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Biochemistry

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/58580
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2,3,4,5
1College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

両方符号化へと非コードを結合する蛋白質を識別するためにクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) 戦略を適用するための詳細なプロトコル、Rna が表示されます。

Abstract

RNA 結合タンパク質 (Rbp) の包括的な同定は、細胞の転写制御ネットワークを理解する鍵です。RBP キャプチャのため広く使用されている戦略を悪用、起こる [多] ターゲット Rna の正体不明 non-poly(A) Rna のほとんどの結合蛋白質を残して、真核生物の成熟 Mrna に大抵起こる。ここでクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) の代謝ラベリングを組み合わせることによりポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp のトランスクリプトーム キャプチャを有効にすると呼ばれる最近報告された方法の詳細な手順を説明します。Rna は生体内でUV 架橋、bioorthogonal のタグ付け。

Introduction

様々 なタイプのコーディングおよび非翻訳 Rna (ncRNAs) Mrna、Rrna、Trna など、小さな核 Rna (目的)、核小体低分子 Rna (snoRNAs)、および長い非コード Rna (lncRNAs)1人間のゲノムを転写します。これらの Rna のほとんどは、Rbp の服を所有している、リボ核タンパク質粒子 (結合)2として機能します。したがって、Rbp の網羅的同定は、様々 な人間の病気3,4,5に関与する Rna と Rbp、間規制のネットワークを理解するための前提条件です。

過去数年間は、様々 な真核生物システム2,6、人間7,8,9,10,11, を含む発見 Rbp の大きな後押しを目撃しています。マウス12,13,14, 酵母9,15,16, ゼブラフィッシュ17,キイロショウジョウバエ18,19、線虫16、シロイヌナズナ20,21,22、および人間の寄生虫23,24,25.これらの進歩は、カステッロらによって開発された RBP 捕獲作戦によって促進されています。7 Baltzら2012生体内でUV 架橋 RNA と相互作用するタンパク質、Rna、ポリ a のランダムプライマー キャプチャおよび質量分析法 (MS) を組み合わせた8 -プロテオームのプロファイリングに基づきます。しかし、その多は大抵のみ ~ 3% % を占める - 5 真核生物のトランスクリプトーム26の成熟した mrna 発現に存在している事実を考えるとこの広く使用されている戦略はありません Rbp non-poly(A) Rna が、ほとんど ncRNAs を含むとの相互作用をキャプチャできます。Mrna。

ポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp27のトランスクリプトーム捕獲のための最近開発された戦略の手順の詳細を報告する.CARIC と呼ばれる、この戦略は生体内でUV 架橋と (クリック反応に参加することができます bioorthogonal 機能グループを含んだ) 活性型と「クリック」のヌクレオシド アナログ、rna 代謝ラベリングを組み合わせた 4-thiouridine (4SU)、および 5-ethynyluridine (EU)。CARIC 戦略と理想的な結果を得るための鍵となる手順は、効率的な代謝ラベリング、UV 架橋・ クリック反応と RNA の整合性の維持です。Cu(I) クリック反応の触媒として使用される Rna の断片化が発生することができます、ため RNA 断片化を減らすことができる Cu(I) リガンドは不可欠です。我々 は RNA の劣化を引き起こすことがなくセル lysates の効率的なクリック反応を実行する方法について説明します。

RBP をキャプチャ、HeLa 細胞の同定のみこのプロトコルに記載されては、様々 な細胞タイプにして生物 CARIC 戦略を適用できます。RBP キャプチャ以外にもこのプロトコルはまた MS 試料調製とタンパク質の同定及び定量プロテオミクス実験に慣れていない人のために役立つことができる合理化されたステップバイ ステップの手順を提供します。

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Protocol

注意: 該当する場合、使用する試薬が RNase フリー フォームで購入または RNase フリーで溶剤に溶解 (ピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) で、ほとんどの場合-処理水)。RNA のサンプルおよび RNase フリー試薬を処理する場合は常に手袋とマスクを着用、RNase の混入を避けるために頻繁にそれらを変更します。

1. のライセートの調製代謝ラベルと UV 架橋細胞

  1. EU と 4SU の代謝設立
    1. 培養 HeLa 細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン、37 ° c 5% CO2の大気中での 100 μ g/mL ストレプトマイシンと。実験準備文化 〜 107 HeLa 細胞 (2品) 15 cm x 4 または 1 つは標準的な MS を実行サンプルを制御します。
    2. HeLa 細胞に達する合流 〜 80% と、培養培地を削除し、15 cm 皿につき新鮮な培地 prewarmed 15 mL を追加します。
    3. EU (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で解散) を最終濃度 1 mM の 100 mM の皿あたり 15 μ L と最終濃度 0.5 mM に 100 mM 4SU (PBS で解散) の皿あたり 7.5 μ L を追加実験と noUV コントロールのサンプル。No4SU コントロールのサンプルに 1 mM の最終的な集中に 100 mM (PBS で解散) EU の皿あたり 15 μ L を追加します。
      注: 4SU は写真アクティブ化可能です。したがって、4SU を追加した後の光からの保護が必要です。
    4. アルミホイルでお皿をカバーし EU と 4SU またはステップ 1.1.3 実験・ noUV ・ no4SU コントロールのサンプルからのみの EU の量の半分それぞれ、16 h. 追加の細胞の培養し、別 2 時間培養を続けます。
  2. 生体内でUV 架橋
    1. 洗い、3 セル、培養培地を削除 5 ml の一皿、PBS と可能な限り削除残留 PBS の x。
      注: 残留液体架橋効率大幅に削減されます。
    2. 実験と no4SU コントロール サンプル、お皿を蓋をはずさないと氷の場所および 365 nm 紫外線 UV 架橋剤によって 2 J/cm2を細胞に照射します。
    3. NoUV コントロール サンプルの氷の上の皿を置くし、光から身を守る。
      注: noUV コントロールのサンプルのすべての次の手順は暗い部屋で実行する必要があります。
  3. セル換散と均質化
    1. 前の換散バッファーの皿あたり 1 mL を追加 (10 mM Tris∙HCl、pH 7.5、50 mM LiCl、0.02% ノニデット P-40、エチレンジアミン酸 (EDTA)-無料プロテアーゼ阻害剤カクテル) セルに。ゴム携帯リフターを使用して細胞をこすり、15 mL チューブに事前溶解懸濁液を収集します。
      注: この手順は、細胞膜を破る、可溶性細胞質タンパク質と Rna がリリースされます。しないでチューブを遠心し、上清を除去します。
    2. 2 つの 15 cm 料理からサスペンション、事前溶解バッファーを追加して 6 mL にボリュームを調整します。事前溶解サスペンション R 換散バッファー (200 mM Tris∙HCl、pH 7.5、500 mM LiCl、2% リチウム dodecyl 硫酸塩 [LDS]) の等しいボリュームに追加します。
    3. を介して渡すことによって注射器と細い針 (27 G) 数回ライセート、はっきりと同種まで細胞ライセートを均質化します。ライセート緩やかな回転 (rpm ~ 15) 1 h の 4 ° C で孵化させなさい。
      注: この最後のステップでは、タンパク質の完全な変化ができるようなります。ライセート安全に保存できる-70 ° C で 1 ヶ月。
  4. クリック反応のための準備
    1. 希釈バッファー (50 mM Tris∙HCl、pH 7.5) の 20 のボリュームを追加することによって、ライセートを希釈し、15 mL の一部分にそれを分割します。
      注: 塩と洗剤の高濃度を含む溶液は銅 (I) の効率が侵害されます-をクリックして反応を触媒したがって、ライセートのバッファーを変更する必要があります。
    2. ボリュームが 1 mL 未満まで 15 mL 限外ろ過チューブ (付き 10 kDa の分子量カットオフ) を使用して、各画分を集中します。4,000 x g 〜 15 分のための 4 ° c で限外ろ過チューブを回転させるスイング バケツの回転子を使用します。
    3. 集中溶解画分に 14 mL の希釈バッファーを追加し、1.4.2 の手順を繰り返します。分数を組み合わせるし、限外濾過 (4,000 x g 〜 15 分のための 4 ° c) で 6 mL の容積にそれらを集中します。
      注: ほとんどの塩と LDS が、今は、削除するライセートのクリック反応できるように。ライセートは、1 週間-70 ° C で保存されることができます。彼らは重要な RNA の劣化になりますので、複数の凍結融解サイクルを避けてください。因数ライセート小規模特徴づけが必要な場合。

2. RNA インタラクトームの試料の調製をキャプチャします。

  1. ライセートの preclearing
    1. ライセート、6 mL あたり 100 μ L ストレプトアビジン磁気ビーズを追加し、優しく自然ビオチン化タンパク質を除去するために室温で 30 分間 (~ 15 rpm) を回転します。
    2. (4 ° c 〜 20 分) のための磁石と、職員への贈り物転送新しいチューブに lysate を使用してビーズをペレットします。
  2. クリック反応性
    1. 反応混合物の準備: ビオチン株式 (100 mM アジ化-ビオチン ジメチルスルホキシド [DMSO] 100 μ M の最終濃度に溶解)、6.5 μ 銅在庫の 3.25 μ L (から作るので新鮮; 1 M CuSO4最終 500 μ M の濃度で水に溶解)、リガンド株式 (200 mM 2 mM の最終濃度で水に溶解した THPTA) の 65 μ L と 262.75 μ H2o.
      注: THPTA は、トリス [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) メチル] アミンの略です。
    2. 職員への贈り物の 6 mL の溶解液に反応混合物を加え、よく混ぜます。その後、試薬を減らす 162.5 μ L を追加 (から作るので新鮮。 アスコルビン酸ナトリウム 40 mg/mL, 最終濃度 5 mM) ライセートを混ぜる。最終巻は、6.5 mL をする必要があります。
    3. 軌道シェーカー (約 800 rpm) で室温で 2 時間反応混合物を孵化させなさい。5 mM EDTA を反応混合物に追加し、反応を癒やすための 5 分のためにそれを孵化させなさい。
  3. 小規模の特徴
    1. 染料株式 (例えば、100 mM アジ化-Cy5 DMSO に溶解) 置き換えビオチン ストック ステップ 2.2.1 のように反作用の組合せを準備します。
      注意: 試薬量は溶解液の量に応じて調整する必要があります。通常、ライセートの 20 μ L 因数はゲルの蛍光分析などの特徴づけのために十分であります。
    2. ライセートを反応混合物を追加し、室温で 2 時間インキュベートします。LDS のサンプル バッファー (4 x) の体積の 3 分の 1 を加えます、55 ° C、5 分で変性し、10% ビス トリス ゲルのサンプルを解決します。
      注: Rna の蛍光信号が送信されるを確認、クリック反応後の RNase A 消化のコントロールが含まれます。
  4. 反応混合物の清掃
    1. 急冷反応混合物に prechilled メタノール (100%) の 8 つのボリュームを追加し、降水量の-30 ° C で 30 分間インキュベートします。50 mL コニカル遠沈管の沈殿物を実行します。
      注: 総容積が 50 mL 以上の場合は、2 つの 50 mL コニカル遠沈管に反応混合物を分割します。
    2. 再構築バッファーの準備: バッファー B (1 %50 mM、150 mM の NaCl、ブリッジ ・ 97 トリエタノールアミン、pH 7.4) の 8 つのボリュームと (4% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 [SDS] と 10 mM EDTA) バッファー A の 1 つのボリュームを組み合わせます。
    3. 4 ° C で 15 分間 4,000 x gで遠心し、上澄みを廃棄します。Prechilled メタノールの 1 〜 2 mL をペレットに追加します。上下のピペット餌を壊すし、ペレットはない目に見える塊と完全に中断されていることを確認します。Prechilled メタノールで管を埋めます。2 x この手順を繰り返します。
    4. 4 ° C で 15 分間 4,000 x gで遠心し、上澄みを廃棄します。チューブと再び 4,000 x gで 5 分間遠心は慎重にペレットを乱すことがなく、できるだけ残留メタノールを引き出すバックを置きます。
    5. ペレットに 10 mL の溶解バッファーを追加します。ペレットを溶解するため、上下のピペットします。4,000 x gで 4 ° C で 10 分間遠心
    6. 上清を新しいチューブに転送します。品質管理 (セクション 4 を参照) のためのサンプルの 20 μ L を収集します。
      注: 今、サンプル RNA インタラクトーム キャプチャの準備です。再構成されたサンプルは 1 週間-70 ° C で保存できます。

3. RNA インタラクトーム キャプチャ

  1. ストレプトアビジン アガロース ビーズの作製
    1. 15 mL コニカル遠心管にストレプトアビジン agarose スラリー (定住ビードの 800 μ L) 再構成サンプル 10 mL あたりの 1,600 の μ L を取る。
    2. スピン ・ ダウン 4000 x gでビーズの 5 分は、定住のビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に取り外します。
    3. 10 ml の 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5) のビーズを洗浄します。ビーズ (4,000 x gで 5 分) スピンダウンし、上清を削除します。2 x この手順を繰り返します。
  2. アフィニティ プルダウン
    1. (手順 3.1 参照) ストレプトアビジン アガロース ビーズにステップ 2.4.6 からクリーンアップおよび再構成サンプルを転送します。4 ° C で緩やかな回転で一晩インキュベートします。
  3. ストレプトアビジン ビーズの洗浄
    1. ビーズ (4,000 x gで 5 分) を回転し、上清を新しいチューブに転送します。品質管理のためのサンプルの 20 μ L を収集します。
    2. 10 ml の洗浄バッファー (PBS、pH 7.4 で 2% の SDS) のビーズを洗浄します。緩やかな回転 (rpm ~ 12) 室温で 10 分間インキュベートします。ビーズ (4,000 x gで 5 分) スピンダウンし、上清を削除します。1 x を繰り返します。
    3. 3.3.2 洗浄バッファー B (8 M 尿素と 250 mM NH4HCO3を水に溶解) の手順を繰り返します。3.3.2 洗浄バッファー C の手順を繰り返します (PBS、pH 7.4 で 2.5 M の NaCl)。10 ml の 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5) のビーズを洗います。ビーズ (4,000 x gで 5 分) スピンダウンし、上清を削除します。
    4. ビーズを均等に分割し、2 つの 1.5 mL 遠心チューブにそれらを転送します。
  4. キャプチャされた結合の溶出
    1. ビオチン溶出バッファーを準備: ビオチン 12.5 mM、75 mM の NaCl、7.5 mM Tris∙HCl (pH 7.5)、1.5 ミリメートルの EDTA、0.15 %sds、0.075 %sarkosyl、デオキシ コール酸ナトリウム 0.02%。
      注: ストア室温、ビオチンでバッファーがあります沈殿 4 ° C で
    2. 洗浄の解決されたビードの 400 μ L は、ビオチン溶出バッファーの 400 μ L を追加します。
    3. 室温で 20 分間のシェーカー (1,500 rpm) が軌道にそれらを孵化させなさい。ビーズ (7,800 × gで 1 分) を 10 分スピン熱ブロック (1,500 rpm、65 ° C) と軌道シェーカーでインキュベートし、溶出の要件を収集します。
    4. 、ビーズに新鮮なビオチン溶出バッファーの 400 μ L を追加し、手順 3.4.3.2 つ結合は 1 つの 15 mL チューブに溶け。
  5. RNase 消化
    1. SDS の濃度を減少する溶出 RNP に希釈バッファーの 3 つのボリュームを追加します。0.5 mL 限外ろ過チューブを使用して希釈したサンプルを集中 (; 10 kDa の分子量カットオフと 4 ° C ~ 30 分で 12,000 × gでスピン) ~ 40 μ L に。
    2. 0.5 μ g/μ L RNase A を追加し、架橋 Rna から Rbp を解放する 37 ° C で 2 時間インキュベートします。2 μ L Rbp の品質管理 (セクション 4 を参照) を収集します。

4. 品質管理

  1. アフィニティ プルダウンの効率の制御
    1. 3.3.1 のステップから"プルダウン後の「サンプルのステップ 2.4.6 と 10 μ l から「前にプルダウン」サンプルの 10 μ L を取る。
    2. 標準的な西部のしみプロシージャ (10% ビス トリス ゲル) を使用してサンプルを分析します。
    3. ストレプトアビジン-HRP 共役」プルダウン後の「サンプルの残留ビオチン信号を監視するポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を染色します。
      注:"プルダウン後の「サンプルのビオチン信号の「前にプルダウン」サンプルの信号の 5 分の 1 よりも大きい場合は、ストレプトアビジン アガロース ビーズ 3.1.1 の手順で使用量を増やします。
  2. 総捕集効率の制御
    1. 「前にプルダウン」サンプルのステップ 3.5.2 と 0.5 μ l からリリースされた RBP サンプル 2 μ l を取る (0.1% 入力) から一歩 2.4.6。
    2. 銀染色法の標準の手順を使用してサンプルを分析します。
      1. 固定バッファー (40% のエタノール、10% 酢酸) 20 分 30 分間感作性 (Na2S2O313 mM、83 mM 酢酸ナトリウム、エタノール 30%) の順でゲルを固定します。
      2. ゲル 3 を洗って 5 分水で x、ゲル 2 の 15 mM 20 分洗浄アグノ3ソリューションで染色し、1 分の水で x 0.24 M Na2CO3と 0.012% のホルムアルデヒドの開発し、suffici 染色ですが、45 mM EDTA で終了耳鼻咽喉科。
        注: キャプチャした Rbp の銀染色強度は 0.1% 入力のようなする必要があります。

5 MS のサンプルの準備

  1. ゲル撮影した Rbp のトリプシンの消化力28
    1. 3.5.2 のステップからリリースされた RBP サンプルに SDS サンプルバッファー (5 x) の 4 分の 1 ボリュームを追加します。95 ° C 10 分でサンプルを変化させなさい。
    2. 1.5 mm 10 %sds ポリアクリルアミドのゲルの Rbp を解決します。
    3. 銀、次の標準的なプロトコルとゲルを染色します。
    4. 実験的サンプルまたはスタッキングのゲルとコントロールのサンプル (~ 15 kDa) 削除 RNase の主要なバンドのレーンを切除します。
    5. 小さな断片 (1 〜 1.5 mm × 1 〜 1.5 mm) に摘出したレーンをカットします。
      注: ゲルの部分の短辺は、ピペット チップの目詰まりを防ぐために 1 mm より短くする必要があります。
    6. 微量遠心チューブにゲル部分を転送し、染め色のバッファー (100 mM Na2S2O3の平等なボリュームの混合物および 30 mM K3[Fe(CN)6]) をすすぐ。
    7. ゲル部分が全く無色まで 200 mM 重炭酸アンモニウム (ABC) 入りのゲルを洗います。
    8. きちんとしたアセトニ トリル (ACN) の 1 mL のゲル部分を脱水します。10 mM ジチオトレイトール (50 mM ABC で解散) の 200 μ L で水分補給し、45 分の 56 ° C で孵化させなさい。
      注: 完全に脱水ゲル部分は非常に堅く、不透明にする必要があります。脱水後はゲル部分がまだ柔らかくて、ACN を削除し、再度脱水するきちんとした ACN の 1 mL を追加します。
    9. 部屋の温度にゲル部分を冷やします。58 mM ヨードアセトアミド (50 mM ABC に溶解) 200 μ L を追加し、暗闇の中で 45 分間室温でインキュベートします。
    10. 水で簡単な洗浄後きちんと ACN の 1 mL のゲル部分を脱水します。
      注: ゲル部分する必要があります完全にステータス退避済み。
    11. 10 ng/μ L トリプシン (50 mM ABC で解散) の適切な量とゲル部分を水分補給し、37 ° C 12-16 時間で孵化させなさい。
      注: のゲル部分は、ない不透明なコアを完全に復元する必要があります。余分な液体を削除します。
  2. 安定同位体ジメチル消化ペプチドの標識29
    1. 抽出バッファーの 200 μ L の追加によってゲル部分から消化ペプチドを抽出 (5% ギ酸と 50% 水で ACN) と (1,200 の rpm) で 30 分の 37 ° C で incubate。
    2. 5.2.1 手順を繰り返します 2 倍。1 つの遠心管に抽出物を組み合わせます。
    3. 真空遠心分離で抽出したペプチドを乾燥します。
    4. 100 mM triethylammonium 重炭酸塩 (TEAB、pH 8.5) の 200 μ L 中のペプチドを再構成します。
      注意: 手順 5.2.4 - 5.2.6 はヒューム フードの氷は実行する必要があります。
    5. 4% CH2O の 4 %13CD2O 実験の μ L とコントロール サンプルの 8 の 8 μ L をそれぞれ追加します。
      注: 安定同位体標識のバイアスを制御するスワップの安定同位体実験および他の生物学的に独立した複製のサンプルを制御します。
    6. 0.6 M NaBH3CN の 8 μ L を追加 (作るので新鮮) とよく混ぜます。
    7. ボルテックスで 1 時間室温でサンプルをインキュベートします。
    8. 氷のサンプルを冷やします。1% アンモニア水溶液の 32 μ L の追加によって反作用を癒します。さらにギ酸の 16 μ L の追加によって反作用を癒します。
    9. 1 つの遠心管に対応するコントロールのサンプルで実験サンプルを結合します。サンプルを真空遠心分離で乾燥します。
  3. ジメチル - ペプチドの分画
    1. 停止および行く抽出のヒント (StageTips)30を準備します。
      1. 拡張長さ 10 μ L チップ C18 膜に挿入します。
      2. 先端に ACN で中断高 pH C18 ビーズの 300 μ g を追加します。
      3. 自家製ラック先端を安定させることができますし、下端から先端を持ち上げると微量遠心チューブに直立した先端を配置します。
      4. 流れを 1,400 x gで 2 分間破棄で先端をスピンします。
      5. 80% の 50 μ L で先端を洗浄で 10 mM の ABC (pH 10.0) ACN。1 x を繰り返します。
        注: は、28% アンモニア水を追加することによって 10 mM ABC 溶液の pH を調整します。
      6. 50% の 50 μ L で先端を洗浄で 10 mM の ABC (pH 10.0) ACN。1 x を繰り返します。
      7. 10 mM ABC (pH 10.0) の 50 μ L で先端を洗浄します。1 x を繰り返します。
    2. 10 mM ABC (pH 10.0) の 50 μ L 中のペプチドを再構成します。
    3. 準備の先端に再構成されたサンプルを追加します。効率的なペプチド結合を確保するためのヒントへの流れを再読み込みします。
    4. 10 mM ABC (pH 10.0) の 50 μ L で先端を洗浄します。1 x を繰り返します。
    5. 50 μ L 6%、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%、40%、80% と 6% の 12 画の段階のペプチドの溶出で 10 mM の ABC (pH 10.0) ACN。
    6. 等しい間隔で 2 つの分数を組み合わせる (分数 1 7、8 と 2 などなど) 6 を取得する分数を組み合わせます。
    7. サンプルを真空遠心分離で乾燥します。-30 ° C で乾燥したペプチドを格納できます。

6. MS およびデータ解析のパフォーマンス

  1. 液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法によってペプチド分析
    1. 0.1% ギ酸を含む水のステップ 5.3.7 の 15 μ L から乾燥ペプチド画分を再構成します。(PH が 3 未満である) の pH ストリップ上のソリューションの 1 μ L スポッティングして再構成されたペプチドの pH をチェックします。
    2. 西川サンプルを液体クロマトグラフィー (LC) カラムに注入します。高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で溶媒 (溶剤溶剤 B, 0.1% ギ酸を含む水は、0.1% ギ酸を含む ACN です) の適切なグラデーションを適用します。溶剤 B の典型的なグラデーションのとおりです: 40 分; 5-35%4 分の 35-70%10 分の 75% で開催。
    3. エレクトロ スプレーで溶離されたペプチドはイオン化し、データ依存型モードで質量分析計を動作します。15 の最も豊富なイオンを選択 (積: 2 +、3 +、またはより高い) 初期の MS でタンデム質量分析 (MS/MS) スキャン (衝突誘起解離、CID) のスキャンします。動的除外サイズを 25 の最大継続時間を 500 に設定 s。
  2. タンパク質の同定と定量 MaxQuant を使用して31
    1. 0.01 タンパク質同定の偽の発見率 (FDR) を設定し、精度と信頼性を高めるためにユニークなペプチドの数を 2 に設定します。
    2. セットの最小限必要な比カウント (ユニークな + かみそり) 2、および有効にする再を定量化するプロテインの定量と関数の実行の間に一致のため。
  3. R/Bioconductor パッケージ limma を用いた濃縮意義の評価32
    1. モデレートtを実行-テストの少なくとも 3 つの生物学的複製からゼロに対して Log2 フォールドの変更をテストするのには limma で実装されました。Read.table関数を使用して、データ テーブルを読み取ります。データフィッティングのためlmFitとeBayes関数を使用して。計算結果 (Log2 フォールドの変更を平均値とP値を含む) をエクスポートするのには、 topTable関数を使用します。
    2. FDR を制御するため Benjamini-ホフベルク メソッドを使用して、 P値を修正します。
    3. 大幅に実験サンプルの濃縮タンパク質のリストを生成する 0.01 の FDR を適用します。さらに制御偽陽性の 2 つまたは 3 倍の変更のカットオフを設定します。

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Representative Results

品質管理手順の代表の結果が掲載されています。結果には、2.3.2 (図 1) の手順で説明されているゲルの蛍光分析、4.1.3 (図 2 a) の手順に従って西部のしみの分析と手順 4.2.2 (図 2 b) で説明した銀染色分析の数字が含まれます。品質管理の手順は、CARIC プロトコルの最適化のために重要です。品質管理は、大規模の RBP 同定実験の準備常にあります。

Figure 1
図 1: ゲル 2.3.2 の手順に記載されているラベルをクリックしますサンプルの蛍光分析します。(A) このパネル番組典型的なゲルの蛍光ラベルをクリックしますサンプルのパターンに。二重標識サンプルのみでは、架橋結合の信号を表す高分子量 (> 250 kDa) で強いにじみバンドを示します。4SU EU またはダイジェスト RNase a. と省略する RNP 信号を廃止するには低分子量で背景のシャープなバンドは非特異的タンパク質を標識の信号を表します。(B) no4SU コントロール サンプルではいくつかの場面で強いまみれてバンド (~ 130 250 kDa) を観察できます。このバンドは、ほとんどの場合、熱変性の間に低下するラベル付きの uncross-リンクされた Rna の信号を表します。後続の手順で邪魔にならず。CBB = Coomassie 鮮やかな青色。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 親和性プルダウン効率とキャプチャした Rbp の品質管理。(A) このパネル、ビオチンの西部のしみの分析プルダウン (清) 後のプルダウン (入力) する前にサンプルとサンプルの信号を示しています。残りの信号の比を推定し、3.1.1 のステップで使用されるビーズ量を最適化します。(B) このパネルは、0.1% 入力総蛋白質と比較してキャプチャした Rbp の銀染色法の分析を示しています。HeLa 細胞の全体的な一般的なキャプチャ効率 ~0.05% - 入力蛋白質の 0.1% であります。この値は異なる種類の細胞代謝標識効率の差異により大きく異なります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: CARIC の代表 MS 結果。(A) このパネル表示、平均火山プロット Log2 倍変更し、調整P値が limma パッケージによって計算量の蛋白質を示しています。> 2 の Log2 倍変動と < 0.01 の調整P値蛋白質の 597 は「CARIC Rbp」として分類されました。(B) このパネルでは、以前に識別された人間多 Rbp7,8と CARIC 蛋白質,9,10,11の重複を示しています。重複したタンパク質、Rbp、コーディング主非 - コーディング Rbp CARIC Rbp の残りの部分が多い。この図は、以前に発行された仕事27国立科学アカデミーの許可を得てから、転載です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

公正な RNA の整合性の維持は、CARIC 実験の成功へのキーの 1 つです。Cu(I) と慎重な作戦の適切な配位子、RNA の劣化が大幅に削減、部分的な低下が観察されたが。EU の実験サンプルに 4SU 置換率は、それぞれ 1.18% と 0.46% (データは示されていない)。2,000 の長さでそのまま Rna の nt、Rna の ~ 90% 含まれている少なくとも 1 つの EU と 1 つの 4SU。1,000 の長さに部分的に劣化した Rna の nt、Rna の ~ 70% 含まれている少なくとも 1 つの EU と 1 つの 4SU。したがって、Rna の部分的な分解が大幅に減らない CARIC、効率劣化は受け入れられません。

もう一つの重要なステップは、ステップ 1.4、クリック反応のための準備です。銅 (I)-Rna の触媒クリック反応は LDS 濃度に敏感。LDS の高濃度 (> 0.1%)、EU を含む Rna 上の信号および蛋白質 (データは示されていない) でのバック グラウンド信号の増加のラベリングの減少に します。

EU、に加えて、CARIC もアデノシン33,34,35,36アルキニルとアジドフェニル類縁体など、その他のクリック可能なヌクレオシドとの互換性です。ただし、CARIC のアプリケーションはかなり関心の生物学的システムに不自然なクリック可能なヌクレオシドの代謝効率によって制限されます。したがって、このプロトコルで示した以外の条件を使用して CARIC を実行、する前に常にチェック代謝ラベリング効率 (例えば、蛍光イメージングによる)。

最近では、Rna とタンパク質を架橋する 254 nm の紫外線を使用して総 Rna のラベルに EU のみが組み込まれています、リック (クリックケミストリーを用いた新規転写 RNA インタラクトームのキャプチャ) と呼ばれる同様の戦略報告37であった。特に、254 nm の紫外線は、EU と同様、すべての 4 つの自然なヌクレオシドをアクティブ化できます。したがって、254 nm の紫外線照射は無料 EU とその代謝物 (例えばEU の隣酸塩) を架橋可能な偽陽性として考慮する必要があります対応する結合タンパク質と可能性があります。

CARIC の 1 つの魅力的なアプリケーションは、細菌の Rna は大抵非 polyadenylated Rbp を識別することです。Rbp の大規模な同定は細菌38転写規則の分子基盤を理解する非常に貴重なリソースを提供します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、国立自然科学基礎の中国の助成金 91753206、21425204 と 21521003 とキーの研究と開発プロジェクト 2016YFA0501500 によってサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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References

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(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定
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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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