Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteïnen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/58580
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2,3,4,5
1College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Abstract

Een uitgebreide identificatie van RNA-bindende proteïnen (RBPs) is de sleutel tot het begrijpen van de posttranscriptional regelgevende netwerk in cellen. Een veel gebruikte strategie voor het vastleggen van RBP exploiteert de polyadenylatie [poly(A)] van doel de RNAs, die meestal op eukaryotische volwassen mRNAs optreedt, meeste bindende proteïnen van non-poly(A) RNAs ongeïdentificeerde verlaten. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures van een onlangs gerapporteerde methode genoemd Klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangst (CARIC), waarmee de transcriptome bestrijkende inname van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs door het combineren van de metabole etikettering van RNAs, in vivo UV dwarsbinding, en bioorthogonal coderen.

Introduction

Het menselijk genoom is omgezet in de verschillende soorten codering en noncoding RNAs (ncRNAs), met inbegrip van mRNAs, rRNAs, tRNAs, kleine nucleaire RNAs (snRNAs), kleine nucleolar RNAs (snoRNAs) en lang niet-coderende RNAs (lncRNAs)1. De meeste van deze RNAs bezitten kleding van RBPs en fungeren als ribonucleoprotein deeltjes (RNPs)2. Een uitgebreide omschrijving van de RBPs is daarom een noodzakelijke voorwaarde voor een goed begrip van het regelgevende netwerk tussen RNAs en RBPs, die is betrokken bij verschillende ziekten bij de mens3,-4,5.

De afgelopen jaren getuige geweest van een geweldige impuls van RBPs ontdekt in diverse eukaryotic systemen2,6, met inbegrip van menselijke7,8,9,10,11, muis12,13,14, gist9,15,16, zebravis17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, en menselijke parasieten23,24,25 . Deze voorschotten hebben bevorderd door een RBP vangen strategie ontwikkeld door Castello et al. 7 en Baltz et al. 8 in 2012, die combineert in vivo UV cross-linking van RNA haar interacterende eiwitten, oligo(dT) van poly(A) RNAs en vastleggen massaspectrometrie (MS)-gebaseerd proteomic profilering. Gezien het feit dat poly(A) meestal op volwassen mRNAs, die goed zijn voor slechts ~ 3-5% van de eukaryote transcriptome26, bestaat is deze gebruikte strategie echter niet geschikt voor het vastleggen van de RBPs interactie met non-poly(A) RNAs, met inbegrip van de meeste ncRNAs en pre-mRNAs.

Wij rapporteren hier, de gedetailleerde procedures van een onlangs ontwikkelde strategie voor de vangst van de transcriptome bestrijkende van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs27. CARIC genoemd, deze strategie combineert in vivo UV dwarsbinding en metabole labelen van RNAs met photoactivatable en "aanklikbaar" nucleoside-analogen (die bevatten een bioorthogonal functionele groep die klik reactie kan deelnemen), 4 - thiouridine (4SU), en 5-ethynyluridine (EU). Stappen die zijn de sleutel tot het ideale resultaten met de CARIC strategie zijn efficiënte metabole labeling, UV-dwarsbinding en klik op reactie en de handhaving van de integriteit van het RNA. Omdat Cu(I) gebruikt als de katalysator in Klik op reactie leiden de versnippering van de RNAs tot kan, is een Cu(I) ligand die RNA fragmentatie verminderen kan is essentieel. We beschrijven hoe u efficiënt Klik reacties in cel lysates zonder ernstige achteruitgang van RNA veroorzaakt.

Hoewel RBP vangen en identificatie in HeLa cellen alleen in dit protocol wordt beschreven, kan de CARIC strategie tot verschillende celtypes, en eventueel aan levende organismen worden toegepast. Naast RBP vastleggen bevat dit protocol ook gestroomlijnde stapsgewijze procedures voor de bereiding van de monsters van de MS en eiwit identificatie en kwantificering, die kan nuttig zijn voor degenen die niet vertrouwd zijn met proteomic experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Indien van toepassing, de gebruikte reagentia moeten worden ingekocht in de vorm van RNase-vrij, of ontbonden in RNase-vrij, oplosmiddelen (voor de meeste gevallen, in diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water). Bij het verwerken van RNA samples en RNase-vrije reagentia, altijd dragen van handschoenen en maskers, en wijzig deze regelmatig RNase om besmetting te voorkomen.

1. bereiding van Lysate van metabolisch label en UV kruislings gekoppelde cellen

  1. Metabole omzetting van EU- en 4SU
    1. Cultuur HeLa cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 . ~ 4 x 107 HeLa cellen (in twee 15 cm schotels) cultuur voor het voorbereiden van een experimentele of controle monster voor een die standaard MS uitvoeren.
    2. Wanneer de gekweekte HeLa cellen ~ 80% samenvloeiing bereiken, verwijderen van het kweekmedium en voeg 15-mL verse medium voorverwarmde per 15 cm schotel.
    3. Voeg 15 μL per schotel van 100 mM EU (opgelost in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)) om een eindconcentratie van 1 mM en 7,5 μL per schotel van 100 mM 4SU (ontbonden in PBS) om een eindconcentratie van 0.5 mM voor experimentele en noUV-controlemonsters. 15 μL per schotel van 100 mM EU (ontbonden in PBS) toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM voor no4SU-controlemonsters.
      Opmerking: 4SU is foto-gevechts; bescherming tegen licht na het toevoegen van 4SU is dus vereist.
    4. Bedek de gerechten met folie en cultuur van de cellen voor 16 h. toevoegen de helft van het bedrag van de EU en de 4SU of de EU alleen uit stap 1.1.3 aan de experimentele, noUV- en no4SU-controlemonsters, respectievelijk, en blijven kweken voor een ander 2 h.
  2. In vivo UV dwarsbinding
    1. Verwijderen van het kweekmedium, wassen van de cellen 3 x met 5 mL PBS per schotel, en verwijder residuele PBS zoveel mogelijk.
      Opmerking: Residu vloeistof zal cross-linking efficiëntie aanzienlijk verminderen.
    2. Voor experimentele en no4SU-controlemonsters, plaatst u de gerechten op het ijs met het deksel verwijderd en bestralen van de cellen met 365 nm UV licht op 2 J/cm2 door een UV-cross-linker.
    3. Voor noUV-controlemonsters, plaatst u de gerechten op ijs en ze beschermen tegen licht.
      Opmerking: Alle volgende stappen voor noUV-controlemonsters moeten worden uitgevoerd in een verduisterde ruimte.
  3. Lysis van de cel en homogenisering
    1. Voeg 1 mL per schotel van pre lysis buffer (10 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 50 mM LiCl 0,02% Nonidet P-40 en ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gratis protease inhibitor cocktail) aan de cellen. Schrapen van de cellen met behulp van een rubberen cel lifter en het verzamelen van de lysis van de pre-suspensie in een tube van 15mL.
      Opmerking: Deze stap zal breken de celmembraan en de vrijkoming oplosbare cytoplasmatische eiwitten en RNAs. DO NOT centrifugeren van de buis en verwijder de bovendrijvende substantie.
    2. Voor de schorsing van twee 15 cm schotels, het volume tot 6 mL door toevoeging van pre lysis-buffermengsel. Voeg toe aan de lysis van de pre-schorsing een gelijk volume van R-lysis buffer (200 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 2% lithium dodecyl sulfaat [LDS-]).
    3. Meng de cel lysate door het passeren van het door middel van een spuit met een smalle naald (27-G) meerdere malen tot de lysate duidelijk en homogeen is. Incubeer de lysate bij 4 ° C met zachte rotatie (~ 15 rpm) gedurende 1 uur.
      Nota: Deze laatste stap zal toestaan de volledige denaturering van eiwitten. De lysate kunnen worden veilig opgeslagen bij-70 ° C voor maximaal een maand.
  4. Voorbereiding Klik op reactie
    1. Verdun de lysate door toevoegen van 20 delen van verdunning buffer (50 mM Tris∙HCl, pH 7.5) en verdeel het in 15 mL breuken.
      Opmerking: Oplossingen die bevatten een hoge concentratie van zout en afwasmiddel in gevaar zal brengen de efficiëntie van de Cu (I)-gekatalyseerde reactie Klik; de buffer van de lysate moet dus worden gewijzigd.
    2. Concentreren elke breuk met behulp van een buis 15 mL ultrafiltratie (met een molecuulgewicht cutoff van 10 kDa) tot het volume kleiner dan 1 mL is. Gebruik een swingende-emmer rotor te draaien de ultrafiltratie buis bij 4000 x g bij 4 ° C voor ~ 15 min.
    3. Voeg 14 mL verdunning buffer op de geconcentreerde lysate breuk en herhaal stap 1.4.2. De breuken combineren en concentreren ze naar een volume van 6 mL door ultrafiltratie (4000 x g bij 4 ° C voor ~ 15 min).
      Opmerking: De meeste zout en LDS zal nu worden verwijderd, zodat de lysate klaar voor de klik-reactie is. De lysate kan worden achtergelaten bij-70 ° C gedurende maximaal één week. Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli, omdat zij leiden aanzienlijke achteruitgang van het RNA tot zullen. Aliquot de lysate als kleinschalige karakterisaties vereist zijn.

2. bereiding van de monsters voor RNA-interactome vastleggen

  1. Preclearing van de lysate
    1. Voeg 100 μl daar magnetische kralen per 6 mL lysate en zachtjes draaien (~ 15 rpm) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te elimineren natuurlijk biotinyleerd eiwitten.
    2. Pellet de kralen met behulp van een magneet (voor ~ 20 min bij 4 ° C) en de precleared overdracht lysate aan een nieuwe buis.
  2. Prestaties van de klik-reactie
    1. Bereiden de reactie-mix: 6.5 μL van biotine voorraad (100 mM azide-Biotine opgelost in dimethylsulfoxide [DMSO] op een eindconcentratie van 100 μM), 3.25 μL van koperen voorraad (vers maken; 1 M CuSO4 opgelost in water met een eindconcentratie van 500 μM) , 65 μL van ligand voorraad (200 mM THPTA in water met een eindconcentratie van 2 mM opgelost), en 262.75 μL van H2O.
      Opmerking: THPTA staat voor Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amine.
    2. Meng de mix 6 mL precleared lysate en meng goed. Voeg vervolgens 162.5 μL van de vermindering van de reagens (er verse; 40 mg/mL natrium ascorbaat op een eindconcentratie 5 mM) aan de lysate en meng goed. Het eindvolume moet 6,5 mL.
    3. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat (800 rpm). 5 mM EDTA aan het reactiemengsel toevoegen en het voor 5 min om quench de reactie uit te broeden.
  3. Kleinschalige karakterisaties
    1. De mix van de reactie als in stap 2.2.1 met de voorraad Biotine vervangen door kleurstof materieel (bijvoorbeeld100 mM azide-Cy5 opgelost in DMSO) voor te bereiden.
      Opmerking: Het reagens bedrag moet worden aangepast volgens de hoeveelheid lysate. Een hoeveelheid van 20-μL van de lysate is meestal genoeg voor karakterisaties zoals een analyse van de fluorescentie in-gel.
    2. De reactie mix toevoegen aan de lysate en laat het 2 uur bij kamertemperatuur inwerken. Vervolgens voegt u een derde van het volume van de LDS monster buffer (4 x), het denatureren bij 55 ° C gedurende 5 minuten en oplossen van het monster op een 10% BIB-Tris gel.
      Opmerking: Om te bevestigen dat de fluorescentie-signaal wordt aangeboden op de RNAs, omvatten controles met RNase A spijsvertering na de klik-reactie.
  4. Opschonen van het reactiemengsel
    1. Acht hoeveelheid prechilled methanol (100%) toevoegen aan het reactiemengsel gehard en het gedurende 30 minuten bij-30 ° C voor neerslag uit te broeden. De neerslag in 50 mL conische centrifuge buizen uitvoeren.
      Opmerking: Als het totale volume groter dan 50 mL is, verdeel het reactiemengsel in twee 50 mL conische centrifuge buizen.
    2. Bereiden van reconstitutie buffer: volumedeel buffer A (4% natrium dodecyl sulfaat [SDS] en 10 mM EDTA) combineren met acht hoeveelheid buffer B (1% Brij-97, 150 mM NaCl en 50 mM triethanolamine, pH 7.4).
    3. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Voeg ~ 1-2 mL prechilled methanol toe aan de pellet. Pipetteer omhoog en omlaag om te breken de pellet en ervoor te zorgen dat de pellet is volledig geschorst met geen zichtbare stukjes. Vul de buis met prechilled methanol. Herhaal deze stap 2 x.
    4. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Zet terug die de buizen en Centrifugeer nogmaals bij 4000 x g gedurende 5 min. zorgvuldig uit de resterende methanol zoveel mogelijk trekken zonder de pellet te verstoren.
    5. Voeg 10 mL reconstitutie buffer tot de pellet. Pipetteer omhoog en omlaag om op te lossen de pellet. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    6. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Verzamel 20 μL van de steekproef voor kwaliteitscontrole (zie punt 4).
      Opmerking: Nu, het monster is klaar voor het vastleggen van de RNA-interactome. De gereconstitueerde monster kan worden achtergelaten bij-70 ° C gedurende maximaal één week.

3. RNA-interactome Capture

  1. Voorbereiding van de streptavidine-agarose kralen
    1. 1.600 μL van daar-agarose drijfmest (800 μL van vaste kralen) per 10 mL gereconstitueerde monster in een centrifugebuis 15 mL conische nemen
    2. Spin down de kralen op 4000 x g voor 5 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de vaste kralen.
    3. Wassen van de kralen met 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Spin down de kralen (4000 x g gedurende 5 minuten) en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap 2 x.
  2. Affiniteit pulldown
    1. Het schoongemaakt-up en gereconstitueerde monster van stap 2.4.6 overbrengen naar de parels van de daar-agarose (zie stap 3.1). Na een nacht bebroeden met zachte rotatie bij 4 ° C.
  3. Wassen van de daar kralen
    1. Spin down de kralen (4000 x g gedurende 5 minuten) en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Verzamel 20 μL van de steekproef voor kwaliteitscontrole.
    2. Wassen van de kralen met 10 mL was buffer een (2% SDS in PBS, pH 7.4). Incubeer gedurende 10 min met zachte rotatie (~ 12 rpm) bij kamertemperatuur. Spin down de kralen (4000 x g gedurende 5 minuten) en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal 1 x.
    3. Herhaal stap 3.3.2 met was buffer B (8 M ureum en 250 mM NH4HCO3 opgelost in water). Herhaal stap 3.3.2 met was buffer C (2,5 M NaCl in PBS, pH 7.4). Vervolgens wassen de kralen met 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Spin down de kralen (4000 x g gedurende 5 minuten) en verwijder de bovendrijvende substantie.
    4. De kralen gelijkmatig verdeeld en deze overbrengen naar twee 1.5-mL microcentrifuge buizen.
  4. Elutie van de vastgelegde RNPs
    1. Bereiden van biotine elutie buffer: 12.5 mM biotine, 75 mM NaCl, 7.5 mM Tris∙HCl (pH 7.5), 1.5 mM EDTA, 0,15% SDS sarkosyl 0,075% en 0,02% natrium deoxycholate.
      Opmerking: Winkel de buffer bij kamertemperatuur, voor Biotine kan precipiteren bij 4 ° C.
    2. 400 μL van gewassen vaste kralen, toevoegen 400 μL van biotine elutie buffer.
    3. Incubeer hen op een roteerschudapparaat (1500 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Vervolgens broeden op een roteerschudapparaat met een warmte blok (1.500 rpm, 65 ° C) voor 10 min. Spin down de kralen (7,800 x g voor 1 min) en de eluted RNP verzamelen.
    4. De kralen, toevoegen 400 μL van verse Biotine elutie buffer en herhaal stap 3.4.3. Combineer de twee GC in één 15 mL-buis.
  5. RNase spijsvertering
    1. Drie delen van verdunning buffer toevoegen aan de eluted RNP te verlagen van de concentratie van SDS. Het concentreren van het verdunde monster met behulp van een 0,5 mL ultrafiltratie buis (met een molecuulgewicht cutoff van 10 kDa; spin bij 12.000 x g bij 4 ° C voor ~ 30 min) naar ~ 40 μL.
    2. Voeg 0,5 μg/l RNase A en het Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C om RBPs van kruislings gekoppelde RNAs vrij te geven. Verzamelen 2 μL van RBPs voor kwaliteitscontrole (zie punt 4).

4. kwaliteitscontrole

  1. Controle van de efficiëntie van de affiniteit pulldown
    1. Neem 10 μL van de "voor-pulldown" monster uit stap 2.4.6 en 10 μL van de "na-pulldown" monster uit stap 3.3.1.
    2. Analyseer de monsters met behulp van standaard westelijke vlek procedures (10% BIB-Tris gel).
    3. Vlek het Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan met daar-HRP-geconjugeerde te controleren van het residu Biotine signalen van het "na-pulldown" monster.
      Opmerking: Als het Biotine signaal van het "na-pulldown" monster groter dan een vijfde van het signaal van het "vóór-pulldown" monster is, de hoeveelheid daar-agarose kralen gebruikt in stap 3.1.1 vergroten.
  2. Controle van de efficiëntie van de totale vangst
    1. Neem 2 μL van de vrijgegeven RBP monster uit stap 3.5.2 en 0,5 μl van het monster "vóór-pulldown" (zoals 0,1% input) vanaf stap 2.4.6.
    2. Analyseer de monsters met behulp van standaardprocedures zilver-kleuring.
      1. Fix de gel met fixatie buffer (ethanol 40%, 10% azijnzuur) gedurende 20 minuten, gevolgd door overgevoeligheid (13 mM nb2S2O3, 83 mM Natriumacetaat, 30% ethanol) voor 30 min.
      2. Wassen van de gel 3 x met water gedurende 5 minuten en vervolgens vlek het met een 15 mM AgNO3 oplossing voor 20 min. Wash de gel 2 x met water voor 1 min, ontwikkelen het in 0,24 M Na2CO3 en 0,012% formaldehyde en opgeheven met 45 mM EDTA wanneer de kleuring is suffici ENT.
        Opmerking: De intensiteit van zilver-kleuring van de vastgelegde RBPs moeten vergelijkbaar met die van de input van 0,1%.

5. bereiding van de monsters voor MS

  1. In-gel spijsvertering van de Trypsine van gevangen RBPs 28
    1. Een vierde volume van SDS monster buffer (5 x) aan de vrijgegeven RBP monsters uit stap 3.5.2 toevoegen. Het denatureren van het monster bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Het oplossen van de RBPs op een 1,5-mm 10% SDS-polyacrylamide-gel.
    3. De gel met zilver, volgende standaardprotocollen vlek.
    4. Accijnzen op de baan van experimentele monster of controlemonster met stapelen gel en de grote band van RNase een (~ 15 kDa) verwijderd.
    5. Snijd de verwijderde lane in kleine stukjes (~ 1-1,5 x ~ 1-1,5 mm).
      Opmerking: De kortste rand van het gel stuk moet niet korter dan 1 mm om te voorkomen dat de verstopping in de uiteinden van de pipet.
    6. Breng de gel stukken aan een microcentrifuge buis en destain met destaining buffer (een mengsel van gelijke hoeveelheden van 100 mM nb2S2O3 en 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Wassen de gel stukken met 200 mM Ammoniumbicarbonaat (ABC) tot de stukken van de gel helemaal kleurloos zijn.
    8. Uitdrogen van de stukken van de gel in 1 mL van nette acetonitril (ACN). Hydrateren met 200 μl van 10 mM dithiothreitol (ontbonden in 50 mM ABC) en Incubeer bij 56 ° C gedurende 45 min.
      Opmerking: Volledig uitgedroogd gel stukken moet zeer moeilijk en ondoorzichtig. Als de gel stukken nog zacht na uitdroging zijn, verwijdert u de ACN en voeg 1 mL nette ACN te dehydrateren opnieuw.
    9. De gel stukken tot kamertemperatuur afkoelen. Voeg 200 μL van 58 mM iodoacetamide (ontbonden in 50 mM ABC) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 min. in het donker.
    10. Na een korte wassen met water, drogen de stukken van de gel in 1 mL van nette ACN.
      Opmerking: De gel stukken moeten worden volledig uitgedroogd.
    11. Hydrateren van de gel-stukken met de juiste hoeveelheid 10 ng/μL trypsine (ontbonden in 50 mM ABC) en Incubeer bij 37 ° C voor 12-16 h.
      Opmerking: De gel stukken moeten volledig worden rehydrated met geen ondoorzichtige cores. Eventuele overtollige vloeistof afzuigen.
  2. Stabiele isotoop dimethyl labeling van de verteerd peptiden 29
    1. De verteerd peptiden uittreksel uit de gel stukken door het toevoegen van 200 μL van extractie buffer (5% mierenzuur en 50% ACN in water) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met vortexing (op 1.200 rpm).
    2. Herhaal stap 5.2.1 2 x. Het combineren van de extracten in een microcentrifuge buis.
    3. Droog de uitgepakte peptiden door vacuüm centrifugeren.
    4. Reconstrueren de peptiden in 200 μL van 100 mM triethylammonium bicarbonaat (TEAB, pH 8,5).
      Let op: Stappen 5.2.4 - 5.2.6 moeten worden uitgevoerd op het ijs in een zuurkast.
    5. 8 μL van 4% CH2O en 8 μL van 4% 13CD2O aan de experimentele en controlemonsters, respectievelijk toevoegen.
      Opmerking: Om te controleren de bias van stabiele isotopische labeling, wisselen de stabiele isotoop voor experimentele en controle van monsters van de andere biologisch onafhankelijke repliceren.
    6. Toevoegen van 8 μL van 0,6 M NaBH3CN (Maak het verse) en meng goed.
    7. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur voor 1 h met vortexing.
    8. De monsters op ijs afkoelen. Doven de reactie door toevoeging van 32 μL van 1% waterige oplossing van ammoniak. Vervolgens verder doven de reactie door toevoeging van 16 μL van mierenzuur.
    9. De experimentele monster met de overeenkomstige controlemonster combineren in één microcentrifuge buis. Droog de monsters door vacuüm centrifugeren.
  3. Versplintering van dimethyl-geëtiketteerden peptiden
    1. De stop-en-go-extractie tips (StageTips)30voor te bereiden.
      1. Een C18-membraan invoegen in een uitgebreid-lengte, 10-μL tip.
      2. Voeg 300 μg van hoge-pH C18 parels in ACN geschorst tot aan de vingertop.
      3. Plaats de tip rechtop in een microcentrifuge-buis met een zelfgemaakte rack die kan stabiliseren van de tip en de tip van de onderkant te heffen.
      4. Draai de tip bij 1.400 x g gedurende 2 min. negeren de doorstroming.
      5. Wassen van de tip met 50 μl van 80% ACN in 10 mM ABC (pH 10.0). Herhaal 1 x.
        Opmerking: Breng de pH van 10 mM ABC oplossing door het toevoegen van 28% ammoniumhydroxide.
      6. Wassen van de tip met 50 μl van 50% ACN in 10 mM ABC (pH 10.0). Herhaal 1 x.
      7. De tip met 50 μl van 10 mM ABC (pH 10.0) wassen. Herhaal 1 x.
    2. Reconstrueren de peptiden in 50 μl van 10 mM ABC (pH 10.0).
    3. De gereconstitueerde steekproef aan de bereid tip toevoegen. Herlaad de doorstroming naar de tip om ervoor te zorgen efficiënte peptide bindend.
    4. De tip met 50 μl van 10 mM ABC (pH 10.0) wassen. Herhaal 1 x.
    5. Elueer de peptide stapsgewijze voor 12 breuken met 50 μl van 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% en 6% ACN in 10 mM ABC (pH 10.0).
    6. Combineren van twee breuken met een gelijke interval (breuk 1 met 7, 2 met 8, enzovoort) om zes gecombineerd breuken.
    7. Droog de monsters door vacuüm centrifugeren. De gedroogde peptiden kunnen worden achtergelaten bij-30 ° C.

6. prestaties van de MS en Data-analyse

  1. Peptide analyse door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie
    1. De gedroogde peptide fracties uit stap 5.3.7 in 15 μL van water met 0,1% mierenzuur te reconstrueren. Controleer de pH van gereconstitueerde peptiden door spotten 1 μL van de oplossing op een pH-strip (de pH moet onder punt 3).
    2. Het monster reconstrueren injecteren in de kolom vloeistofchromatografie (LC). Een passende verloop van oplosmiddel (oplosmiddel A is water met 0,1% mierenzuur, oplosmiddel B is ACN met 0,1% mierenzuur) toepassen in krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Een typisch verloop van oplosmiddel B is als volgt: 5-35% in 40 min; 35-70% in de 4 min; en bij 75% gedurende 10 minuten.
    3. De eluted peptiden ioniseren door electrospray en de massaspectrometer in gegevens-afhankelijke modus werken. Selecteer 15 overvloedigste ionen (vermenigvuldigen geladen: 2 + 3 + en hoger) in de eerste MS scannen voor een tandem massaspectrometrie (MS/MS) scan (botsing-geïnduceerde dissociatie, CID). De grootte van het dynamische uitsluiting instellen tot 500 met een maximale tijdsduur van 25 s.
  2. Eiwit identificatie en kwantificering met behulp van MaxQuant 31
    1. Het tarief van de valse ontdekking (FDR) van eiwit identificatie ingesteld op 0,01 en stelt u het aantal unieke peptiden op 2 om het verhogen van de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid.
    2. De minimale reeks vereiste verhouding telt (unieke + scheermes) voor eiwit kwantificering aan 2 en schakelt u de opnieuw kwantificeren en Match tussen runs functies.
  3. Verrijking betekenis evaluatie met behulp van de R/Bioconductor pakket limma 32
    1. Uitvoeren van een gemodereerde t-test uitgevoerd in limma om te testen de Log2-voudige verandering tegen nul uit ten minste drie replicaat-biologische organismen. De functie read.table om te lezen van de gegevenstabel. Gebruik vervolgens de functies lmFit en eBayes voor gegevens passend. De topTable -functie gebruiken om de berekeningresultaten (met inbegrip van de gemiddelde Log2-voudige verandering en de P -waarden) exporteren.
    2. Corrigeer de P -waarden met de Benjamini – Hochberg-methode voor het beheersen van de FDR.
    3. Toepassing een FDR van 0,01 voor het genereren van een lijst van eiwitten aanzienlijk verrijkt in de experimentele monsters. Stel een cutoff van twee- of drievoudig verandering op verdere controle de valse positieven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve resultaten van kwaliteitscontrole stappen worden gepresenteerd. De resultaten omvatten de cijfers van de analyse van de in-gel fluorescentie beschreven in stap 2.3.2 (Figuur 1), de westelijke vlekkenanalyse beschreven in stap 4.1.3 (figuur 2A) en de zilver-kleuring analyse beschreven in stap 4.2.2 (figuur 2B). De kwaliteitscontrole stappen zijn cruciaal voor de optimalisatie van CARIC protocollen. Omvat altijd kwaliteitscontroles bij de voorbereiding van grootschalige RBP identificatie experimenten.

Figure 1
Figuur 1: In-gel fluorescentie analyse van de klik-geëtiketteerden monsters beschreven in stap 2.3.2. (A) dit paneel toont een typische in-gel fluorescentie patroon van klik-geëtiketteerden monsters. Alleen het dubbel gelabelde ziet u een sterke uitstrijkje band op een ultrahoog moleculair gewicht (> 250 kDa), waarmee het signaal van de kruiselings gekoppelde RNPs. Af te schaffen het RNP-signaal, het weglaten van 4SU of EU- of digest met RNase A. De achtergrond scherp bands op een lager molecuulgewicht vertegenwoordigen de signalen van niet-specifieke proteïnen het label. (B) In sommige gevallen, een sterke vlekkerig band (~ 130-250 kDa) kan worden waargenomen in de no4SU-controlemonster. Deze band is het signaal van gelabelde uncross-gekoppelde RNAs, die tijdens de denaturatie van warmte, voor de meeste gevallen zal worden afgebroken. Het zal niet interfereren met de volgende procedures. CBB = Coomassie briljant blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: kwaliteitscontrole van affiniteit pulldown efficiëntie en de vastgelegde RBPs. (A) dit paneel toont een westelijke vlekkenanalyse van de Biotine in monsters vóór pulldown (input) en in de monsters na pulldown (supernatant signalen). Schatting van de verhouding van de resterende signalen en optimaliseren van het bedrag van de parel in stap 3.1.1 gebruikt. (B) dit paneel toont een zilver-kleuring analyse van vastgelegde RBPs in vergelijking met 0,1% input totale eiwitten. HeLa cellen is de algemene totale vangst efficiëntie ~0.05% - 0.1% van invoer eiwitten. Deze waarde kan sterk variëren als gevolg van de variantie van de metabole labeling efficiëntie van verschillende celtypes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vertegenwoordiger MS resultaten van CARIC. (A) dit paneel toont een complot van de vulkaan weer te geven de gemiddelde Log2-voudige wijzigen en aangepast van P -waarden van gekwantificeerde proteïnen, berekend door het limma pakket. 597 van eiwitten met een Log2-voudige verandering van > 2 en een aangepaste P -waarde van < 0.01 werden geclassificeerd als "CARIC RBPs". (B) dit paneel toont de overlapping van de CARIC eiwitten met eerder geïdentificeerde menselijke poly(A) RBPs7,8,9,10,11. De overlappende eiwitten zijn meestal RBPs, codering, terwijl de rest van de CARIC RBPs zijn meer kans om te worden niet-coderende RBPs. Dit cijfer is een herdruk van het eerder gepubliceerde werk met toestemming van de National Academy of Sciences27. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De handhaving van eerlijke RNA integriteit is een van de sleutels tot succesvolle CARIC experimenten. Met passende liganden van Cu(I) en zorgvuldige bewerking, kan aantasting van het RNA aanzienlijk worden verkleind, hoewel gedeeltelijke afbraak was waargenomen. De verhoudingen van de vervanging van de EU en 4SU in experimentele monsters zijn respectievelijk 1,18 procent en 0,46%, (gegevens niet worden weergegeven). Voor intact RNAs met een lengte van 2.000 nt, ~ 90% van de RNAs bevatten ten minste één EU en één 4SU. Voor gedeeltelijk aangetaste RNAs met een lengte van 1.000 nt, ~ 70% van de RNAs bevatten ten minste één EU en één 4SU. Daarom, gedeeltelijke afbraak van RNAs doet niet drastisch afnemen de efficiëntie van CARIC, terwijl ernstige aantasting niet aanvaardbaar is.

Een andere belangrijke stap is de stap 1.4, de voorbereiding voor de klik-reactie. De Cu (I)-gekatalyseerde Klik reactie op RNAs is gevoelig voor LDS-concentratie. Een hoge concentratie (> 0,1%) van LDS zal leiden tot een daling van het labelen van de signalen op EU-bevattende RNAs en een stijging van achtergrond signalen op eiwitten (gegevens niet worden weergegeven).

Naast EU is CARIC ook compatibel met andere klikbare nucleosiden, zoals alkynyl en azido-analogen van adenosine33,34,35,,36. De toepassing van CARIC wordt echter aanzienlijk beperkt door de metabole efficiëntie van onnatuurlijke klikbare nucleosiden in een biologisch systeem van belang. Dus, voordat het uitvoeren van CARIC met behulp van andere voorwaarden dan die in dit protocol aantoonde, Controleer altijd de metabole efficiëntie labeling (bijvoorbeelddoor tl imaging).

Een soortgelijke strategie genaamd RICK (verovering van de nieuw getranscribeerde RNA interactome met behulp van klik chemie), die bevat alleen de EU om totale RNAs van een label en gebruikt 254-nm UV om te cross-link RNAs en eiwitten, was onlangs gemelde37. Met name, kunt 254-nm UV activeren alle vier natuurlijke nucleosiden, evenals EU. Dus, 254-nm UV bestraling kan cross-link vrije EU en de metabolieten ervan (bijvoorbeeld, EU fosfaten) met bijbehorende bindende proteïnen, die als mogelijke valse positieven rekening moeten worden gehouden.

Een intrigerende toepassing van CARIC is het identificeren van de RBPs in bacteriën waarvan RNAs meestal niet-polyadenylated zijn. De grootschalige identificatie van RBPs krijgt invaluable bronnen om te begrijpen van de moleculaire basis van verordeningen van de posttranscriptional in bacteriën38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China subsidies 91753206, 21425204, en 21521003 en door de nationale sleutel onderzoeks- en ontwikkelingsproject 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).

Tags

Biochemie kwestie 140 RNA RNA-eiwit interacties proteomics bioorthogonal chemie noncoding RNA
Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteïnen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen,… More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter