁으로 중첩 물자의 절반을 이동 합니다.
참고: 잘못 된 형식의 둥지 흩어 댐 제공할 수 있는 사용 가능한 치료의 양을 줄일 하 마우스를 발생할 수 있습니다. - 신생아 쥐 댐 케이지로 다시 전송 합니다.
- 쓰레기를 통해 남은 중첩 물자 부드럽게 장소에 중첩 물자를 확보 하기 위해 뚜껑 주위 곤란으로 둥지에 쓰레기를 묶습니다.
- 지역 기관 요구에 따라 4.6 단계에서 구분 된 신생아 쥐 안락사
5입니다. cecal 슬러리의 적정
- 원하는 도전 복용량 (섹션 3)에 쥐를 도전 하 고 모니터링 결과 (제 4).
- 최종 결과에서 원하는 LD 결과 여부를 관찰 하 고 아니라면, 반복 섹션 3, 4는 더 높은 또는 낮은 도전 복용량에, 그것에 게 5%-10%로 조정 새로운 쓰레기.
참고: 도전 복용량 그림 1b 유사 하지만 각 시설 및 쥐의 긴장에 titered 있어야 수 있습니다. - 또한, 쥐 빠르거나 그림 1B, 예상된 속도 보다 느리게 인간적 끝점을 달성 하 고이 섹션 3, 4는 더 높은 또는 낮은 도전 복용량에, 그것에 게 5%-10%로 조정 새로운 쓰레기와 반복 여부 관찰.
Representative Results
Cecal 슬러리 생존-80 ° C에 저장 시간이 지남에 직렬 diluting 및 도금 aliquots cecal 슬러리 주식의 5% 양 혈액 tryptic 간장 한 37 ° c.에 에어로빅 외피의 24 시간 뒤에 시험 될 수 있다 Culturable 콜로 니 형성 단위 (CFU) 콘텐츠 cecal 슬러리 준비의 계산 발견 하지 6 개월 기간 동안, 변경 및 생존 능력은 영향을 받지 않습니다-80 ° C (그림 2)에서 장기간된 보관 이어서이 일어난 각 기증자 마우스 결과, 평균, 충분 한 cecal 슬러리 도전 3 ~ 4 새끼 (데이터 표시 되지 않음).
Polymicrobial 패 혈 증을 유도 하 cecal 슬러리 돌 7에 도전 하는 쥐의 도전, 12 h 이내 인간적 끝점에 도달 하기 시작 했다 및 polymicrobial 패 혈 증은 주로 확인 48 h postchallenge에서 결합 하는 카 플 란-마이어 생존 곡선 관찰 (그림 1A)의 도전된 쥐 200 개 이상의 데이터입니다. 치 사 율은 도전 복용량 인 5% 변화 관리 도전 복용량에 의존 한 생존 율 (그림 1B)에 약 15% 차이. 마우스 몸 무게는 각 모니터링 방문에서 측정 했다. 체중 감소는 살아남은 결국 쥐와 않았다 하지 초기 24 시간 동안 postchallenge (그림 1C) 그 사이 차별적 되 고 모든 도전된 동물에서 보였다. 24 시간 후 가장 살아남은 동물 모든 nonsurvivors 체중을 계속 하 고 그들의 인간적 끝점으로 이동 하는 동안 그들의 체중을 회복 하기 시작 했다. 그러나, 작은 동물을 자신의 righting 반사는 또한 체중을 계속 유지 또는 실험, 도전 40 h 이내 초기 체중의 20% 정도 잃고 심지어 말까지 체중을 실패 했다 생존의 비율은. 살아남은 결국 쥐와 하지 않은 체중 감소의 오버랩 되면서 체중 또는 체중 감량의 임계값 변경 사용할 수 없습니다 조건으로 인간적 끝점에 대 한 유지 하면서도 정확 하 게 나누어 생존자의 목표 nonsurvivors에서.
프로토콜에는 표 2에 설명 된 대로 마우스의 동작 모니터링 했다. 스냅샷 카테고리는 건강의 표시 (그림 3A-C). 이 사진 보여 쥐의 다른 건강 카테고리 누가 그들의 뒤에 배치 되 고 이후 자신을 바로 개요 FTR-모바일과 FTR 기 면의 차이 중요 한 구별 하지 못했습니다. 이 시대의 당된 건강 한 쥐 FTR 기 면 활동을 표시 하지 않습니다. 따라서,이 건강 카테고리 질병 및 도전 하 응답의 표식입니다. 아픈 마우스 FTR 기면증 증상 (그림 3B)를 표시 하 고 FTR-Nonmobile (그림 3C), 위쪽 다리 아래쪽 다리와 평행 하 게 남아 있는, 향해 복귀 수 거의 0 엉덩이 운동, 락 중 하나입니다에 대 한 기준 자비 롭 끝점입니다. 쥐 수 있습니다 또한 복구 증가 엉덩이 움직임을 얻고 고 FTR-모바일 (그림 3A). Righting 반사 및 이동성 점수 왼쪽 및 오른쪽 각 마우스의 결정 그리고 높은 점수 마우스 인간적 끝점에 도달 했다 여부를 결정 하기 위해 이용 되었다. Cecal 슬러리의 치명적인 복용량 60 (LD60) 도전 240 동물에서 행동 정보 수집 하 고 (그림 3D-F 및 표 1) 144 인간적 끝점 관찰 했다. 이 증거 기반 접근 정의 하 고 생존자와 nonsurvivors 사이 두 행동 차이에 따라 경험에 의해 고 인간적 끝점에 도달의 분수에 의해 분류 된 4 개의 질병 단계에 걸쳐 자비 롭 끝점을 수정 하는 데 사용 했다 동안 각 시간 프레임. 초기 실험을, 동안 엉덩이 운동 했다 FTR Nonmobile 쥐 일관 되 게 관찰 되 고이 동작의 4-6 h 이내 죽은 발견 됐다. 제시 정보의 수집, FTR Nonmobile 건강 점수는 인간적 끝점에 대 한 기준으로 사용 되었다. 12 월 21 일 h postchallenge에서 FTR Nonmobile 마우스 안락사 했다 하는 동안 살아남은 및 nonsurviving 동물 표시 매우 비슷한 행동 패턴 고 다른 방법으로 (그림 3D) 고유 수 없습니다. 21-48 h postchallenge에서 마우스를 살아 나 기의 대부분을 자신의 righting 반사 회복, FTR 행동 관찰의 1% 미만에 갈 것 이라고 동물에 동안 생존 실험 (3E 그림). 따라서, 양쪽 모두에서 자신을 바로 하지 못한 쥐가이 시간 동안 인간적 끝점에 대 한 추가 조건을 되었다. 12 및 20 h postchallenge, 사이 인간적 끝점의 총 수의 12.5% 관찰 되었다, 20과 48 h, 사이 80.5%와 7% 대 후 48 h (표 1). 쥐 사이 구별 기능을 살아남은 결국 하 고 결국 인간적 끝점에 악화 righting 반사, 엉덩이 이동성 (그림 3 층)의 독립의 손실 했다. 사실, 도전 후 20, 48 h, 사이 총 121 쥐 결국 인간적 끝점 (복구 하지 것이 마우스를 식별에 96%의 정확도 나타내는)에 진행이 쥐의 116와 자신 양쪽 모두에서 마우스 오른쪽을 실패 했다. 도전 후 48 h, 넘어 인간적 끝점 (91% 정확도)에 자신을 측면, 그리고 이러한 진행의 10에서 오른쪽 실패 11 마우스 관찰 되었다. 도전 후 20 h, 넘어 양쪽 righting 반사 손실 된 쥐의 수 예측 정확도 90% 이상; 최종 결과 따라서,이 이전 nonrecovering 마우스를 식별 하 여 마우스 (표 1) 고통을 줄일 인간적 끝점 기준에 추가 되었습니다.
쥐 모니터링 필요 주파수의 죽음 postchallenge, 다른 속도로 인해 시간이 지남에 따라 변경 하 고 표 1에 설명 되어. 마우스 자체 오른쪽 실패 했다 언제 든 지 그것의 인간적 끝점에서 것 여겨졌다 비모바일 엉덩이 운동 양쪽 모두 표시 마우스는 둥지에서 흩어져 발견 하는 경우 또는 자체, 오른쪽 하지 못했습니다 그리고 기 면 엉덩이 운동을 했다. 이러한 조건 중 하나에 있는 쥐 하지 쓰레기를 다시 도전 후 4-6 h. 시작 20 h 내 FTR-Nonmobile 수를 관찰 되었습니다 수 있을 것으로 예상 했다, 새로운 인간적 끝점 추가 되었습니다 제시 정보를 표시 하는 광대 한 때문에 양쪽에서 FTR 질병에 굴복 당했던 결국 쥐의 대부분.
비디오, 테이블, 및 리소스가이 원고에 도전된 쥐의 올바른 행동 지정을 위한 효과적인 교육 리소스를 있습니다. 7 경험 훈련 비디오를 감상 하 고 60 도전 동물 동작을 할당 하기 전에 프로토콜 및 테이블을 읽기를 요청 했다. 인간적 끝점 지정의 식별은 모두 다른 동작 (그림 4A) 표시는 마우스에서 구별 FTR Nonmobile 마우스 및 허용 기간 (내 자신을 바로 수 있었다 쥐에서 FTR 생쥐에 대 한 정확한 그림 4B)입니다.
그림 1 : 카 플 란-마이어 생존, cecal 슬러리 복용량 적정 곡선과 무게 변화 cecal 슬러리 도전 다음. (A) 돌 7 복 cecal 슬러리 분사와 함께 도전 하는 신생아 C57BL/6J 쥐의 생존 결과. 이 그림에 대 한 데이터는 여러 도전 복용량, 0.7에서 1.3 밀리 그램 그램 체중 당 cecal 슬러리에 이르기까지 이러한 마우스에 투여를 사용 하 여 독립적인 실험에서 결합 했다. (B) 신생아 쥐 한 cecal 슬러리 준비에서 0.80에서 0.95 밀리 그램 그램 체중 당 cecal 슬러리의 도전 주어진 cecal 슬러리의 양과 생존의 비율 사이 복용량 의존 관계를 표시 합니다. (C) 도전의 시간에서 체중의 20% 감소를 나타내는 점선으로 도전 무게에 비해 무게에 있는 변화의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 :-80 ° C에 저장 하는 cecal 슬러리 재고 CFU 농도 6 개월 기간 동안 변경 되지 않습니다. CFU 농도에 cecal 슬러리 나이의 효과 선형 회귀를 사용 하 여 테스트 했습니다. 각 포인트는 같은 cecal 슬러리 준비, 순차적으로 희석 하 고 6 개월 동안 도금의 한 약 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 이동성 종류 스스로 오른쪽에 실패 하는 쥐의 및 postchallenge 시간 다양 한에서 동물성 행동의 엉덩이. 그들의 뒤에 배치 하면 패 혈 증과 도전을 받고 있다 쥐 엉덩이 움직임의 정도 의해 측정 될 수 있는 병의 징후를 표시 됩니다. 오른쪽 (FTR) (A) A 실패-모바일 마우스 수평에서 90도 각도 초과 하는 그들의 위 다리의 엉덩이 흔드는 움직임을 보여줍니다. (B)는 FTR-기 면 마우스 쇼 엉덩이 운동 락 하지만 가로 4 기간 동안 어떤 시점에서 90도 각도 초과 하지 않는 모니터링의 s. (C) 일부 FTR-Nonmobile 마우스는 무릎에 구 부리는 그들의 다리를 확장할 것입니다 하지만 운동과 다리 락 0 엉덩이에 아주 작은 (미만 10 ° 각도) 표시 됩니다 서로 평행 하 게 유지 됩니다. (D) 동물 행동 12 월 21 일 h postchallenge 쇼 FTR Nonmobile 행동만 nonsurvivors에서 생존자를 분리 합니다. (E)에서 48 h postchallenge 21, 592 관찰된 FTR 동작 (0.67%)으로 4만 생존자는 righting 허용에 속하는 최종 결과 예측 하 고 자비 롭 끝점에 대 한 새로운 표준으로 사용 하는 반사. (F) 넘어 48 h 바람직합니다, 6 중 131 쥐 (4.55%)을 righting 반사 FTR 그룹의 일부가 될에 갔다 고 복구의 과정을 통해 지속적인 모니터링을 정당화 하는 실험의 끝에 의해 희생 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 교육 리소스 독립적인 경험에 의해 정확한 행동 분류에 결과. 이 프로토콜을 동반 하는 비디오를 보면서 훈련 경험 다른 건강 그룹으로 60 신생아 쥐의 동영상 분류. (A) 인간적 끝점을 구별 하는 기능을 결정 했다 고 동작의 97%의 평균 정확 하 게 분류 되었다 FTR-Nonmobile로, FTR Nonmobile 쥐의 1%만 오인 했다 하는 동안. 쥐의 2% 거짓 FTR-Nonmobile로 확인 되었다. 올바르게 FTR 쥐 또는 그 능력 4 내 자신을 바로 하는 것 사이의 구별의 (B) 두 번째 인간적 끝점의 식별 표준 그들의 뒤에 배치 되 고의 s scorings, 동안 유일한의 97%에서 올바르게 할당 된 쥐의 0.96% 스스로 righting로 올바르게 할당 되었다 고 쥐의 2 %FTR 올바르게 할당 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 질병 단계 | A: 높은 사망률, 아니 사망률 | B: 높은 사망률, 낮은 사망률 | C: 높은 사망률, 높은 사망률 | D: 낮은 병 적 상태, 낮은 사망률 |
| 시간 게시 도전 | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| 주파수를 모니터링 | 2 h 게시물 도전 | 모든 4−6 h | 모든 4−6 h, 8h, 하룻밤 무인된 | 1−2 시간 매일, 더 필요한 경우 |
| 관찰 총 인간적 끝점의 비율 | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| 관찰 하는 인간적 끝점의 비율 | 0% | 12.5% | 80.5% | 7% |
| 자비 롭 끝점 기준 | 1입니다. 양쪽에 FTR−Nonmobile | 1입니다. 양쪽에 FTR−Nonmobile | ||
| 2. 둥지에서 뿌려 지 고 FTR−Lethargic은 | 2. 둥지에서 뿌려 지 고 FTR−Lethargic은 | |||
| 3. FTR 둘 다 왼쪽 또는 오른쪽에 (와 어떤 이동성 점수) | ||||
표 1: 질병의 다른 단계에서 모니터링 하 고 자비 롭 끝점 기준 주파수. 주파수를 모니터링, 인간적 끝점 관찰, 인간적 끝점 및 자비 롭 끝점 기준 비율 질병의 서로 다른 단계.
| Righting 반사 | 이동성 | 바로 뒤에 배치 되 고 후에 시간 제한 | (모바일 / 기면증 / 비모바일) 운동의 측정 금액 시간 제한 | 이동성 채 점 기준 |
| 권리 | 모바일 | 4 s | 추가 8 s | 마우스 앞으로 기세를 유지 하는 행의 여러 단계를 소요 하 고 그것의 환경 탐구. 강아지 떨어지지 않습니다. |
| 기 면 | 마우스 수 한 걸음 하지만 것입니다 중지 하 고 다른을 복용 하기 전에 일시 중지. 강아지가 있습니다. | |||
| Nonmobile | 마우스 자체를 righting 후 모든 단계를 고려 하지 않습니다. 강아지가 있습니다. | |||
| 오른쪽에 실패 | 모바일 엉덩이 | 같은 4 righting 반사를 측정 하는 데 사용 하는 s | 4 시간 적어도 한 번 수평 90 ° 이상 회전 위쪽 다리와 엉덩이 운동 에너지는 s. | |
| 기 면 엉덩이 | 엉덩이 운동까지 하지만 수평에서 90 ° 저쪽에 아닙니다. | |||
| 비모바일 엉덩이 | 팔 다리를 확장 및 축소 하 여 이동할 수 있습니다 하지만 엉덩이 회전 하지 않습니다. 강아지는 매우 병 약한 보인다. |
테이블 2: 테이블 및 쥐의 건강 점수 결정 기준을 모니터링. 제공된 기준 마우스, 건강 카테고리 그룹을 정의 하 고 건강 점수 할당의 개별 차이 줄이기 위해 사용 되었다.
Discussion
출생 후 신생아 마우스는 매우 제한 된 이동성 및 도전 받지 않은 경우에 그들의 뒤에 배치 되 고 이후 자신을 바로 실패. 돌 7이 모델에 도전 하는 쥐 세 FTR 모바일 권한 모바일에서 스패닝 하는 움직임의 범위에서에서 관찰 되었다 중요 한 차이와 당된 쥐, 즉이 나이에 당된 마우스 FTR 기 면 동작을 표시 하지 않았다. Polymicrobial 패 혈 증으로 도전 하는 마우스만 되 관찰 되었다 FTR 기 면; 따라서,이 응답 질병 심각도의 표시 될 수 있습니다. 엉덩이 운동에 대 한 수평 90 ° 각도의 구분에 세심 한 되 쥐에서 엉덩이 운동 기 면 또는 모바일의 일관 되 고 정확한 할당 수 있습니다. 4의 시간 프레임 볼 경우 마우스 자체 마우스 오른쪽 수 있습니다 s 당된 쥐 일관 되 게이 기간 내 자신을 바로 할 수 있기 때문에 선정 되었다. 반복 되는 동일한 마우스의 측정 피 했다 오른쪽으로 스스로 시간 동안 엉덩이 이동성의 측정 4 제한 되었다 s, 그렇지 않으면 음식 및 온 하는 기능에 영향을 미칠 수 있는 영향을 미칠 수 마우스를 지나치게 피곤 하지 않도록 하는 더 나은 예 후 모두 왼쪽과 오른쪽에서 자체 righting 관찰 했다, 그리고 높은 점수 사용 마우스 인간적 끝점에서 결정, 일부 마우스 FTR-Nonmobile 1 개의 측에 표시 하는 것을 발견 했다 때문에 아직 다른 측면과 b에 높은 이동성 e 결국 복구할 수 있습니다.
마우스 상태를 평가 하는 데 사용 하는 채 점 시스템 범주 차단의 적용 이란 운동의 스펙트럼에 의존 그리고, 그러므로, 개별 바이어스 하는 경향이 있을 수 있습니다. 직원은 각 사람이 득점 쥐 같은; 되도록 함께 훈련 그러나, 아마 변화를 선도 하는 주관의 수준을 유지 됩니다. 득점의 일관성 7 함으로써 평가 되었다 이전 신생아 마우스 모니터링 수행 하지 했다 연구자가 프로토콜 및 비디오에서 설명한 요구 사항을 배울, 독립적으로 동작을 할당 하 고 자비 롭 결정 끝점입니다. 97%의 정확도 60 도전된 쥐, 개별 바이어스가이 모델의 행동 할당에 상당한 역할을 재생 되지 않습니다 제안에 수행 점수와 관찰 되었다. 제시 행동 모니터링 프로토콜, 돌 7에 도전 하는 동물의 관찰에 따라 아직 당된 건강 한 상태에서 6 일 보다 젊은 쥐 일관 되 게 자신을 마우스 오른쪽 수 없습니다. 따라서, 설명된 인간적 끝점 기준 젊은 쥐에 직접 적용 되지 않을 수 있습니다. 젊은 쥐가 실험 모델에 사용 되는 또는 다른 질병 활동을 사용 하 여 다른 도전 모델을 적용 하는 경우 다음 적당 한 인간적 끝점 기준 개발 하 고 해야 합니다 그렇지 않으면, 결국, 그는 쥐의 안락사를 피하기 위해 조종 하는 경우 복구할 수 있습니다. 채 점 시스템 인간적 끝점 분류, 확인, 테스트와 적용할 수 있는 잠재적으로 다른 모델에 개선 하는 강력한 방법을 표시 합니다.
Cecal 슬러리의 각 준비 또는 신형 마우스를 사용 하 여 비슷한 치명적인 복용량을 달성 하기 위해 관리 cecal 슬러리 복용량의 retitration이 필요 합니다. 각 준비 관심, 즉 생존의 판독에 의해 표준화 되었다 같은 세균 수 보다. 각 cecal 슬러리 준비 가능한 세균 농도 때문에 기증자의 공생 박테리아 또는 무게에 차이가 약간, 잠재적으로 다양 한 cecal 슬러리 재고 postfiltration의 셀 스 트레이너에서 남아. Cecal 슬러리의 적정 동안 처음 두 새끼 두 그룹으로 분할 되었다 고 각 복용량의 두 새끼에 테스트 되도록 쓰레기의 각 반 두 복용 중 도전. 결과 생존 율에는 필요한 수준 일치 하지 않았다 도전 복용량 증가 또는 5%-10%로 감소 했다 그리고 실험을 반복 합니다. 여러 새끼 쓰레기 쓰레기 차이 저항 발생할 수 또는 쓰레기에 걸쳐 패 혈 증에 대 한 민감성을 증가 대 한 계정에 사용 되었다. 그것은 정확 하 게 titer cecal 슬러리의 새로운 적정 이전 cecal 슬러리 준비에 비교 했다 되도록 각 새로운 준비 cecal 슬러리 재고 하는 것이 중요 했다. 과잉 소음 및 진동, 아스팔트와 주변 건물 및도, 건설의 압축 하는 동안 특히 댐에서 스트레스 증가를 관찰 했다. 이 cannibalization의 증가 속도와 상관 하 고도에 대 한 통제 될 필요가 있는 신생아 생존에 외부 영향 있을 수 있음을 알리는 당된 쥐에 영향을 미치는 생존 실험의 사망률에 영향을.
Cecal 슬러리 재고 준비를 위한 이전 방법 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 또는 냉동된 cecal 슬러리, 필연적으로 도전 하는 동안 하지 전송 될 것 이다 글리세롤에 저장소를 포함 하 여 방법의 다양 한을 사용 하 여 준비에 포함. 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 세균성 구성 원래 cecal 내용에 가장 가까운 데의 이점을 제공 한다, 동안 공생 박테리아의 변형으로 인해 개별 기증자 쥐 해 위험이 있다. 이 시간을 최소화 하면서 실험의 진행 및 사이 동일한 공급 업체에서 cecal 기증자를 사용 하 여 최소화 했다, 하는 동안 일부 실험실에 대 한 비용 옵션 될 수 이와 데에서 또 다른 타이밍 물류 과제를 제시 나이 일치 마우스 cecal 슬러리를 개시 하는 때 사용할 수 있는 7 일 된 신생아 쥐에 있는 실험. 여러 성인 기증자의 cecal 내용이 풀링된 했다, D5W, 글리세롤, 없이-80 ° C에서 냉동에 resuspended 및 실험에 대 한 한 번에 한 약 수 동 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 다른 방법 이용 되었다. 성인 기증자 cecal 슬러리 신생아 패 혈 증 연구의 활용 가능성이 종의 박테리아 신생아 마우스, 노출 되지 않은 cecal 슬러리에 전송할 수 하지만 그것은 신생아 쥐에 있는 패 혈 증의 연구에 대 한 허용 하는 전략 및 지난13,,1415에서 신생아 마우스 생물학을 공부 하는 데 사용 되었습니다. Cecal 슬러리 박테리아 주입 했다 고 necrotizing 동안 복 막 구멍에 있는 양분의 가용성을 모방 하기 위해 적극적인 감염의 설립을 허용 박테리아에 영양을 제공을 D5W에 희석 했다 enterocolitis입니다. 글리세롤은 부작용 때문에 잠재적인 부정적인 글리세롤 주입 혼자에서 발생할 수 있는 박테리아에 안정 시키는 대리인으로 포함 되지 않았습니다. 글리세롤 cecal 슬러리 준비 포함 되었습니다, 경우 다음 잠재적인 피해는 글리세롤 혼자 수 유도 것 필요한 글리세롤 전용 (부족 cecal 슬러리)를 포함 하 여에 대 한 테스트를 증가 했는 쥐에 주입 마우스 사용. Cecal 슬러리의 박테리아 생존 글리세롤 없이 cecal 슬러리 재고 동결 후 테스트 하 고 발견 했다 6 통해-80 ° C에 저장 된 동일한 cecal 슬러리 준비의 별도 aliquots에 박테리아 농도에 변화 없이 일정 달 기간입니다. 이 글리세롤 없이 저장 가능한 일관 된 생물학적 결과 제공 하는 것을 제안 합니다. 대량-준비 cecal 슬러리 재고 냉동의 사용 또한 쥐 사내, 사육 비용 절감 및 마우스 소모를 줄이고 따라서 번 식에서 초과 수 컷 쥐를 이용 하 여의 사용 허용.
쥐에서 실패 한 과제의 식별 시스템에 여분의 노이즈를 추가 하지 않도록 하는 것이 중요 했다. Cecal 슬러리의 복 주사를 받은 후 쥐 표시 실제로 피하는 실패 한 주사를 피부 밑에 볼록한의 존재에 대 한 관찰 되었다. 마우스 바늘 제거 직후와 마우스 가끔 것 때문에 그들은 주입 후 걸음을 허용한 후 주사 사이트에서 누수에 대 한 관찰 했다 단계를 취 함으로써 주사 부의 사지를 이동 후 (거의) 새. 돌출 또는 주입에 따라 누설의 존재는 분석에서 마우스를 제거 결과. 결국, 이러한 도전 복용량에 5% 차이 이후의 생존에 영향을 미치는 관찰 되었습니다로 주입 cecal 슬러리의 잘못 된 금액으로 인해 다른 결과 초래할 수 있습니다.
Cecal 슬러리 도전 무게 조정 복용량을 변화 자주 필요한 다양 한 대상 치명적인 복용량 실험. 이 때문에, 사출 볼륨 만큼 적게 20 µ L에서 및 100 µ L까지 배열할 수 있다. 관련 된 비례 실험 오류 죽은 바늘 볼륨 변경 주입 볼륨, 다른 복용량을 직접 비교 하는 데 어려움을 증가 함께. 사출 볼륨 표준화의 간단한 수정, 차이의이 소스는 실험에서 제거 됩니다.
이 프로토콜에 사용 되는 신생아 마우스의 행동 모니터링 시스템 그것의 종류의 첫번째 이다. 신생아 쥐와 윤리적인 연구에 연구원 의도 자주이 나이에 동물의 복지를 평가 하기 위해 자원의 도전적인 부족으로 직면 된다. 제시 직관적이 고 일관 된 모니터링 시스템이 지식 격차를 해결 하기 위해 시작 합니다. 중요 한 것은,이 증거 기반 접근 뿐만 아니라 획득 한 실험 데이터의 품질을 증가 하지만, 같은 시간에도 실험 동물의 고통을 감소.
Disclosures
닥터 제임스 윈에서는 국립 보건원 (NIH) / 국가 지원을 받는 일반 의료 과학 (R01GM128452)의 연구소와 NIH /유 니스 케네디 슈 라이버 국립 아동 건강과 인간 발달 (NICHD) (연구소 R01HD089939)입니다.
Acknowledgments
그들의 지도 동물 모니터링 및 복지에 입력에 대 한 특별 클레어 해리슨과 동물 케어 시설에 브리티시 컬럼비아의 아동 병원 연구 연구소 (BCCHR) 그들의 지원에 대 한 일 뿐만 아니라 닥터 포 연 청에 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
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