Summary
Dit protocol biedt de nodige maatregelen treffen en evalueren van neonatale sepsis in 7 dagen oude muizen.
Abstract
Neonatale sepsis blijft een globale belasting. Een preklinische model tot effectieve profylactische of therapeutische interventies op scherm nodig is. Neonatale muis polymicrobial sepsis kan worden opgewekt door het injecteren van cecal drijfmest intraperitoneally naar dag van leven 7 muizen en toezicht op hen voor de volgende week. Hier zijn de gedetailleerde stappen nodig voor de uitvoering van dit model neonatale sepsis. Dit omvat het maken van een homogene cecal drijfmest voorraad, verdunnen het voor een dosis en nest-gewogen, een overzicht van de tijdschema's monitoring en een definitie van de waargenomen gezondheid categorieën gebruikt om te definiëren van humane eindpunten. De generatie van een homogene cecal drijfmest voorraad van gebundelde donoren zorgt voor het beheer in vele nesten na verloop van tijd, vermindering van de variatie tussen donoren, en voorkoming van het gebruik van potentieel toxische glycerol. De bewakingsstrategie gebruikt zorgt voor de anticipatie van overleving resultaat en de identificatie van muizen die later ter dood, waardoor voor een eerdere identificatie van de humane eindpunt zou vooruitgang. Twee belangrijkste gedragsmatige kenmerken worden gebruikt voor het definiëren van de scores van de gezondheid, namelijk, het vermogen van de neonatale muizen om recht zelf wanneer geplaatst op hun rug en hun niveau van mobiliteit. Deze criteria kunnen mogelijk worden toegepast op adres humane eindpunten in andere studies van neonatale ziekte in muizen, zo lang als een pilot-studie is uitgevoerd om te controleren nauwkeurigheid. Kortom, biedt deze benadering een gestandaardiseerde methode om model pasgeboren sepsis bij muizen, terwijl het verstrekken van middelen voor de beoordeling van het welzijn van dieren gebruikt voor het definiëren van vroege menselijke eindpunten voor uitgedaagd dieren.
Introduction
Sepsis is een belangrijke oorzaak van menselijke pasgeboren besmettelijke sterfgevallen1. Omdat pasgeboren sepsis slecht wordt begrepen, is weinig vooruitgang geboekt in zowel de identificatie van risicogroepen pasgeborenen vroeg tijdens de ziekte en de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen of prophylaxes. Dit vereist het gebruik van dierlijke modellen van sepsis om het proces en test mogelijke interventies beter te begrijpen. Bovendien, volwassen knaagdieren reageren anders op sepsis, met statistisch significante verschillen in het aantal bacteriën te beheren om te verkrijgen van de dezelfde letale dosis (LD) en in het resulterende host antwoord ten opzichte van pasgeborenen2. Neonatale sepsis heeft dus worden bestudeerd bij pasgeborenen. Verschillende volwassen sepsis modellen zijn gebruikt in sepsis onderzoek. Deze omvatten een intraveneuze uitdaging met specifieke organismen betrokken bij volwassen menselijke sepsis of cecal afbinding en punctie (CLP). Het CLP is een model van de endogene uitdaging waar de blindedarm is operatief geïsoleerd, afgebonden en doorboord zodat lekkage van intestinale inhoud in het buikvlies, uiteindelijk zal leiden tot de systematische verspreiding van microben en hun producten-3. Echter, de chirurgische procedure minimaal vereist voor invoering van CLP is dodelijk voor pasgeboren dieren; een alternatieve methode is daarom noodzakelijk om na te bootsen de uitdaging van de polymicrobial van het CLP voor het opwekken van neonatale sepsis. De cecal drijfmest model voor polymicrobial van de neonatale sepsis is ontwikkeld om deze behoefte, waarbij de cecal inhoud van dieren zijn geoogst, geschorst in steriele dextrose 5% in water (D5W) en intraperitoneally in pasgeboren muizen2geïnjecteerd. Dit geworden sinds, een steeds populairder wordende model te bestuderen van sepsis in zowel volwassen als pasgeboren dieren en zich aanzienlijk ontwikkeld mechanistische inzichten in van de ziekte proces4,5,,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Gezien het toenemende gebruik van dit model en wil van onderzoekers direct resultaten van publicaties met elkaar vergelijken, is er een noodzaak voor de technische aspecten zijn goed beschreven en gestandaardiseerde via studies. Normalisatie is van toepassing op drie aspecten van het model, namelijk i) de voorbereiding van de cecal drijfmest voorraad, ii) de opstelling van de uitdaging aliquots voor injectie in de proefdieren, en iii) de definitie van de humane eindpunt waarbij dieren nonsurvivors in uitdaging experimenten worden geacht. In het bijzonder wordt methoden ter voorbereiding van de voorraad cecal drijfmest vaak verwezen naar het originele artikel voor de invoering van het model2. Een korte samenvatting van dat model is dat cecal inhoud van volwassen muizen werden geoogst, in steriele D5W tot een concentratie van 80 mg/mL opgeschort, en binnen 2 uur te injecteren de proefdieren gebruikt. Deze originele model gebruikt muizen van dezelfde leeftijd, aan de zelfde leverancier, die gehuisvest waren in hun respectieve onderzoeksfaciliteiten voor minder dan 2 weken vóór de oogst van cecal inhoud. Het gebruik van in-house gefokte muizen, hoewel de verlaging van de kosten van de leverancier van de regelmatige levering en rekening houdend met het gebruik van overtollige muizen voor een breder scala van geslacht en leeftijd, ook aanzienlijk toegenomen variabiliteit van de donor-naar-donor. Dit gemotiveerd de ontwikkeling van een alternatieve techniek, waarbij de cecal inhoud van meerdere muizen samen te bereiden een grote voorraad, toenmalig aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C13werden gebundeld. Deze alternatieve methode werd aangepast met meerdere groepen14,15. Echter, dat aanpassing resulteerde in enkele technische varianten, zowel in het opslagmedium gebruikt (10% of 15% glycerol of D5W alleen) als in de strategie van de filtratie verwijderen deeltjes (meertraps filtratie door een 860 µm en, vervolgens, een 190 µm filter of persoon filteringen via 100 µm of 70 µm filters)13,14,15. De injectie van glycerol alleen zou kunnen leiden tot schade, gezien het feit dat 25% - 50% glycerol injecties zijn gebruikt als een knaagdier model van renale letsel16,17,18,19, 20. Om te voorkomen dat onbedoelde neveneffecten glycerol, cecal drijfmest voorraad voorbereid op muizen in deze studie is bevroren in D5W zonder glycerol en tests van bacteriële levensvatbaarheid van opslag bij-80 ° C worden uitgevoerd. De strategie van de filtratie gebruikt in deze studie is één doorheen een 70 µm filter, dat is niet direct vergeleken met de andere filtratie strategieën vermeld.
Dodelijke gewogen doses van geïnjecteerd cecal drijfmest kunnen variëren van faciliteit aan faciliteit en moeten titered uit om de gewenste letaliteit voor afzonderlijke groepen. Met verschillende uitdaging doses wijzigen de begeleidende uitdaging volumes door noodzaak. Dit methodologisch detail is echter niet gemeld vóór. Bovendien, strategieën voor standaardprocedures, zoals intraperitoneale injectie, worden zelden uitgewerkt op binnen de literatuur, maar individuele technieken kunnen beïnvloeden of pasgeboren muizen lekken wanneer ze worden geïnjecteerd en invloed op hun uiteindelijke resultaten.
Het welzijn van dieren, met inbegrip van een definitie van humane eindpunt, is een centraal aspect van dit model en in ieder model van infecties en ontstekingen in knaagdieren21. In 1998 publiceerde de Canadese Raad op Animal Care (CCAC) uitgebreide richtsnoeren voor humane eindpunt de selectie, het humane eindpunt te definiëren als "daadwerkelijke of potentiële pijn, leed en de eventuele ongemak moet worden geminimaliseerd of verminderd door te kiezen voor de vroegste eindpunt dat is compatibel met de wetenschappelijke doelstellingen van het onderzoek"22. Anderen ook voorzichtigheid dat humane eindpunten moeten worden vastgesteld op basis van wetenschappelijke verantwoording niet op een subjectieve interpretatie van het dier staat alleen21. Hoewel er een schat aan middelen voor klinische, gedrags, en lichaam-conditie teken gebaseerde criteria voor humane eindpunt, zelfs in de context van infectie en ontsteking specifiek21,23,24, geen van deze , met inbegrip van de CCAC richtsnoeren voor humane eindpunt22, pasgeboren muizen noemen. Objectief en wetenschappelijk gemotiveerde humane eindpunten zijn dus veel moeilijker om vast te stellen voor pasgeboren dieren, gezien hun beperkte gedrags mogelijkheden én het gebrek aan bewijs van criteria zoals gewichtsverlies, die meestal voor volwassene gebruikt wordt muizen. Op dit moment, de criteria voor het humaan eindpunt gebruikt voor 5 - tot 12-dag oude neonatale muizen in de literatuur van de cecal drijfmest alle verwijzing terug naar het originele manuscript die het model2. In deze oorspronkelijke papier, was de definitie van humane eindpunt voor pasgeboren dieren gebaseerd op twee criteria; namelijk, de locatie van een muis buiten het nest (verstrooiing) en het gebrek aan melk vlekken had gezien te resulteren in de dood binnen uur. Een complicerende zaak bij het toekennen van een humane eindpunt is dat melk vlekken moeilijk te zien bij muis stammen met donkere vacht, zoals de algemeen werkzame C57BL/6J stam, na de eerste week van het leven, terwijl zieke dieren worden gecontroleerd tot de 14e dag van het leven (DOL) geworden. Verdere, dode dieren kunnen worden gevonden postchallenge wanneer de toepassing van dit criterium (eigen waarneming, ongepubliceerd); een strengere definitie van humane eindpunt is dus nodig om te verlichten van lijden van proefdieren en sterfte in situaties waar het resultaat worden nauwkeurig eerder onderscheidde kon voorkomen.
Alle drie methodologische aspecten van het model cecal drijfmest worden gepresenteerd in een standaard gebruiksprocedure detaillering van de voorbereiding van cecal drijfmest voorraad, een methode voor het injecteren van de proefdieren die houdt de constante injectie volume tussen de doses en vermindert het risico op lekken, en een definitie van humane eindpunt voor 7 - tot 12-dag oude muizen gebaseerd op een systeem van gedrags modelleren. Gedrags informatie van muis gezondheid scores uit meer dan 240 proefdieren was verzameld en gegroepeerd op definitieve overleving resultaat, aan te tonen een bewijs gebaseerde definitie van humane eindpunt. Het lijden van proefdieren is teruggebracht door het identificeren van stervende neonatale muizen op het vroegst mogelijke tijdstip, terwijl biologisch belangrijke overleving resultaten kunnen worden afgeleid door het observeren van de belangrijkste variabelen. De visuele representatie van zowel cecal drijfmest voorbereiding en neonatale muis gedrag zal dienen als een uitstekend middel om een groep studeren sepsis of pasgeboren uitdaging model dieren.
Protocol
Alle experimenten in dit protocol zijn goedgekeurd door de University of British Columbia dierlijke zorg Comité onder protocolnummer A17-0110.
1. hulpmiddel sterilisatie
- In een biologische veiligheidskast (BSC), inschakelen en verwarm de sterilisator hete kraal tot 250 ° C, ten minste 30 minuten vóór gebruik.
- Dompel de hulpprogramma's in 70% ethanol.
- De hulpprogramma's in de voorverwarmde hete kraal sterilisator gedurende ten minste 1 min. onderdompelen.
Opmerking: De handgrepen voor de tools krijgt warm en kunnen branden als links in de sterilisator hete kraal voor meer dan 1,5 min. - Spray een mat van papieren handdoeken met 70% ethanol aan het steriliseren.
- De hulpmiddelen van de sterilisator hete kraal verwijderen zonder het aanraken van de gesteriliseerde deel van het hulpprogramma de niet-steriele grepen voor andere verzonken tools en leg ze op de ethanol-gespoten papieren handdoeken.
- Wachten voor 30 s tot 2 min voor de instrumenten afkoelen alvorens ze te gebruiken voor een dissectie.
2. cecal drijfmest voorbereiding
- Preweigh 15 mL centrifuge buizen (één buis voor elke vijf muizen wordt euthanized).
- Euthanaseren cecal drijfmest donoren volgens de richtlijnen van de plaatselijke dierenverzorgers of gebruik maken van de onderstaande protocol.
Opmerking: Tot 40 C57BL/6J muizen tussen 6 en 12 weken oude werden gebruikt voor de voorbereiding van de cecal drijfmest, met maximaal vijf muizen wordt euthanized tegelijk.- De muizen overbrengen in de zaal van euthanasie en de Isofluraan verdoving machine ingesteld op 5% met zuurstof perfusie.
- Controleren van de muizen om te observeren het verlies van de mogelijkheid om te verplaatsen en om te zien hen invoeren van het chirurgische vliegtuig van anesthesie en tenslotte stoppen met ademhalen.
- Een muis verwijderen uit de zaal van de euthanasie, knijpen van haar poot en houd rekening met been retractie of inhalatie. Als beide aanwezig is, keren de muis naar de vergaderzaal van de euthanasie; anders blijven.
- Terminaal euthanaseren de muizen door scherpe cervicale dislocatie.
- Cecum dissectie, met presterilized en gekoelde hulpmiddelen (zie punt 1) in een BSC uitvoeren
- PIN de benen van de muis op een geëxtrudeerd polystyreenschuim bord met 23 G naalden, zodat de muis haar buik omhoog heeft. Beveilig en vervolgens spuiten de buik met 70% ethanol.
- Met behulp van steriele Tang en schaar, sneed door de huid, los van de huid van de peritoneale bekleding met de schaar, en gesneden open een rechthoekige regio van Lies tot borstbeen, en links naar rechts. Verwijder eventuele bont uit het buikvlies.
- Overschakelen naar een nieuw paar voor steriele tools te snijden door het buikvlies, een rechthoekige opening maken, zoals ook is gebeurd voor de huid, over te schakelen tools als degene die contact gebruikt de huid.
- Het identificeren van de blindedarm, die moet worden uitgevoerd links naar rechts over het lichaam. Bindweefsel te identificeren van de blindedarm takken uit de darmen en snijd de blindedarm uit de buurt van de darmen verstoren. Plaats de blindedarm op een gesteriliseerde vel papier gewicht.
Opmerking: Met een gewicht van papier kan worden gesteriliseerd of door te besproeien het met 70% ethanol aan beide zijden en laat het drogen, door UV-bestraling. Ook kan de blindedarm op een steriele Petri plaat worden ontleed.
- Cecal inhoud extrusie
- In een BSC, steriele hulpmiddelen gebruiken om te snijden door de beide uiteinden van de blindedarm.
- Houd het midden van de blindedarm met steriel pincet en gebruik een spatel plat steriele metalen te zachtjes duwen de cecal inhoud uit de cut eindigt, met behulp van een rollende beweging en het vermijden van een schraperig beweging die kan het epitheel scheuren. Verzamelen van de inhoud en plaats hen in een centrifugebuis preweighed 15 mL.
- Zwembad de cecal inhoud van een maximum van vijf muizen in de dezelfde buis. Weeg de buis opnieuw zodra alle inhoud bijgekomen.
Opmerking: Een gemiddelde van 300 mg verwachten, en omhoog met 390 mg cecal drijfmest per muis, vereisen van 1,8 tot 2.4 mL D5W voor resuspensie per muis; Dus, met behulp van meer dan vijf muizen tijdens deze stap kan leiden tot overvulling van de centrifugebuis 15 mL. - Veeg de hulpmiddelen schoon met een ethanol-gespoten papieren handdoek en resterilize hen door te stappen 1.2-1.6 herhalen.
- Cecal drijfmest filtratie
- Weeg de centrifugebuis gevuld met cecal inhoud en berekent het bedrag van D5W toe te voegen aan de cecal inhoud door het gewicht van de cecal inhoud verdelen door de gewenste voorraad concentratie in milligram per milliliter, zoals in de onderstaande vergelijking.
- In een BSC, voeg toe het normbedrag van ijskoude D5W aan de 15 mL centrifugebuis met de cecal inhoud.
- Vortex de 15 mL Centrifugeer buis verticaal en horizontaal voor 30 s. Check voor deeltjes van meer dan 1-3 mm in diameter en indien aanwezig, totdat vortexing alle grote deeltjes zichtbaar is verdwenen.
- Plaats een steriele 70 µm cel zeef in een centrifugebuis 50 mL dat wordt geplaatst op het ijs. Pipetteer 4 mL geresuspendeerde cecal drijfmest in de cel zeef en vervolgens aan de collectie buis. Resuspendeer de deeltjes door pipetteren op en neer 2 x-3 x. Zachtjes extruderen bubbels om de filter snelheid te verhogen terwijl de inhoud met de pipet tip roeren, zolang er niet zijn zonder meer druppeltjes wordt gefilterd.
Opmerking: Bij het mengen, kunnen er deeltjes groot genoeg om de steek van de 5 mL-pipet. In dit geval, herhaal de vortexing uit 2.5.3 stap, en als de oplossing nog steeds niet uit elkaar breekt, gebruik de pipet om te drukken de deeltjes tegen de muur van de centrifugebuis. - Herhaal stap 2.5.4, veranderende cel vulinrichtingen tussen elke buis van cecal drijfmest en zwembad alle inhoud in de dezelfde 50 mL collectie centrifugebuis gehouden op ijs, of in een tweede 50 mL centrifugebuis als het volume van het filtraat groter is dan het niveau van het ijs in de koelbox.
- Weeg de centrifugebuis gevuld met cecal inhoud en berekent het bedrag van D5W toe te voegen aan de cecal inhoud door het gewicht van de cecal inhoud verdelen door de gewenste voorraad concentratie in milligram per milliliter, zoals in de onderstaande vergelijking.
- Aliquot de cecal drijfmest.
- Indien van toepassing, combineren meerdere 50 mL cecal drijfmest filtraat buizen uit stap 2.5.5 in een grotere steriele container (bijvoorbeeld een 1000 mL opslag fles). Vervolgens, vortex voor 15 s en plek in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL 20 mL.
- Vortex de cecal drijfmest voorraad thats in de centrifugebuis 50 mL voor 5-10 s en aliquoot 500 µL in drie cryogene 2 mL-flesjes hebben een rubberen afdichting, om te voorkomen dat verdamping na verloop van tijd. Onmiddellijk plaats de meester voorraad en aliquoted cryogene flacon op ijs.
- Herhaal stap 2.6.1 en 2.6.2 totdat de cecal drijfmest heeft al aliquoted, vortexing de meester voorraad na elke drie cryogene flesjes om te voorkomen dat de beslechting van eventuele deeltjes en om een homogeen mengsel.
- Bevriezen van de cecal drijfmest aliquots bij-80 ° C.
Opmerking: Verwacht tussen drie tot vier voorraad flesjes op 500 µL van elke volwassen muis. Elke voorraad flacon moet ongeveer genoeg uitdaging een nest van acht muizen op DOL 7.
3. sepsis uitdaging van 7 dagen oude neonatale muizen
- Scheiden, sporen en wegen van neonatale muizen.
- In een BSC, door de neonatale muizen te overbrengen in een nieuwe kooi te houden van de muizen uit de buurt van de dam en om stress te verminderen tot de dam.
- Verwijderen en wrijf deel van de nesten materiaal met handschoenen te dragen van de kooi geur aan de handschoenen. Daarna schimmel de nesten materiaal in een kleinere nest en plaats het in een nieuwe kooi zonder de dam.
- De neonatale muizen overbrengen in de nesten materiaal in de nieuwe kooi.
- Breng meer nesten materiaal om een tweede, lege nest in de nieuwe kooi.
- Sluit en de dam kooi uit de kap verwijderen zodat de dam niet benadrukt is om het even welk van de neonatale muizen nood te horen.
- Gebruik wilt bijhouden individuele neonatale muizen binnen het nest na verloop van tijd, een marker ethanol-bewijs ter gelegenheid van een tot vijf stippen op de voorzijde of de keerzijde van de staart, opnieuw toepassen van elke 12-24 h zo nodig.
- Weeg elke muis die zal worden aangevochten, plaatsen van elk in de secundaire nest na weging, en herhaal dit voor alle de muizen.
- Het hele nest terugkomen met de dam voordat de cecal drijfmest uitdaging aliquoot voorbereidt.
- Berekenen van de individuele gewogen doses van cecal drijfmest en vereiste verdunning met D5W door de voltooiing van deze stap voor elk strooisel afzonderlijk, met behulp van de onderstaande berekeningen of met behulp van het meegeleverde werkblad (Zie Aanvullende bestand).
- Bereken de milligram van (een) cecal drijfmest te worden toegediend aan elke muis door te vermenigvuldigen met het gewicht van de muis in gram (b) door de uitdaging van de gewenste dosis in mg cecal drijfmest per gram muis (c).
- Berekenen van het individuele volume van onverdunde cecal drijfmest materieel nodig per muis in microliters (d) door het verdelen van de mg cecal drijfmest nodig per muis uit stap 3.2.1 (een) door de voorraad cecal drijfmest concentratie, 160 mg cecal drijfmest per milliliter van D5W (e), en te vermenigvuldigen met 1000 µL per milliliter omzetten microliters van milliliter.
- Gemiddelde het voorraad volume van cecal drijfmest nodig per muis (g) door optelling van de hoeveelheid cecal drijfmest voorraad (d) per muis in een nest van n muizen, gedeeld door het aantal muizen (n).
- Berekenen de gemiddelde verdunningsfactor voor de cecal drijfmest voorraad (h) door te delen het gemiddelde geïnjecteerde volume (100 µL) van de gemiddelde voorraad hoeveelheid cecal drijfmest nodig per muis (g).
- Berekenen van elke muis specifieke geïnjecteerde volume in microliters (j) door te vermenigvuldigen met de gemiddelde verdunningsfactor (h) van elke muis volume van voorraad cecal drijfmest nodig (d), en vervolgens het afronden op de dichtstbijzijnde tien (aan de 10 µL stappen van de injectiespuit).
- Bereken de gemiddelde vereiste omvang van D5W om te verdunnen van de voorraad cecal drijfmest (k) door de gemiddelde cecal drijfmest voorraad (g) van het gemiddelde geïnjecteerde volume (100 µL) af te trekken.
- Bereken de totale hoeveelheid cecal drijfmest voorraad in microliters (l) door te vermenigvuldigen met de gemiddelde voorraad cecal drijfmest per muis in microliters (g) door het aantal muizen in dit nest (n) en te vermenigvuldigen met 1.4 maken extra.
- Berekenen van de totale hoeveelheid van de D5W in microliters (m) nodig om te verdunnen van de voorraad cecal drijfmest door te vermenigvuldigen met de gemiddelde vereiste omvang van D5W (k) door het aantal muizen (n) en te vermenigvuldigen met 1.4 maken extra.
- Bereken de milligram van (een) cecal drijfmest te worden toegediend aan elke muis door te vermenigvuldigen met het gewicht van de muis in gram (b) door de uitdaging van de gewenste dosis in mg cecal drijfmest per gram muis (c).
- Bereid de uitdaging aliquot na berekening van de hoeveelheid voorraad cecal drijfmest nodig (l uit stap 3.2.7). Ontdooi het vereiste aantal cecal drijfmest voorraad flesjes bij kamertemperatuur, pipetting de inhoud ervan te mengen in een BSC.
- Wanneer er niet meer zichtbaar zijn ijskristallen presenteren in de ontdooide cecal drijfmest, de berekende hoeveelheid cecal drijfmest voorraad (l uit stap 3.2.7) overbrengen in een steriele 1.8 mL microcentrifuge buis.
- Vul aan tot de gewenste concentratie door ijskoude D5W toe te voegen zoals berekend in stap 3.2.8 (m). Bewaar de uitdaging aliquot op ijs.
- Meng voor het laden van de spuit, de microcentrifuge buis door flicking het 20 x, gevolgd door 3 x van opstellen en uitzetting van 300-500 µL van cecal drijfmest met een 500 cc 28 G ½ inch insuline spuit.
- Opstellen van ongeveer 150 µL van verdunde cecal drijfmest in de dezelfde spuit.
- Flick de spuit te verjagen bubbels van de plunjer, trek iets terug op de spuit, vervolgens het verdrijven van de bubbels.
- Afzien de overtollige cecal drijfmest terug in de buis van de microcentrifuge tot de juiste hoeveelheid cecal drijfmest voor één muis, zoals werd berekend voor individuele muizen in stap 3.2.5 (j), is geladen in de spuit.
- Intraperitoneally cecal drijfmest, injecteren volgens richtlijnen van de instelling van de relevante lokale dierenverzorgers, of gebruik de hieronder geschetste stappen.
- In een BSC, scheidt u de neonatale muizen vanaf de dam zoals beschreven in stap 3.1.
- Nekvel de muis door de achterkant van de nek, met behulp van de duim en wijsvinger.
- Beveiligen van de muis staart over de rug van het midden- en ringvinger, of op de voorkant van de ring en pinky vingers.
- Om lekken te minimaliseren, kantelen van de neonatale muis zodat het naar beneden gericht en de naald schuine kant van de naald naar boven, tussen het been en de genitaliën, houden van de naald, ondiep en subcutane invoegen.
- Wanneer de naald wordt ingevoegd voor 1 cm, druk naar beneden en toekomen om te voelen van de naald punctie van het buikvlies. Langzaam druk de plunjer, houden het puntje van de naald zo stabiel mogelijk te houden, zoals de zijwaartse bewegingen van de muis organen kunnen beschadigen.
- Zorgvuldig het terugtrekken van de naald 5-10 s, volgen dezelfde route uit zoals in de middelvinger ontspannen tijdens de verhuizing naar het verminderen van de spanning in het lichaam van de muis.
- Als u wilt controleren op lekkage, houd de muis voor een paar seconden na het verwijderen van de naald, tijd voor de injectieplaats te sluiten, te geven en houd rekening met eventuele lekkage of bolling op de injectieplaats, op welk punt de muis mag niet worden gebruikt in de analyse.
Opmerking: Bolling van de huid op de injectieplaats een mislukte intraperitoneale injectie, geeft met de injectant wordt onderhuids. - Plaats de muis op een keukenrol en laat de muis om een stap te zetten. Als de muis onbeweeglijk voor 5 is s, druk licht op de staart.
- Pak de muis en controleren op lekkages van cecal drijfmest op de injectieplaats. Als er een lek, uitsluiten van de muis van de analyse en de muis euthanaseren.
4. controle muis
- Controleren van de muizen regelmatig om te controleren of ze aankomen op een humane eindpunt.
- Observeer de muizen 2 h postchallenge voor injectie-gerelateerde complicaties.
- Controleren van de muizen 12 h postchallenge voor sepsis-gerelateerde morbiditeit en de identificatie van muizen op een humane eindpunt (Zie stappen 4.2-4.3 criteria).
- Vervolgens controleren elke 4-6 h voor de eerste 2 dagen, met uitzondering van 8 h's nachts, wanneer de neonatale Muizen zonder toezicht zijn.
- Na 2 dagen postchallenge, 1 x-2 x per dag te controleren. Als zieke muizen of muizen, wiens gezondheid score dalingen zijn waargenomen, vervolgens de controle frequentie aan elke 4-6 h te verhogen.
- Toezicht op neonatale muizen
- Draag het beddengoed materiaal naar een nieuwe kooi voor elke procedure met betrekking tot neonatale muizen, zoals beschreven in stap 3.1 (er om dezelfde redenen als vermeld). Controleer zorgvuldig voor eventuele pasgeborenen dat vanuit het nest terwijl verpleging zijn gesleept. Alle muizen die worden gesleept uit het nest terwijl verpleging moeten niet worden beschouwd als muizen worden verspreid.
- Bij het verwijderen van de bovenkant van het nest, hetzij uit de buurt van het nest een verstrooiing van neonatale muizen identificeren of geplakt in de nesten materiaal maar uit de buurt van hun nestgenoten, met uitzondering van muizen gesleept uit de buurt van het nest terwijl verpleging. Verwijzen naar het humane eindpunt criteria in stap 4.5 als een muis wordt gevonden verspreid.
- Meten van de muizen restarmen reflexen en mobiliteit.
- Een papieren handdoek, plaatst een muis op zijn rug en controleren voor haar vermogen om recht zelf binnen een maximum van 4 s. Wanneer geplaatst op zijn rug, zal de muis dalen tot de linker- of rechterkant, dat is wanneer de 4 s telling begint.
Opmerking: Om te worden ingedeeld in de groep "Mensenrechten", moet de muis staat om ten minste drie van de vier paw pads op de papieren handdoek voor 1 s. Het is nog steeds gegroepeerd als zijnde kundig voor recht zelf als het omvalt.- Als de muis zelf recht kan, wacht u tot 8 s om te bepalen van de mate van geografische mobiliteit.
- De muis als "Rechten-Mobile" categoriseren als het kan zelf recht en de omgeving verkennen door middel van meerdere stappen op een rij.
- De muis als "Rechten-lusteloos" categoriseren als het kan zelf recht en een paar stappen om de omgeving te verkennen. De muizen in deze groep kunnen omvallen terwijl het nemen van een stap kijken wankel op hun voeten en pauzeren tussen stappen.
- De muis als "Rechten-Nonmobile" categoriseren als het zelf recht kan maar niet rond veel beweegt. Het nog steeds kan omvallen, en als het niet stappen binnen 8 nemen s, het is gegroepeerd als rechten-Nonmobile.
- Als de muis kon zelf niet rechts, vervolgens categoriseren de mobiliteit op basis van de waargenomen heup beweging.
Let op: Niet bij herhaling wordt de bewaking of verhoging van de lengte van de tijd die de muis op hun rug besteedt omdat dit van invloed kan zijn op het scoresysteem en de humane eindpunt, als een muis die niet aan het recht zelf binnen 4 s kan soms doen indien gegeven meer tijd.- Categoriseren van de muis als "Fail naar rechts (FTR)-mobiele" als het niet kan recht zelf en toont hip beweging die groter is dan 90° hoek van horizontaal. Sommige muizen kunnen het recht zich als gegeven van meer dan 4 s maar moet nog steeds worden gecategoriseerd als FTR, met mobiliteit scores op basis van heup beweging.
- De muis als "FTR-lusteloos" categoriseren als het recht zelf niet kan worden weergegeven, hip beweging onder 90° hoek van horizontaal.
- Categoriseren de muis als "FTR-Nonmobile" als het niet recht zelf en heeft benen die schud of trillen maar geen hip beweging. Ledematen kunnen verlengen of intrekken maar doen geen zijdelingse beweging. De muis is zichtbaar ziek en heeft het humane eindpunt bereikt.
- Een papieren handdoek, plaatst een muis op zijn rug en controleren voor haar vermogen om recht zelf binnen een maximum van 4 s. Wanneer geplaatst op zijn rug, zal de muis dalen tot de linker- of rechterkant, dat is wanneer de 4 s telling begint.
- Herhaal stap 4.3 aan de andere kant van de muis, opname van beide zijden.
Opmerking: Raadpleeg het Aanvullende bestand voor het vastleggen van waarnemingen. - Bepalen of de muis op het eindpunt van een humaan is en vereist van euthanasie zoals beschreven in tabel 1, en hieronder.
- Categoriseren muizen in verschillende vergissingen en mobiliteit niveaus op basis van de monitoring opmerkingen genoteerd in stappen 4.3 en 4.4. Voor elke zijde van de muis mobiliteit is gemeten, en het mobiele gedrag wordt gebruikt om te bepalen of de muis euthanasie vereist.
- Toewijzen muizen met een wetswijziging reflex (a) FTR-Nonmobile of (b) FTR-lusteloos en gevonden gescheiden van het nest om te worden op een humane eindpunt.
- Bij het toezicht op tijdstippen buiten 20 h postchallenge, classificeren een muis met een restarmen reflex van "fail naar rechts" aan beide zijden als het eindpunt van een humane, omdat de gepresenteerde gegevens met hoge nauwkeurigheid voorspellen dat deze muizen uiteindelijk voor de ziekte bezwijken, en niet herstellen.
- Aparte muizen die worden euthanized, zoals bepaald in stap 4.5. Als de gecontroleerde muis niet gezien wordt als een humane eindpunt, plaats het in het tweede lege nest in de nieuwe kooi zonder de dam, en gaat u verder met de andere neonatale muizen.
- Zodra het hele nest heeft gevolgd, de helft van de nesten materiaal te verplaatsen in de kooi met de dam, een nest met ruimte in het midden voor de neonatale muizen te hervormen.
Opmerking: Een onjuist geformuleerde nest kan ervoor zorgen dat de muizen te verstrooien en vermindering van de hoeveelheid beschikbare zorg die de dam kan bieden. - Breng de neonatale muizen terug in de kooi met de dam.
- Omsluiten het nest in het nest door de invoering van de overgebleven nesten materiaal over het nest en zachtjes knijpen het rond het deksel om de nesten materiaal in plaats veilig te stellen.
- Euthanaseren de neonatale muizen gescheiden in stap 4.6 volgens de vereisten van de lokale instelling.
5. titratie van de cecal drijfmest
- Daag de muizen in de gewenste uitdaging dosis (sectie 3) en het controleren van de resultaten (punt 4).
- Observeren of het uiteindelijke resultaat tot de gewenste LD leidt, en zo niet, herhaal afdelingen 3 en 4 met een nieuw nest bij een uitdaging van hogere of lagere dosis, past deze door 5% - 10%.
Opmerking: Uitdaging doses kunnen worden vergelijkbaar met figuur 1B maar moeten titered in elke faciliteit en de stam van muizen. - Ook kijken of de muizen bereiken van het eindpunt van een humane sneller of langzamer is dan de verwachte kinetiek in figuur 1B, en herhaal afdelingen 3 en 4 met een nieuw nest bij een uitdaging van hogere of lagere dosis, past deze door 5% - 10%.
Representative Results
Cecal drijfmest levensvatbaarheid opgeslagen bij-80 ° C kan getest worden na verloop van tijd door serieel verdunnen en plating aliquots van cecal drijfmest voorraad op 5% schapenmelk bloed al soja agar gevolgd door 24 h van aërobe incubatie bij 37 ° C. Latere tellen van de culturable kolonie-vormende eenheid (CFU) inhoud van een preparaat cecal drijfmest bleek niet te veranderen in een periode van 6 maanden, en de levensvatbaarheid niet werd beïnvloed door langdurige opslag bij-80 ° C (Figuur 2). Elke donor muis resulteerde, gemiddeld, in genoeg cecal drijfmest te vechten drie tot vier nesten (gegevens niet worden weergegeven).
Muizen uitgedaagd op DOL 7 met cecal drijfmest ertoe polymicrobial sepsis begon tot het humane eindpunt binnen 12 uur van de uitdaging en polymicrobial sepsis werd meestal opgelost door 48 h postchallenge, zoals waargenomen in een Kaplan-Meier overleving curve gecombineerd uit gegevens uit meer dan 200 uitgedaagd muizen (figuur 1A). De letaliteit was afhankelijk van de dosis van de challenge toegediend, met een 5% verandering in de uitdaging dosis resulterend in een ongeveer 15% verschil in overlevingskans (figuur 1B). Het lichaamsgewicht muis werd gemeten op elke controle bezoek. Gewichtsverlies werd gezien in alle uitgedaagd dieren, worden niet-discriminerend tussen muizen die overleven eindigde en die deed niet tijdens de eerste 24 h postchallenge (Figuur 1 c). Na 24u begon meest overlevende dieren te herwinnen hun gewicht, terwijl alle nonsurvivors voortgezet om gewicht te verliezen en naar hun humane eindpunt verhuisde. Echter, een klein deel van de overlevende dieren had behouden hun restarmen reflex verder om gewicht te verliezen of mislukte gewichtstoename, tot het einde van het experiment, zelfs verliezen zo veel als 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht binnen de 40 uur van de uitdaging. Toen er een overlapping van gewichtsverlies tussen muizen die overleven eindigde en die niet, kan de verandering in gewicht of een drempel van gewichtsverlies niet worden gebruikt als een criterium voor humane eindpunt terwijl nog het handhaven van het doel van de overlevenden nauwkeurig te verdelen van nonsurvivors.
Het gedrag van muizen werd gecontroleerd zoals beschreven in het protocol, en in tabel 2. Momentopnamen van de gezondheid categorieën zijn weergegeven (figuur 3A-C). Deze foto's tonen de gezondheid van de verschillende soorten muizen die niet het recht zich na gelegd op hun rug en een overzicht van het verschil tussen FTR-Mobile en FTR-lusteloos, dat is een belangrijk onderscheid. Onbetwiste gezonde muizen van deze leeftijd weergeven niet FTR-lethargisch activiteit; deze categorie van gezondheid is daarom een marker van de ziekte en een antwoord op de uitdaging. Ziek muizen FTR-lethargisch symptomen (figuur 3B) weergegeven en kunnen terugvallen naar FTR-Nonmobile (Figuur 3 c), waar het bovenbeen parallel met het onderste been blijft, met weinig tot nul hip schommelen beweging, die behoort tot de criteria voor humane eindpunt. De muizen kunnen ook herstellen, verkrijgen van toegenomen hip verkeer en steeds FTR-Mobile (figuur 3A). De restarmen reflex en mobiliteit scores werden bepaald voor zowel de linker- en rechterkant van elke muis, en de hoogste score werd gebruikt om te bepalen of de muis een humane eindpunt had bereikt. Gedrags informatie werd verzameld uit meer dan 240 dieren uitgedaagd met een dodelijke dosis 60 (LD60) cecal drijfmest en 144 humane eindpunten werden waargenomen (figuur 3D-F en tabel 1). Dit bewijs gebaseerde aanpak werd gebruikt om te definiëren en verfijnen van de humane eindpunt in vier stadia van de ziekte, gecategoriseerd door de onderzoekers gebaseerd op beide gedrags verschillen tussen overlevenden en nonsurvivors en door de Fractie van humane eindpunten bereikt tijdens elke time frame. Tijdens de vroege experimenten bleken FTR-Nonmobile muizen die had geen hip beweging consequent dood binnen 4-6 uur dit gedrag in acht worden genomen. In de collectie van de gepresenteerde informatie, werd een FTR-Nonmobile gezondheid score gebruikt als criterium voor een humane eindpunt. 12-21 h postchallenge, terwijl FTR-Nonmobile muizen werden euthanized, zowel de nonsurviving als de overlevende dieren zeer vergelijkbaar gedragspatronen weergegeven en kunnen niet worden onderscheiden op een andere manier (figuur 3D). Vanaf 21-48 h postchallenge, de meerderheid van de muizen te overleven herwonnen hun restarmen reflex, terwijl minder dan 1% van de problemen van de FTR waargenomen waren in dieren die zou gaan om overleven het experiment (3E figuur). Muizen die niet het recht zich aan beide zijden werd dus een extra criterium voor humane eindpunt gedurende deze tijd. Tussen 12 en 20 h postchallenge, werden 12,5% van het totale aantal humane eindpunten waargenomen, versus 80,5% tussen 20 en 48 h en 7% na 48 uur (tabel 1). Een onderscheidend kenmerk tussen muizen die eindigde overleven en dat uiteindelijk nog verergerd op een humane eindpunt was het verlies van de restarmen reflex, onafhankelijk van de heup mobiliteit (figuur 3F). Inderdaad, tussen 20 en 48 h na de uitdaging, een totaal van 121 muizen niet het recht zich aan beide zijden, met 116 van deze muizen uiteindelijk vordert naar een humane eindpunt (waarmee een 96% nauwkeurigheid bij het identificeren van muizen die niet zou herstellen). Na 48u na de uitdaging, werden 11 muizen waargenomen niet het recht zich van beide zijden, en 10 van deze vordering aan een humane eindpunt (een 91% nauwkeurigheid). Dan 20 h na de uitdaging voorspelt het aantal muizen dat de restarmen reflex voor beide kanten verloren het eindresultaat met een nauwkeurigheid van meer dan 90%; Daarom is dit toegevoegd aan de criteria van de humane eindpunt, minimum te identificeren nonrecovering muizen eerder muis lijden (tabel 1).
De frequentie dat muizen controle moeten verandert na verloop van tijd, te wijten aan verschillende tarieven van dood postchallenge, en in tabel 1wordt beschreven. Een muis werd beschouwd als het humane eindpunt op elk gewenst moment als het naar rechts zelf had gefaald en nonmobile heup beweging aan beide zijden, weergegeven of als de muis is gevonden uit het nest, verspreid kon recht zelf, en lethargisch hip beweging had. Muizen met een van deze voorwaarden werden niet naar verwachting zal kunnen terugkeren van het nest en zijn waargenomen FTR-Nonmobile worden binnen 4-6 h. vanaf 20 h na de uitdaging, is een nieuwe humane endpoint toegevoegd omdat de gepresenteerde informatie toont aan dat de overgrote meerderheid van de muizen die FTR van beide kanten eindigt aan ziekte bezwijken.
De video's, tabellen en middelen gepresenteerd in dit manuscript zijn een effectieve onderwijs-bron voor de juiste gedrags toewijzing van uitgedaagd muizen. Zeven onderzoekers werden gevraagd de opleiding video en zowel het protocol en de tabellen lezen voordat u gedragingen aan 60 uitgedaagd dieren toewijst. De identificatie van humane eindpunt toewijzing was nauwkeurig zowel voor onderscheidende FTR-Nonmobile muizen van muizen die de andere gedragingen (figuur 4A) weergegeven en FTR muizen van muizen die konden het recht zich binnen het toegestane tijdsbestek ( Figuur 4B).
Figuur 1 : Kaplan-Meier overleving kromme cecal drijfmest dosistitraties en gewicht verandering na de uitdaging cecal drijfmest. (A) overleven uitkomst van neonatale C57BL/6J muizen met een intraperitoneaal cecal drijfmest injecteren op DOL 7 uitgedaagd. De gegevens voor dit cijfer werden van onafhankelijke experimenten met behulp van meerdere uitdaging doses, variërend van 0,7 tot 1,3 mg cecal drijfmest per gram lichaamsgewicht werd toegediend aan deze muizen samengevoegd. (B) bij pasgeborenen muizen uitgedaagd met 0,80 tot 0.95 mg cecal drijfmest per gram lichaamsgewicht van één cecal drijfmest preparaat weergeven een dosisafhankelijk relatie tussen de hoeveelheid cecal drijfmest gegeven en het percentage van overleving. ()C) het percentage verandering in gewicht in vergelijking met het gewicht van de uitdaging, met de stippellijn ter aanduiding van een 20% verlies van gewicht uit de tijd van de uitdaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : CFU concentratie in cecal drijfmest voorraad opgeslagen bij-80 ° C niet verandert over een periode van 6 maanden. Het effect van de cecal drijfmest leeftijd op CFU concentratie werd getest met behulp van lineaire regressie. Elk punt vertegenwoordigt een aliquoot gedeelte van het zelfde cecal drijfmest preparaat, serieel verdund en verguld over een periode van 6 maanden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Heup mobiliteit categorieën van muizen die niet het recht zich en dierlijke gedrag op verschillende tijden postchallenge. Muizen die zijn aangevochten met sepsis, wanneer geplaatst op hun rug, verschijnt tekenen van morbiditeit die kan worden gemeten door de mate van heup beweging. (A) A fail naar rechts (FTR)-Mobile mouse toont hip rockende beweging van hun meer dan 90 ° hoek van horizontaal bovenbeen. (B) een FTR-lethargisch muis toont hip schommelen verkeer maar niet hoger is dan 90 ° hoek van horizontaal op elk moment tijdens de 4 s van monitoring. (C) sommige FTR-Nonmobile muizen zal verlengen hun been, buigen bij de knie, maar zeer weinig (minder dan 10 ° hoeken) zal tonen aan nul hip schommelen van beweging, en de benen blijft parallel aan elkaar. (D) dierlijke gedrag 12-21 h postchallenge blijkt dat alleen FTR-Nonmobile gedrag scheiden overlevenden van de nonsurvivors. (E) van 21 tot en met 48 h postchallenge, slechts 4 uit de 592 waargenomen FTR gedrag (0,67%) behoren tot de overlevenden, waardoor de wetswijziging reflex te voorspellen van het uiteindelijke resultaat en worden gebruikt als een nieuw criterium voor humane eindpunt. (F) na 48 h postinfection, 6 uit 131 muizen (4.55%), die had een restarmen reflex ging deel uitmaken van de groep FTR en werden opgeofferd aan het einde van het experiment, aanhoudende controle in de loop van herstel te rechtvaardigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Educatieve middelen resulteren in nauwkeurige gedrags classificatie door onafhankelijke onderzoekers. Onderzoekers opgeleid door te kijken naar de video bij dit protocol video's van 60 neonatale muizen ingedeeld in groepen van verschillende gezondheid. (A) het vermogen om te onderscheiden van een humane eindpunt was vastbesloten en gemiddeld 97% van gedrag werd nauwkeurig gecategoriseerd als FTR-Nonmobile of niet, terwijl slechts 1% van FTR-Nonmobile muizen werden onrechte. Twee procent van de muizen werden ten onrechte geïdentificeerd als FTR-Nonmobile. (B) de identificatie van het tweede humane eindpunt criterium correct onderscheid te maken tussen FTR muizen of degenen met de mogelijkheid om het recht van zich binnen 4 s van gelegd op hun rug was correct toegewezen in 97% van de scorings, terwijl enige 0,96% van de muizen werden ten onrechte toegewezen als zich vergissingen en 2% van de muizen ten onrechte als FTR werden toegewezen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Ziektestadium | A: hoge morbiditeit, geen mortaliteit | B: hoge morbiditeit, lage sterfte | C: hoge morbiditeit, hoge mortaliteit | D: lage morbiditeit, mortaliteit lage |
| Uren post uitdaging | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Bewakingsfrequentie | 2 h post uitdaging | elke 4−6 h | Elke 4−6 h, 8 h, 's nachts zonder toezicht | 1−2 keer per dag, meer indien nodig |
| Percentage van totale humane eindpunten waargenomen | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Percentage van humane eindpunten waargenomen | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Humane eindpunt criteria | 1. FTR−Nonmobile aan beide zijden | 1. FTR−Nonmobile aan beide zijden | ||
| 2. verspreid van nest en is FTR−Lethargic | 2. verspreid van nest en is FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR op zowel links of rechts (met eventuele mobiliteit-score) | ||||
Tabel 1: frequentie van monitoring en humane eindpunt criteria in de verschillende stadia van de ziekte. Bewakingsfrequentie, humane eindpunten waargenomen, het percentage van humane eindpunten en humane eindpunt criteria die tijdens verschillende stadia van de ziekte.
| Wetswijziging Reflex | Mobiliteit | Termijn naar rechts na gelegd op rug | Termijn aan maatregel hoeveelheid verkeer (mobiele / lethargisch / nonmobile) | Criteria voor het scoren van mobiliteit |
| Rechten | Mobile | 4 s | Een extra 8 s | De muis neemt meerdere stappen in een rij, behoud van de dynamiek van het naar voren, en verkent zijn omgeving. Pup zal niet omvallen. |
| Lusteloos | De muis kan een stap, maar zal stoppen en pauzeren alvorens een andere. Pup kan omvallen. | |||
| Nonmobile | De muis neemt geen stappen niet na de wetswijziging zelf. Pup kan omvallen. | |||
| Mislukken naar rechts | Mobiele heupen | Dezelfde 4 s gebruikt voor het meten van restarmen reflex | Heeft energiek hip beweging met het bovenbeen roterende buiten 90° van horizontaal ten minste eenmaal binnen 4 s. | |
| Lusteloos heupen | Hip beweging tot, maar niet verder dan 90° van horizontaal. | |||
| Nonmobile heupen | Ledematen kunnen verplaatsen door uit te breiden en intrekken, maar de heupen zal niet draaien. Pup ziet er heel ziekelijk. |
Tabel 2: tabel en criteria bij het bepalen van de score van de gezondheid van muizen Monitoring. De verstrekte criteria werden gebruikt gezondheid categorie om groepen te definiëren met muizen, en om individuele afwijking bij het toekennen van de scores van de gezondheid.
Discussion
Postnatale neonatale muizen hebben zeer beperkte mobiliteit en niet het recht zich na gelegd op hun rug, zelfs als onbetwist. Door DOL 7, de leeftijd van muizen uitgedaagd in dit model, een bereik van beweging variërend van rechten-Mobile naar FTR-Mobile werd waargenomen in onbetwiste muizen, met een belangrijk verschil, namelijk dat een onbetwiste muis op deze leeftijd FTR-lethargisch gedrag niet heeft weergegeven. Alleen muizen met polymicrobial sepsis uitgedaagd werden waargenomen te worden FTR-lusteloos; deze reactie kan dus een marker van de ernst van de ziekte. Attente wordt aan de cutoff van een 90° hoek van horizontaal voor hip beweging zorgt voor de consistente en accurate toewijzing van lusteloos of mobiele hip beweging in muizen. Het tijdsbestek van 4 s om te zien als een muis zelf recht kan werd geselecteerd omdat onbetwiste muizen waren in staat om consequent het recht zich binnen dit tijdsbestek. Herhaalde meting van de dezelfde muis werd vermeden, terwijl de tijd naar rechts zelf en de meting van de heup mobiliteit werd beperkt tot 4 s, om te voorkomen dat overdreven vermoeiend de muis, die anders van invloed kan zijn op haar vermogen om het verkrijgen van voedsel en warmte en kan van invloed zijn op de prognose om beter te krijgen. Wetswijziging zelf van zowel de linker- en de rechterkant werden waargenomen, en de hoogste van de scores werd gebruikt om te bepalen als de muis op een humane eindpunt was, omdat sommige muizen werden gevonden om weer te geven van FTR-Nonmobile aan de ene kant nog een hogere mobiliteit aan de andere kant en b e kunt herstellen uiteindelijk.
Het scoresysteem gebruikt om te evalueren van de muis gezondheid vertrouwden op de toepassing van categorische cutoffs op wat een spectrum van beweging is en kon dus vatbaar voor individuele bias. Personeel was samen getraind om ervoor te zorgen dat elke persoon scoorde de muizen hetzelfde; Er zal waarschijnlijk blijven echter een niveau van subjectiviteit leidt tot variatie. De consistentie van het scoren werd geëvalueerd door het hebben van zeven onderzoekers die had niet eerder uitgevoerd het toezicht op de neonatale muis leren de vereisten die worden vermeld in dit protocol en de video en, vervolgens, onafhankelijk toewijzen van gedrag en bepalen humane eindpunt. Een nauwkeurigheid van 97% werd waargenomen met scoren uitgevoerd op 60 uitgedaagd muizen, suggereren dat individuele bias niet een belangrijke rol in het gedrags toewijzingen van dit model speelt. De gepresenteerde gedrags monitoringsprotocol is gebaseerd op observaties van dieren op DOL 7 aangevochten, maar muizen jonger dan 6 dagen in een gezonde toestand van onbetwiste kunnen niet consequent recht zelf. Dus, de criteria beschreven humane eindpunt niet kunnen worden toegepast direct op jongere muizen. Als jongere muizen worden gebruikt in dit experimenteel model of als een andere uitdaging model met andere ziekte kinetiek wordt toegepast, dan geschikt humane eindpunt criteria moeten worden ontwikkeld en geïntroduceerd om te voorkomen dat de euthanasie van muizen die zou anders, uiteindelijk, herstellen. Het scoresysteem geeft een robuuste methode voor het verbeteren van de humane eindpunt classificatie, met testen en bevestiging, mogelijk kan worden toegepast op andere modellen.
Elk preparaat van cecal drijfmest of het gebruik van een nieuwe stam van de muis vereist de retitration van de cecal drijfmest dosis te beheren om een soortgelijke letale dosis. Elk preparaat is gestandaardiseerd door de uitlezing van belang, namelijk overleven, in plaats van het geven van de dezelfde kiemen. Elke cecal drijfmest voorbereiding van levensvatbare bacteriële concentratie gevarieerd enigszins, mogelijk als gevolg van verschillen in de commensale bacteriën van de donor, of als gevolg van verschillen in het gewicht links in de cel zeef van de cecal drijfmest voorraad postfiltration. Tijdens de titratie van de cecal drijfmest, de eerste twee nestjes werden in twee groepen verdeeld en elke helft uit het nest werden uitgedaagd met één van de twee doses, zodat elk van de doses zou worden getest in twee nesten. Als de resulterende overlevingskans niet overeenkomt met het vereiste niveau, in de dan de dosis uitdaging was ofwel verhoogd of verlaagd met 5% - 10%, en het experiment herhaald. Meerdere nesten werden gebruikt om de rekening voor nest-naar-nest verschillen die kunnen leiden tot resistentie of gevoeligheid voor sepsis binnen een nestje toegenomen. Het was belangrijk om nauwkeurig de voorraad cecal drijfmest met elke nieuwe voorbereiding om ervoor te zorgen dat de nieuwe titratie van cecal drijfmest vergelijkbaar met vorige cecal drijfmest preparaten was titer. Periodes van teveel lawaai en trillingen, speciaal tijdens het comprimeren van asfalt en de bouw van een nabijgelegen gebouw en de weg, werden waargenomen te verhogen van de spanning in de dammen. Dit gecorreleerd met verhoogde tarieven van kannibalisatie en de sterfte van de experimenten van de overleving, zelfs op het gebied van onbetwiste muizen, wat erop duidt dat er vreemde effecten op neonatale overleving die ook moeten worden gecontroleerd voor kan worden beïnvloed.
Voorafgaande methoden voor cecal drijfmest voorraad voorbereiding inbegrepen het gebruik van verse cecal drijfmest of de voorbereiding van bevroren cecal drijfmest, met behulp van een verscheidenheid van methoden, met inbegrip van de opslag in glycerol die onvermijdelijk tijdens de uitdaging zou worden overgedragen. Terwijl het gebruik van verse cecal drijfmest het voordeel biedt van het hebben van een bacteriële samenstelling die zich het dichtst bij de oorspronkelijke cecal inhoud, is er het risico van variantie tussen afzonderlijke donor muizen als gevolg van de variatie van de commensale bacteriën. Terwijl dit werd geminimaliseerd door middel van cecal donoren van dezelfde leverancier met minimale tijd tussen aankomst en voortgang van het experiment, deze kon uitgegroeid tot een kosten-verbiedend optie voor sommige laboratoria en gepresenteerd een andere timing logistieke uitdaging in het hebben van leeftijd-matched muizen beschikbaar wanneer begint een cecal drijfmest experimenteren in neonatale muizen die 7 dagen oud waren. Een alternatieve methode voor het gebruik van verse cecal drijfmest werd gebruikt, waar meerdere volwassen donorlanden cecal inhoud werden gebundeld, geresuspendeerde in D5W, bevroren bij-80 ° C zonder van glycerol en ontdooid één aliquot tegelijkertijd voor de experimenten. Het gebruik van volwassen donor cecal drijfmest te bestuderen van neonatale sepsis konden potentieel overdragen soorten bacteriën aanwezig zijn in de cecal drijfmest die de neonatale muis is niet blootgesteld aan, maar het is een strategie die het mogelijk voor de studie van sepsis in neonatale muizen maakt en is gebruikt voor het bestuderen van neonatale muis biologie in de afgelopen13,14,15. Cecal drijfmest was verdund in D5W om voeding aan de bacteriën, waardoor de oprichting van een actieve infectie zodra de bacteriën werden ingespoten, en werd gedaan om te bootsen de beschikbaarheid van nutriënten in de peritoneale holte tijdens necrotiserende enterocolitis. Glycerol werd niet opgenomen als een stabilisator in de bevriezing van bacteriën vanwege de potentiële negatieve bijwerkingen, die zouden kunnen uit glycerol injectie alleen voortvloeien. Als glycerol had overgenomen in de voorbereiding van de cecal drijfmest, dan de potentiële schade die alleen glycerol kan induceren zou moeten worden getest voor door het opnemen van een alleen-glycerol (ontbreekt cecal drijfmest) injectie bij muizen, die zou zijn toegenomen muis gebruik. De levensvatbaarheid van de bacteriën van de voorraden van de cecal drijfmest na de bevriezing van de cecal drijfmest voorraad zonder glycerol is getest en bleek te zijn constant, met geen verandering in de concentratie van de bacteriën in aparte porties van de dezelfde cecal drijfmest voorbereiding opgeslagen bij-80 ° C via een 6 de maandperiode van de. Dit suggereert dat de opslag zonder glycerol in het verstrekken van een consistente biologische resultaat haalbaar is. Het gebruik van een bulk-bereid bevroren cecal drijfmest voorraad ook toegestaan voor het gebruik van muizen gefokt intern, de kosten te verlagen en gebruik makend van mannelijke muizen die anders zou teveel van fokken, dus het verminderen van verspilling van de muis.
De identificatie van mislukte uitdagingen bij muizen was het belangrijk om te voorkomen dat extra ruis toe te voegen aan het systeem. Na het ondergaan van een intraperitoneale injectie van cecal drijfmest, werden de muizen waargenomen voor de aanwezigheid van een bobbel onder de huid, die een mislukte injectie die eigenlijk subcutane was aangegeven. Muizen werden waargenomen voor lekken op de injectieplaats, zowel onmiddellijk na verwijdering van de naald en na waardoor ze een stap te zetten na de injectie, omdat muizen zou soms (zelden) lekken alleen na het verplaatsen van de ledematen van de injectieplaats door het nemen van een stap. De aanwezigheid van een verdikking of lek na de injectie resulteerde in het verwijderen van de muis van de analyse. Immers, een van deze kan leiden tot een ander resultaat als gevolg van de onjuiste hoeveelheid cecal drijfmest geïnjecteerd als een 5% verschil in uitdaging dosis geconstateerd bij latere overleven.
Cecal drijfmest uitdaging experimenten vaak nodig verschillende doel dodelijke doses met verschillende doses gewogen. Wegens dit, kunnen injectie volumes variëren van zo weinig als 20 µL en tot 100 µL. De evenredige experimentele fout geassocieerd met dode naald volume verandert ook samen met het geïnjecteerde volume, verhogen de moeilijkheid als u wilt direct vergelijken verschillende doses. Met de eenvoudige wijziging van het standaardiseren van het geïnjecteerde volume, wordt deze bron van variantie verwijderd uit het experiment.
Gedrags controlesysteem van de neonatale muis gebruikt in dit protocol is het eerste in zijn soort. Onderzoekers bedoeling op ethisch onderzoek met pasgeboren muizen worden vaak geconfronteerd met de uitdagende gebrek aan middelen om te beoordelen van het welzijn van het dier op deze leeftijd. Het gepresenteerde intuïtief en consistent monitoringsysteem begint aan deze kenniskloof. Bovenal dit bewijs gebaseerde aanpak niet alleen verhoogt de kwaliteit van de experimentele gegevens verkregen maar, tegelijkertijd, vermindert ook het lijden van de proefdieren.
Disclosures
Dr. James Wynn ontvangt steun van de National Institutes of Health (NIH) / Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen (R01GM128452) en de NIH /Eunice Kennedy Shriver Nationaal Instituut van gezondheid van het kind en de menselijke ontwikkeling (NICHD) () R01HD089939).
Acknowledgments
Speciale dank aan Claire Harrison en het dier zorg faciliteit in British Columbia kinder ziekenhuis Research Institute (BCCHR) voor hun steun in de dierlijke werk, alsmede aan Dr. Po-Yan Cheng voor hun begeleiding en inzet voor dierlijke controle en welzijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
