Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.

Abstract

מזהה מקיף של RNA-מחייב חלבונים (RBPs) הוא מפתח להבנת הרשת תקינה posttranscriptional בתאים. אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור לכידת RBP מנצלת את פוליאדנילציה [poly(A)] של RNAs היעד, אשר מתרחשת בעיקר על האיקריוטים mRNAs בוגר, עוזב את רוב מחייב חלבונים של non-poly(A) RNAs לא מזוהה. כאן נתאר את הליכים מפורטים של שיטת דיווחו לאחרונה כינה לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC), אשר מאפשר לכידת transcriptome-wide RBPs הן poly(A) והן non-poly(A) על ידי שילוב של תיוג מטבולית של RNAs ויוו UV cross-linking, תיוג bioorthogonal.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הגנום האנושי הוא עיבד לתוך סוגים שונים של קידוד ו noncoding RNAs (ncRNAs), כולל mRNAs, rRNAs, tRNAs, RNAs גרעיני קטן (snRNAs), קטן nucleolar RNAs (snoRNAs) ולונג ללא קידוד RNAs (lncRNAs)1. רוב אלה RNAs להחזיק בגדים של RBPs, לתפקד כמו חלקיקים (RNPs) ribonucleoprotein2. לכן, זיהוי מקיף של RBPs היא תנאי הכרחי להבנת הרשת תקינה בין RNAs RBPs, אשר הייתה שם מחלות אנושיות שונות3,4,5.

בשנים האחרונות עדים דחיפה גדולה של RBPs גילה שונים מערכות האיקריוטים2,6, כולל האדם7,8,9,10,11, העכבר12,13,14, שמרים9,15,16, דג זברה17, דרוזופילה melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16 תודרנית לבנה20,21,22, האדם טפילים23,24,25 . ההתפתחויות הללו יש כבר בהנחייתם של אסטרטגיית לכידת RBP שפותחה על ידי Castello. et al. 7 ו. Baltz et al. 8 ב 2012, המשלב ויוו UV cross-linking של RNA, שמעצבת חלבונים, לכידת oligo(dT) poly(A) RNAs, ושל ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס פרופיל פרוטיאומיה מבנית. עם זאת, בהתחשב בעובדה ש-poly(a) זה קיים בעיקר mRNAs בוגר, אשר חשבון עבור ~ 3% - 5% בלבד של transcriptome האיקריוטים26, האסטרטגיה הנפוצה הזו אינה מסוגלת ללכוד RBPs אינטראקציה עם non-poly(A) RNAs, כולל רוב ncRNAs pre-mRNAs.

כאן, אנו מדווחים על ההליכים מפורט של האסטרטגיה שפותחו לאחרונה ללכידתו transcriptome ברוחב של RBPs הן poly(A) והן non-poly(A)27. כינה CARIC, אסטרטגיה זו משלב ויוו UV cross-linking, תיוג מטבולית של RNAs עם photoactivatable ו- "לחיץ" nucleoside תחליפי (אשר מכילים קבוצה פונקציונלית bioorthogonal יכולים להשתתף תגובת לחץ), 4 - thiouridine (4SU), 5-ethynyluridine (האיחוד האירופי). השלבים הם המפתח להגיע לתוצאות אידיאלי עם האסטרטגיה CARIC הם תיוג מטבולית יעיל, התגובה cross-linking ולחץ UV, שמירה על שלמות RNA. כי Cu(I) משמש הזרז בתגובה לחץ יכול לגרום את הפיצול של RNAs, ליגנד Cu(I) שיכולים להפחית פיצול RNA הוא חיוני. אנו מתארים כיצד לבצע תגובות לחץ יעיל ב תא lysates מבלי לגרום השפלה RNA חמורה.

למרות RBP ללכוד, זיהוי בתאים הלה רק מתואר במסגרת פרוטוקול זה, ניתן ליישם את האסטרטגיה CARIC לסוגי תאים שונים ואולי אף אורגניזמים חיים. חוץ RBP לכידת, פרוטוקול זה מספק גם הליכים צעד אחר צעד יעיל עבור הכנת הדוגמא MS וחלבון וכימות, אשר יכול להיות שימושי עבור אלה שאינם מכירים פרוטיאומיה מבנית ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התראה: בעת הצורך, ריאגנטים בשימוש כדאי לרכוש בצורה של נטול RNase, או מומס RNase-חינם, ממיסים (עבור שברוב המקרים, diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים). בעת טיפול RNA ודוגמאות RNase ללא ריאגנטים, תמיד ללבוש כפפות ומסכות, ולשנות אותם לעתים קרובות כדי להימנע RNase זיהום.

1. הכנת Lysate של סמויה שכותרתו תאים צולבים UV

  1. התאגדות מטבולית של האיחוד האירופי, 4SU
    1. הלה התרבות תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין μg/mL 100 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה2 CO 5%. תרבות ~ 4 x 107 הלה תאים (שתי מנות 15-ס"מ) להכנת אחד ניסיוני או לשלוט מדגם אחד שלהפעיל את MS סטנדרטי.
    2. כאשר התאים בתרבית הלה מגיעים למפגש ~ 80%, להסיר את המדיום תרבות ולהוסיף 15-mL prewarmed בינוני טריים לכל צלחת 15 ס מ.
    3. להוסיף μL 15 לכל מנה של 100 מ מ של האיחוד האירופי (מומס באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)) כדי ריכוז סופי של 1 מ מ, ו 7.5 μL לכל צלחת של 4SU 100 מ מ (מומס PBS) כדי ריכוז סופי של 0.5 מ מ על ניסיוני ודוגמאות noUV-control. להוסיף μL 15 לכל מנה של 100 מ מ של האיחוד האירופי (מומס PBS) ריכוז סופי של 1 מ מ עבור no4SU-בקרת דגימות.
      הערה: 4SU הוא צילום-activatable; לפיכך, נדרשת הגנה מפני אור לאחר הוספת 4SU.
    4. לכסות את הכלים בנייר כסף ואת התרבות התאים עבור 16 ה Add מחצית הכמות של האיחוד האירופי, 4SU או רק האיחוד האירופי מ שלב 1.1.3 ניסיוני, noUV- ו no4SU-בקרת דגימות, בהתאמה, ולהמשיך culturing כבר שעתיים אחר.
  2. אין ויוו Cross-linking UV
    1. להסיר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים 3 x 5 מ של PBS לכל תבשיל, הסר PBS שיורית ככל האפשר.
      הערה: שאריות נוזלים יפחית באופן משמעותי את יעילות cross-linking.
    2. עבור ניסוי no4SU-בקרת דגימות, מניחים את הכלים על הקרח המכסה הסיר, להאיר את התאים עם 365-nm אולטרא סגול-J/cm 22 מאת חוצה-מקשרים UV.
    3. לקבלת דוגמאות noUV-control, מניחים את הכלים על קרח, להגן עליהם מפני אור.
      הערה: כל הפעולות הבאות לקבלת דוגמאות noUV-בקרת צריכה להתבצע בחדר החשוך.
  3. פירוק התא, המגון
    1. להוסיף 1 מ"ל לכל צלחת של מאגר פירוק מראש (10 מ מ Tris∙HCl, pH 7.5, 50 מ מ חומצה LiCl, % Nonidet P-40 0.02 נקודות ו ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-קוקטייל מעכב פרוטאז חינם) לתאים. לגרד את התאים באמצעות של מרים תא גומי ולאסוף את המתלים פירוק מראש בצינור 15-mL.
      הערה: שלב זה לשבור את קרום התא, שחרור חלבונים מסיסים cytoplasmic ו RNAs. לא centrifuge את הצינור ולהסיר את תגובת שיקוע.
    2. על ההשעיה של שתי מנות 15-ס"מ, לכוונן את עוצמת הקול עד 6 מ"ל על-ידי הוספת המאגר פירוק מראש. להוסיף המתלים מראש פירוק אמצעי שווה מאגר R-פירוק (200 מ"מ Tris∙HCl, pH 7.5, 500 מ מ LiCl, 2% ליתיום dodecyl סולפט [LDS]).
    3. Homogenize תא lysate על ידי העברתן באמצעות מזרק עם מחט צר (27-G) מספר פעמים עד lysate ברורה ואחידה. דגירה lysate ב 4 ° C עם סיבוב עדין (~ 15 סל ד) לשעה.
      הערה: שלב אחרון זה יאפשר את denaturing המלאה של חלבונים. Lysate ניתן בבטחה לאחסן ב-70 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
  4. הכנה תגובת לחץ
    1. לדלל את lysate על-ידי הוספת 20 כרכים של דילול מאגר (50 מ"מ Tris∙HCl, pH 7.5), מחלקים אותו 15-mL שברים.
      הערה: פתרונות המכיל ריכוז גבוה של מלח, אבקת תסכן את היעילות של Cu (I)-מזורז תגובת לחץ; לפיכך, יש לשנות את המאגר של lysate.
    2. להתרכז כל שבר באמצעות צינור 15-mL אולטראפילטרציה (עם משקל מולקולרי על קיצוץ של 10 kDa) עד שאמצעי האחסון קטן מ- 1 מ"ל. השתמש רוטור דלי מתנדנד לסובב את הצינור אולטראפילטרציה ב x 4,000 גרם ב 4 ° C ~ 15 דקות.
    3. להוסיף 14 מ של דילול מאגר השבר lysate מרוכז וחזור על שלב 1.4.2. לשלב את השברים ולרכז אותם לאמצעי אחסון של 6 מ ל מאת אולטראפילטרציה (4000 x g ב 4 ° C ~ 15 דקות).
      הערה: רוב מלח LDS וויל עכשיו ניתן להסיר, אז lysate הוא מוכן לקבל תגובת לחץ. Lysate ניתן לאחסן ב-70 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. הימנע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה, כי הם תוצאה של השפלה RNA משמעותית. Aliquot אפיוני lysate אם בקנה מידה קטן הינם נדרשים.

2. הכנה דוגמאות של RNA-interactome ללכוד

  1. Preclearing של lysate
    1. להוסיף 100-μL streptavidin beads מגנטי לכל 6 מ של lysate, סובב בעדינות (~ 15 סל ד) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לחסל באופן טבעי biotinylated חלבונים.
    2. גלולה החרוזים באמצעות מגנט (עבור ~ 20 דקות ב 4 ° C) להעביר precleared lysate אל צינור חדש.
  2. הביצועים של התגובה לחץ
    1. מכינים את תערובת התגובה: μL 6.5 של ביוטין מניות (100 מ מ אזיד-ביוטין מומס דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]-ריכוז סופי של 100 μM), 3.25 μL של מניות נחושת (תרענן; מ' CuSO 14 מומס במים-ריכוז סופי של 500 μM) , ΜL 65 של ליגנד מניות (200 מ"מ THPTA מומס במים-ריכוז סופי של 2 מ מ), ואת μL 262.75 H2O.
      הערה: THPTA עומד על טריס [מתיל (1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)] אמין.
    2. להוסיף את תערובת התגובה 6 מ של precleared lysate ומערבבים היטב. לאחר מכן, הוסף μL 162.5 הפחתת ריאגנט (תרענן; 40 מ"ג/מ"ל סודיום אסקורבט-ריכוז סופי 5 מ מ) lysate ומערבבים היטב. עוצמת הקול הסופי צריך להיות 6.5 מ.
    3. דגירה תערובת התגובה כבר שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית (800 סל ד). הוסף 5 מ מ EDTA לתערובת התגובה, דגירה בשביל 5 דקות כדי להרוות את התגובה.
  3. אפיוני בקנה מידה קטן
    1. מכינים את תערובת התגובה כמו שלב 2.2.1 עם המניה ביוטין הוחלף מלאי צבע (למשל, אזיד 100 מ ממומס דימתיל סולפוקסיד Cy5).
      הערה: הסכום ריאגנט צריך להיות מותאם על פי הנפח של lysate. בדרך כלל, aliquot 20-μL של lysate מספיקה אפיוני כגון ניתוח זריחה בג'ל.
    2. להוסיף את תערובת התגובה lysate, דגירה זה עבור 2 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף בשליש הכרך של המאגר מדגם LDS (4x), denature זה ב 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולפתור את הדגימה על ג'ל bis-טריס 10%.
      הערה: כדי לאשר שהאות פלורסצנטיות מוצג על RNAs, כוללים פקדים RNase A עיכול לאחר תגובת לחץ.
  4. ניקוי של תערובת התגובה
    1. להוסיף תערובת התגובה מתרצה שמונה כרכים של מתנול prechilled (100%), דגירה זה במשך 30 דקות ב-30 ° C עבור משקעים. לבצע את המשקעים צנטריפוגה חרוט 50-mL צינורות.
      הערה: אם אמצעי האחסון הכולל גדול מ- 50 מ ל, מחלקים את התערובת תגובה ל שני צינורות צנטריפוגה חרוט 50-mL.
    2. הכנת מאגר שיחזור: לשלב אמצעי אחסון אחד מאגר A (4% נתרן גופרתי dodecyl [מרחביות] ו 10 מ מ EDTA) עם שמונה כרכים של מאגר B (הידרוקסיאתיל מוטי ממליה-97, 150 מ מ NaCl ו 50 מ מ 1%, pH 7.4).
    3. צנטריפוגה ב x 4,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע. להוסיף ~ 1-2 מ ל מתנול prechilled בגדר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את צניפה ולוודא בגדר מושהה לחלוטין עם חתיכות לא נראה לעין. ממלאים את הצינור מתנול prechilled. חזור על שלב זה, 2 x.
    4. צנטריפוגה ב x 4,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע. . תחזיר שצינורות, צנטריפוגה שוב ב 4,000 x g עבור 5 דק בקפידה למשוך החוצה את מתנול שיורית ככל האפשר מבלי להפריע בגדר.
    5. להוסיף 10 מ ל מאגר שיחזור בגדר. פיפטה למעלה ולמטה כדי להמיס את גלולה. צנטריפוגה ב 4,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
    6. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. איסוף μL 20 המדגם לבקרת איכות (ראו סעיף 4).
      הערה: עכשיו, המדגם הוא מוכן עבור לכידת RNA-interactome. ניתן לאחסן את הדגימה משוקם ב-70 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

3. ה-RNA interactome לכידת

  1. הכנת חרוזים streptavidin-agarose
    1. קח 1,600 μL של slurry streptavidin-agarose (800 μL של חרוזים שיוחסו) לכל 10 מ של דגימה משוקם לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL.
    2. ספין למטה החרוזים ב 4000 x g עבור 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים התיישבו.
    3. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל של 50 מ מ Tris∙HCl (pH 7.5). ספין למטה החרוזים (4000 x g למשך 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה, 2 x.
  2. זיקה הנפתח
    1. העברה המדגם ניקו למעלה, משוקם מהשלב 2.4.6 החרוזים streptavidin-agarose (ראה שלב 3.1). דגירה בין לילה עם סיבוב עדין ב 4 º C.
  3. כביסה של חרוזים streptavidin
    1. ספין למטה החרוזים (4000 x g למשך 5 דקות), להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. איסוף μL 20 המדגם לבקרת איכות.
    2. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל של שטיפת מאגר (מרחביות 2% ב- PBS, pH 7.4). תקופת דגירה של 10 דקות עם סיבוב עדין (~ 12 סל ד) בטמפרטורת החדר. ספין למטה החרוזים (4000 x g למשך 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על 1 x.
    3. חזור על שלב 3.3.2 עם שטיפת מאגר B (אוריאה שמונה מ' ו- 250 מ מ NH4HCO3 מומס במים). וחזור על שלב מספר 3.3.2 עם שטיפת מאגר C (2.5 M NaCl ב- PBS, pH 7.4). לאחר מכן, לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל של 50 מ מ Tris∙HCl (pH 7.5). ספין למטה החרוזים (4000 x g למשך 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. לפצל את החרוזים אחיד ומעבירים אותם אל שני צינורות microcentrifuge 1.5-mL.
  4. • תנאי של RNPs בשבי
    1. הכנת מאגר • תנאי ביוטין: 12.5 מ מ ביוטין, 75 מ"מ NaCl, 7.5 מ"מ Tris∙HCl (pH 7.5), 1.5 מ מ EDTA, 0.15% מרחביות, 0.075% sarkosyl ו- 0.02% נתרן deoxycholate.
      הערה: חנות המאגר בטמפרטורת החדר, עבור ביוטין עלול לזרז ב 4 º C.
    2. כדי μL 400 של חרוזים שיוחסו שטף, להוסיף μL 400 ביוטין • תנאי המאגר.
    3. דגירה אותם על שייקר מסלולית (1,500 סל ד) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, דגירה על שאכר מסלולית עם גוש חום (1,500 סל ד, 65 ° C) במשך 10 דקות ספין למטה החרוזים (7,800 x g עבור 1 דקות), לאסוף את RNP eluted.
    4. את החרוזים, להוסיף μL 400 ביוטין טרי • תנאי מאגר וחזור על שלב 3.4.3. שילוב שתי elutes לתוך שפופרת אחת 15-mL.
  5. RNase עיכול
    1. להוסיף שלושה כרכים של דילול מאגר RNP eluted כדי להקטין את ריכוז מרחביות. להתרכז המדגם מדולל באמצעות צינור 0.5-mL אולטראפילטרציה (עם ניתוק משקל מולקולרי של 10 kDa; ספין-x 12,000 g ב- 4 ° C ~ 30 דקות) כדי μL ~ 40.
    2. להוסיף 0.5 μg/μL RNase A, דגירה זה עבור 2 h ב 37 ° C כדי לשחרר RBPs של RNAs צולבים. לאסוף את μL 2 של RBPs לבקרת איכות (ראו סעיף 4).

4. בקרת איכות

  1. שליטה על היעילות של הנפתח זיקה
    1. קח 10 μL של המדגם "לפני-הנפתח" מ μL 2.4.6 ו-10 שלב של המדגם "לאחר-הנפתח" מהשלב 3.3.1.
    2. לנתח את הדגימות באמצעות הליכים סטנדרטיים תספיג (10% bis-טריס ג'ל).
    3. כתם קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene עם streptavidin-HRP המספר המשלים כדי לנטר את האותות ביוטין שאריות של המדגם "לאחר-הנפתח".
      הערה: אם האות ביוטין המדגם "לאחר-הנפתח" גדול מ חמישית של האות המדגם "לפני-הנפתח", להגדיל את כמות streptavidin-agarose חרוזים בשימוש בשלב 3.1.1.
  2. השליטה היעילות הכוללת לכידת
    1. לקחת 2 μL מדגם RBP המשוחררים מן שלב 3.5.2 ו- 0.5 μL של המדגם "לפני-הנפתח" (כפי 0.1% קלט) מכל צעד 2.4.6.
    2. לנתח את הדגימות באמצעות הליכים סטנדרטיים מכתים כסף.
      1. לתקן את הג'ל עם מאגר קיבעון (40% אתנול, 10% חומצה אצטית) במשך 20 דקות ולאחריו רגישות עולה (13 מ מ נה2S2O3, 83 מ מ סודיום אצטט, 30% אתנול) למשך 30 דקות.
      2. לשטוף את הג'ל 3 x עם מים במשך 5 דקות, ואז, את הכתם עם 15 מ מ AgNO פתרון3 עבור 20 דקות לשטוף את הג'ל 2 x עם מים 1 דקות, לפתח את זה ב 0.24 מ'-נה-2CO-3 ו- 0.012% פורמלדהיד, ולסיים עם 45 מ מ EDTA כאשר ההכתמה suffici אף אוזן גרון.
        הערה: עוצמת כסף מכתים RBPs בשבי צריך להיות דומה לזה של הקלט 0.1%.

5. הכנה של הדגימות MS

  1. בג'ל טריפסין העיכול של RBPs בשבי 28
    1. להוסיף רבע נפח של מאגר מדגם מרחביות (5 x) הדגימות RBP המשוחררים מהשלב 3.5.2. Denature הדגימה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. לפתור את RBPs על ג'ל מרחביות-לזיהוי 10% 1.5 מ מ.
    3. מכתים את הג'ל עם כסף, פרוטוקולים סטנדרטיים הבאים.
    4. לסלק את ליין מדגם ניסיוני, הלהקה העיקריים של RNase (kDa ~ 15) הוסר או שליטה לדוגמה עם ג'ל הערימה.
    5. חותכים את ליין נכרת לחתיכות קטנות (~ 1-1.5 מ"מ x ~ 1-1.5 מ"מ).
      הערה: הקצה הקצר של היצירה ג'ל צריכה להיות קצרה יותר מאשר 1 מ מ כדי למנוע סתימת בטיפים פיפטה.
    6. להעביר את חתיכות ג'ל צינור microcentrifuge, destain עם מאגר destaining (תערובת של נפחים שווים של 100 מ מ נה2S2O3 ו 30 מ מ K3[Fe(CN)6]).
    7. לשטוף את החלקים ג'ל עם 200 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) עד החלקים ג'ל שקוף לגמרי.
    8. מייבשים את השברים ג'ל 1 מ"ל של acetonitrile מסודר (לחצן מצוקה). נתרענן עם 200 μL של dithiothreitol 10 מ מ (מומס 50 מ מ ABC), דגירה ב 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
      הערה: פיסות ג'ל מיובש לחלוטין צריך להיות אטום וקשה מאוד. אם החלקים ג'ל עדיין רך לאחר התייבשות, להסיר את לחצן מצוקה ולהוסיף 1 מ"ל של לחצן מצוקה מסודר מייבשים שוב.
    9. לקרר את החלקים ג'ל לטמפרטורת החדר. להוסיף 200 μL של 58 מ מ iodoacetamide (מומס 50 מ מ ABC), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בחושך.
    10. לאחר שטיפה קצרה במים, מייבשים את השברים ג'ל 1 מ"ל של לחצן מצוקה מסודר.
      הערה: החלקים ג'ל חייב להיות לגמרי מיובש.
    11. נתרענן החלקים ג'ל עם הכמות המתאימה של 10 ng/μL טריפסין (מומס 50 מ מ ABC), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
      הערה: החלקים ג'ל צריכה להיות לגמרי ולמיומנות עם אין ליבות אטומים. הסר את כל נוזל עודף.
  2. איזוטופ יציב דימתיל תיוג של פפטידים מתעכל 29
    1. לחלץ את פפטידים מתעכל החלקים ג'ל על-ידי הוספת μL 200 החילוץ מאגר (חומצה פורמית 5% ו- 50% לחצן מצוקה במים) דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם vortexing (תמורת 1,200 סל ד).
    2. חזור על שלב 5.2.1 2 x. משלבים תמציות לתוך שפופרת microcentrifuge אחת.
    3. יבש את פפטידים שחולצו על ידי צנטריפוגה ואקום.
    4. לשקם את פפטידים μL 200 של ביקרבונט triethylammonium 100 מ מ (TEAB, pH 8.5).
      התראה: צעדים 5.2.4 - 5.2.6 צריכה להתבצע על הקרח בשכונה fume.
    5. הוסף 8 μL של CH 4%2O ו- 8 μL של 4% 13תקליטור2O ניסיוני ודוגמאות שליטה, בהתאמה.
      הערה: כדי לשלוט משוא הפנים של תיוג איזוטרופי יציב, להחליף את איזוטופ יציב על ניסיוני ולשלוט דוגמאות שכפול ביולוגית עצמאית אחרים.
    6. הוסף 8 μL של 0.6 מטר NaBH3CN (תהפוך אותה טריים) ומערבבים היטב.
    7. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך h 1 עם vortexing.
    8. לקרר את הדוגמאות על קרח. להרוות את התגובה על-ידי הוספת μL 32 של 1% תמיסה מימית של אמוניה. ואז, הלאה להרוות את התגובה על-ידי הוספת μL 16 חומצה פורמית.
    9. לשלב המדגם ניסיוני עם הדגימה הבקרה המתאימים שפופרת microcentrifuge אחת. יבש את הדוגמאות על ידי צנטריפוגה ואקום.
  3. Fractionation של פפטידים התווית על-ידי דימטלי
    1. הכינו את התחנה-ו-go-החילוץ טיפים (StageTips)30.
      1. הכנס קרום סי18 עצה 10-μL מורחב-אורך.
      2. הוסף μg 300 של חרוזים סי18 גבוהה pH הושעו בלחצן מצוקה אל קצה.
      3. מקם את הטיפ זקוף צינור microcentrifuge עם חזה תוצרת בית, אשר ניתן לייצב את הטיפ, הרם את הקצה התחתון.
      4. לסובב הטיפ-1,400 x g עבור 2 דק. להשליך את הזרימה דרך.
      5. לשטוף את הטיפ עם 50 μL של 80% לחצן מצוקה ב- 10 מ מ ABC (pH 10.0). חזור על 1 x.
        הערה: להתאים את ה-pH של 10 מ מ ABC פתרון על-ידי הוספת 28% אמוניה מימית.
      6. לשטוף את הטיפ עם 50 μL 50% לחצן מצוקה ב- 10 מ מ ABC (pH 10.0). חזור על 1 x.
      7. לשטוף את הטיפ עם 50 μL 10 מ מ ABC (pH 10.0). חזור על 1 x.
    2. לשקם את פפטידים 50 μL 10 מ מ ABC (pH 10.0).
    3. הוסף את הדגימה משוקם לקצה מוכן. לטעון מחדש את הזרימה דרך לקצה להבטחת פפטיד יעיל מחייב.
    4. לשטוף את הטיפ עם 50 μL 10 מ מ ABC (pH 10.0). חזור על 1 x.
    5. Elute פפטיד stepwise לשברים 12 עם 50 μL של 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% ו- 6% לחצן מצוקה ב- 10 מ מ ABC (pH 10.0).
    6. לשלב שני שברים במרווח שווה (שבר 1 עם 7, 2 עם 8, וכן הלאה) כדי לקבל שש בשילוב שברים.
    7. יבש את הדוגמאות על ידי צנטריפוגה ואקום. ניתן לאחסן את פפטידים יבשים ב-30 º C.

6. ביצועים של MS, ניתוח נתונים

  1. פפטיד ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית
    1. לשקם את שברים פפטיד יבשים של שלב μL 5.3.7 ב 15 של מים המכילים חומצה פורמית 0.1%. בדוק את ה-pH של פפטידים משוקם על ידי spotting 1 μL של הפתרון על רצועת ה-pH (רמת ה-pH צריך להיות מתחת לגיל 3).
    2. להזריק את הדגימה לשקם לתוך העמודה כרומטוגרפיה נוזלית (LC). להחיל על שיפוע המתאים של הממס (הממס הוא מים המכילים חומצה פורמית 0.1%, הממס B הוא לחצן מצוקה המכיל חומצה פורמית 0.1%) בביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). מעבר צבע אופייני של הממס B הוא כדלקמן: 5% - 35% 40 דקות; 35% - 70% ב- 4 דקות; שנערך ב- 75% למשך 10 דקות.
    3. Ionize של פפטידים eluted על ידי ספקטרומטריית electrospray ופועלים את ספקטרומטר מסה במצב תלויי-נתונים. בחר 15 יונים הנפוץ ביותר (להכפיל טעון: 2 +, 3 + או גבוה יותר) ב- MS הראשונית סרוק סריקה ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם (התנגשות-induced דיסוציאציה, סיד). קבע את גודל הדרה דינמי 500 עם זמן משך הזמן המרבי של 25 s.
  2. חלבון וכימות באמצעות MaxQuant 31
    1. מוגדר שיעור גילוי שקר (פד) של חלבון זיהוי 0.01, הגדר את המספר של פפטידים ייחודי ל- 2 על מנת להגביר את המהימנות והדיוק.
    2. סט מינימום נדרש יחס נחשב (ייחודי + גילוח) עבור כימות חלבון 2, הפעל מחדש לכמת ופונקציות להתאים בין הרצפים .
  3. הערכת חשיבות העשרה באמצעות limma חבילה של R/Bioconductor 32
    1. לבצע מונחית t-מבחן מיושם ב- limma כדי לבחון את השינוי Log2 קיפול נגד אפס של משכפל ביולוגית לפחות שלושה. השתמש בפונקציה read.table כדי לקרוא את טבלת הנתונים. לאחר מכן, השתמש בפונקציות lmFit ו- eBayes עבור נתונים מתאים. השתמש בפונקציה topTable כדי לייצא את תוצאות החישובים (כולל את שינוי Log2 קיפול בממוצע והערכים P ).
    2. לתקן את הערכים P בשיטת בנימיני – הוכברג לשליטה פד.
    3. חלות של רוזוולט של 0.01 כדי ליצור רשימה של חלבונים מועשר באופן משמעותי את הדגימות ניסיוני. הגדר קיצוץ של שני - או פי שלושה שינוי כדי לשלוט על תוצאות חיוביות שגויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התוצאות נציג של בקרת איכות הפעולות מוצגים. התוצאות כוללות דמויות של הניתוח בג'ל פלורסצנטיות שמתואר בשלב 2.3.2 (איור 1), הניתוח תספיג שמתואר בשלב 4.1.3 (איור 2 א) הניתוח מכתים כסף שמתואר בשלב 4.2.2 (איור 2B). השלבים בקרת איכות הם קריטיים עבור אופטימיזציה של פרוטוקולים CARIC. תמיד לכלול פקדים איכות הכנת ניסויים בקנה מידה גדול של זיהוי RBP.

Figure 1
איור 1: בג'ל פלורסצנטיות ניתוח של הדגימות התווית על-ידי לחץ שמתואר בשלב 2.3.2. () זריחה מראה אופייני בג'ל זה לוח דפוס של דגימות התווית על-ידי לחיצה. רק המדגם כפליים תוויות מראה להקה השמצות חזק-מולקולרית במשקל גבוה (> 250 kDa), אשר מייצגת את האות של RNPs צולבים. לבטל את האות RNP, להשמיט או 4SU או האיחוד האירופי או תקציר עם RNase א הלהקות רקע חד-משקל מולקולרי נמוך יותר לייצג את האותות של שאינם שכותרתו חלבונים ספציפיים. (B) בבמקרים מסויימים, להקה מרוח חזקה (~ 130-250 kDa) יכול להיות שנצפו בדגימה no4SU-שליטה. הלהקה הזו מייצגת את האות של RNAs uncross-מקושר עם תוויות, אשר תגרע במהלך דנטורציה חום, ברוב המקרים. זה לא יתערב ההליכים הבאים. CBB = Coomassie כחול מבריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: בקרת איכות של זיקה הנפתח יעילות של RBPs שנתפסו. (א) לוח זה מציג ניתוח תספיג של ביוטין אותות בדגימות לפני הנפתח (קלט), הדגימות לאחר הנפתח (תגובת שיקוע). להעריך את היחס של האותות הנותרים ולמטב את כמות חרוז בשימוש בשלב 3.1.1. (B) לוח זה מציג ניתוח מכתים כסף של RBPs שנתפסו לעומת 0.1% חלבונים הכולל קלט. עבור תאים הלה, היעילות הכללית לכידת הכולל הוא ~0.05% - 0.1% של חלבונים קלט. ערך זה יכול להשתנות באופן משמעותי עקב השונות של היעילות תיוג מטבולית של סוגי תאים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תוצאות נציג MS CARIC. (א) לוח זה מציג מגרש הר הגעש מציג את בממוצע Log2 קיפול לשנות ומתואם P ערכים של חלבונים כימות, המחושב על-ידי החבילה limma. 597 של חלבונים עם שינוי Log2 קיפול > 2, ערך P של < 0.01 סווגו "CARIC RBPs". (B) לוח זה מראה את החפיפה של החלבונים CARIC עם poly(A) אדם שזוהה בעבר7,RBPs8,9,10,11. החלבונים חופף הינם בעיקר קידוד RBPs, בעוד שאר RBPs CARIC הם נוטים יותר להיות ללא קידוד RBPs. נתון זה reprinted מהעבודה שפורסמו בעבר באישור האקדמיה הלאומית למדעים27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שמירה על תקינות RNA הוגן הוא אחד המפתחות ניסויים CARIC מוצלח. עם ליגנדים המתאים של Cu(I) ותפעול זהיר, השפלה RNA ניתן להפחתה, למרות ההשפלה חלקית נצפתה. יחס החלפה של האיחוד האירופי, 4SU בדגימות ניסיוני הם 1.18% ו- 0.46%, בהתאמה (נתונים לא מוצג). עבור RNAs שלמים באורך של 2,000 nt, ~ 90% של RNAs להכיל אחד לפחות של האיחוד האירופי, 4SU אחד. עבור RNAs מפורק חלקית עם אורך של 1,000 nt, ~ 70% של RNAs להכיל אחד לפחות של האיחוד האירופי, 4SU אחד. לכן, השפלה חלקית של RNAs באופן דרמטי להקטין את היעילות של CARIC, בעוד השפלה חמורה ולא מקובל.

עוד צעד קריטי הוא צעד 1.4, ההכנה תגובת לחץ. Cu (I)-תגובת לחץ מזורז RNAs רגישה LDS ריכוז. ריכוז גבוה (> 0.1%) של LDS תוביל לירידה של תיוג אותות על האיחוד האירופי המכילות RNAs ועלייה של רקע אותות על חלבונים (נתונים לא מוצג).

בנוסף האיחוד האירופי, CARIC הוא גם תואם נוקלאוזידים לחיץ אחרים, כגון alkynyl ו- azido אנלוגים של אדנוזין33,34,35,36. עם זאת, היישום של CARIC באופן משמעותי מוגבל על ידי יעילות מטבולית לא טבעי ללחיצה נוקלאוזידים במערכת הביולוגית של עניין. לכן, לפני ביצוע CARIC באמצעות תנאים מלבד אלה הפגינו פרוטוקול זה, תמיד לבדוק את יעילות מטבולית תיוג (למשל, על ידי הדמיה פלורסנט).

לאחרונה, אסטרטגיה דומה בשם ריק (לכידת interactome RNA משועתקים לאחרונה באמצעות לחץ על כימיה), אשר משלבת רק האיחוד האירופי לתייג RNAs הכולל ומשתמש 254 ננומטר UV כדי קשר צולב RNAs וחלבונים, היה דיווחו37. ראוי לציין, 254 ננומטר UV ניתן להפעיל כל ארבע נוקלאוזידים טבעי, כמו גם האיחוד האירופי. לפיכך, הקרנת UV 254 ננומטר ייתכן קשר צולב האיחוד האירופי חינם מטבוליטים שלו (למשל, האיחוד האירופי פוספטים) עם המקביל מחייב חלבונים, אשר צריכים להילקח בחשבון ככל האפשר תוצאות חיוביות שגויות.

יישום מעניין אחד של CARIC היא לזהות RBPs בחיידקים RNAs אשר נמצאים בעיקר שאינם polyadenylated. זיהוי בקנה מידה גדול RBPs תספק לא בפז משאבים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של תקנות posttranscriptional חיידקים38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים 91753206, 21425204, ועל 21521003 ועל ידי 2016YFA0501500 פרוייקט פיתוח ומחקר מפתח הלאומית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter