Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Представлен подробный протокол для применения нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC) стратегии для идентификации белков, обязательного для обеих кодирования и некодирующей РНК.

Abstract

Всеобъемлющее выявление RNA-связывая протеинов (ОДП) является ключом к пониманию посттранскрипционного регулирования сети в клетках. Широко используется стратегия для захвата ОДП использует сплайсингу [poly(A)] целевой РНК, которая в основном происходит на эукариотические зрелой мРНК, оставляя большинство связывания белков non-poly(A) РНК неизвестные. Здесь мы описываем подробные процедуры недавно сообщили метода называется нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC), который позволяет транскриптом широкий захват ОДП, poly(A) и non-poly(A), объединяя метаболических маркировки РНК, в естественных условиях УФ cross-linking и bioorthogonal пометки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Человеческий геном транскрибируется в различные типы кодирования и некодирующей РНК (ncRNAs), включая мРНК, теорией, tRNAs, малые ядерные РНК (промотор), малые ядрышковые РНК (snoRNAs) и длиной некодирующих РНК (lncRNAs)1. Большинство из этих молекул РНК обладают одежда ОДП и функционировать как рибонуклеопротеида частиц (RNPs)2. Таким образом всеобъемлющее выявление ОДП является необходимым условием для понимания регулирования сети между РНК и ОДП, которая подразумевается в различных заболеваний человека3,,4-5.

За последние несколько лет стали свидетелями большой импульс ОДП, обнаружены в различных систем эукариотической2,6, включая человека7,8,9,10,11, мышь12,13,14, дрожжи9,,1516, данио рерио17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,,2122и паразитов человека23,24,25 . Эти достижения способствовали ОДП захвата стратегии, разработанной в Кастелло и др. 7 и Бальтца и др. 8 в 2012 году, который сочетает в себе в vivo УФ cross-linking РНК и взаимодействуя белками, oligo(dT) захват poly(A) РНК и масс-спектрометрия (МС)-proteomic профилирования на основе. Однако учитывая тот факт, что poly(A) в основном существует на зрелой мРНК, которые составляют для только ~ 3% - 5% эукариотических транскриптом26, эта широко используется стратегия не способна снимать ОДП, взаимодействующих с non-poly(A) РНК, включая большинство ncRNAs и пре мРНК.

Здесь мы приводим подробные процедуры недавно разработанной стратегии для захвата транскриптом всей poly(A) и non-poly(A) ОДП27. Назвать CARIC, эта стратегия объединяет в vivo УФ cross-linking и метаболических маркировки РНК с photoactivatable и «активная» Нуклеозидные аналоги (которые содержат bioorthogonal функциональной группы, могут участвовать в нажмите реакции), 4 - thiouridine (4СУ) и 5-ethynyluridine (ЕС). Шаги, которые являются ключевыми для получения идеальных результатов с ЦАРСКОЕ стратегии являются эффективным метаболических маркировки, УФ реакции структурообразования и нажмите кнопку и поддержания целостности РНК. Потому что Cu(I), используется в качестве катализатора в нажмите реакции может привести к фрагментации РНК, Cu(I) лиганд, который может уменьшить фрагментацию РНК имеет важное значение. Мы опишем, как для выполнения эффективного нажмите реакции в lysates клетки не вызывая серьезной деградации РНК.

Хотя ОДП захвата и идентификации в клетки HeLa только описан в настоящем Протоколе, ЦАРСКОЕ стратегия может применяться для различных типов клеток и возможно для живых организмов. Помимо захвата ОДП этот протокол также обеспечивает упрощенные пошаговые процедуры для MS пробоподготовки и белка идентификации и количественной оценки, которая может быть полезна для тех, кто не знаком с proteomic экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Предупреждение: Когда это применимо, реагентов, используемых следует приобрести в виде свободных РНКазы или растворенных в РНКазы бесплатно, растворителей (в большинстве случаев, в диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды). При обработке образцов РНК и реагенты, RNase бесплатно, всегда надевайте перчатки и маски и изменить их часто, чтобы избежать загрязнения РНКазы.

1. Подготовка Lysate о метаболически помечены и УФ сшитого клетки

  1. Метаболические включение ЕС и 4СУ
    1. Культура клетки HeLa в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C в атмосфере 5% CO2 . Культура ~ 4 x 107 НеЬа клетки (в два блюда 15-см) для подготовки экспериментальных или управлять для одного запуска MS стандартного образца.
    2. Когда культивируемых клеток HeLa достигают слияния ~ 80%, удалите питательной среды и добавить 15-мл подогретую свежей среды за 15-см блюдо.
    3. Добавить 15 мкл за блюдо 100 мм ЕС (растворяют в фосфат амортизированное saline (PBS)) до конечной концентрации 1 мм и 7,5 мкл за блюдо 4СУ 100 мм (растворяют в PBS) до конечной концентрации 0,5 мм для экспериментальных и noUV контрольных образцов. Добавьте 15 мкл за блюдо 100 мм ЕС (растворяют в PBS) в конечной концентрации 1 мм для no4SU-контрольных образцов.
      Примечание: 4СУ фото активации; Таким образом требуется защита от света после добавления 4СУ.
    4. Обложка блюда с фольгой и культура клетки для 16 х. Добавить половину суммы ЕС и 4СУ или только ЕС от шага 1.1.3 к экспериментальной, noUV- и no4SU-контрольных образцов, соответственно и культивирования для еще 2 ч.
  2. В естественных условиях Сшивки УФ
    1. Удалите средство культуры, вымыть клетки 3 x с 5 мл PBS за блюдо, и удалить остаточные PBS насколько это возможно.
      Примечание: Остаток жидкости позволит значительно уменьшить сшивки эффективность.
    2. Для экспериментальных и no4SU-контрольных образцов, блюда на льду со снятой крышкой и излучают клетки с 365 Нм УФ света 2 Дж/см2 , крест-компоновщик УФ.
    3. Для образцов noUV управления поместите блюда на льду и защищать их от света.
      Примечание: Все следующие шаги для noUV контрольных образцов должны быть выполнены в затемненной комнате.
  3. Лизис клеток и гомогенизации
    1. Добавить 1 мл на блюдо предварительно литического буфера (10 мм Tris∙HCl, рН 7,5, 50 мм LiCl, 0,02% Nonidet P-40 и Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-коктейль ингибитор протеазы бесплатно) в клетки. Очистить ячейки, используя погрузчик клеток резины и собирать предварительно лизис подвеска в 15 мл.
      Примечание: Этот шаг будет разорвать клеточной мембраны и отпустить растворимых цитоплазматических белков и РНК. Не центрифуга трубки и удалить супернатант.
    2. Для подвески из двух блюд 15см Отрегулируйте громкость до 6 мл, добавив предварительно литического буфера. Добавьте предварительно лизис подвеска равное количество R-литического буфера (200 мм Tris∙HCl, рН 7,5, 500 мм LiCl, 2% литий Додециловый сульфат [LDS]).
    3. Однородный lysate клетки путем передачи его через шприц с иглой узкий (27-G) несколько раз до lysate ясно и однородной. Инкубируйте lysate на 4 ° C с нежным вращения (~ 15 мин) за 1 ч.
      Примечание: Этот последний шаг позволит полностью денатурации белков. Lysate могут безопасно храниться на-70 ° C на срок до одного месяца.
  4. Подготовка к реакции нажмите
    1. Разбавить lysate путем добавления 20 томов буфера для разведения (50 мм Tris∙HCl, рН 7,5) и разделите его на 15 мл фракций.
      Примечание: Решения, содержащие высокую концентрацию соли и моющих средств поставит под угрозу эффективность Cu (I)-катализированное нажмите реакции; Таким образом буфер lysate должны быть изменены.
    2. Концентрат каждой фракции с помощью трубки 15 мл ультрафильтрации (с молекулярной массой отсечки 10 кДа) до тома меньше, чем 1 мл. Используйте размахивая ведро ротор вращаться ультрафильтрации трубки на 4000 x g при 4 ° C на ~ 15 мин.
    3. Добавить 14 мл буфера для разведения в концентрированной lysate дроби и повторите шаг 1.4.2. Объединить фракций и сконцентрировать их объемом 6 мл ультрафильтрацией (4000 x g на 4 ° C на ~ 15 мин).
      Примечание: Большинство из соли и теперь LDS будет быть удалены, поэтому lysate готовы к реакции нажмите. Lysate может храниться на-70 ° C до одной недели. Избегайте несколько циклов замораживания оттаивания, потому, что они приведут к значительной деградации РНК. Алиготе lysate если мелкие характеристики необходимы.

2. подготовка проб для РНК interactome захват

  1. Preclearing от lysate
    1. Добавить 100 мкл стрептавидина магнитные бусы на 6 мл lysate и осторожно поверните (~ 15 мин) за 30 мин при комнатной температуре для ликвидации естественно биотинилированным белки.
    2. Пелле бусины с помощью магнита (на ~ 20 минут при температуре 4 ° C) и передачи проверяться lysate к новой пробке.
  2. Производительность нажмите реакции
    1. Подготовьте смесь реакции: 6,5 мкл акций (100 мм азид биотин растворяют в диметилсульфоксида [ДМСО] в конечной концентрации 100 мкм), биотин 3.25 мкл запасов меди (сделать его свежим; 1 M CuSO4 растворяют в воде в конечной концентрации 500 мкм) , 65 мкл лигандом запасов (200 мм THPTA растворяют в воде в конечной концентрации 2 мм) и 262.75 мкл H2O.
      Примечание: THPTA означает трис [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) метил] аминов.
    2. Добавьте в смесь реакции до 6 мл проверяться lysate и хорошо перемешайте. Затем, добавьте 162.5 мкл сокращения реагента (сделать свежий; 40 мг/мл натрий аскорбината в конечной концентрации 5 мм) в lysate и хорошо перемешайте. Окончательный объем должен быть 6,5 мл.
    3. Инкубируйте реакционную смесь втечение 2 ч при комнатной температуре на орбитальный шейкер (800 об/мин). Добавить 5 мм ЭДТА в реакционной смеси и проинкубируйте его на 5 минут, чтобы утолить реакции.
  3. Мелкие характеристики
    1. Подготовьте смесь реакции как шаг 2.2.1 с запасом биотина заменены краситель запасов (например, 100 мм азид Cy5 растворяют в ДМСО).
      Примечание: Сумма Реагент должен корректироваться по объему lysate. 20 мкл Алиготе от lysate обычно достаточно для характеристики таких, как анализ флуоресценции в гель.
    2. Добавьте в смесь реакции lysate и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре. Затем, добавьте одну треть объема буфера выборки LDS (4 x), денатурировать при 55 ° C за 5 мин и разрешить образец на бис трис гель 10%.
      Примечание: Чтобы подтвердить, что сигнал флуоресценции представлена на РНК, включают элементы управления с пищеварением РНКазы A после щелчка реакции.
  4. Очистка реакционной смеси
    1. Добавьте восемь томов prechilled метанола (100%) закаленных реакционной смеси и Инкубируйте 30 мин при температуре-30 ° C для высыпания. Выполните осадков в 50-мл конические пробирок.
      Примечание: Если общий объем превышает 50 мл, разделите смесь реакции на два 50-мл конические пробирок.
    2. Подготовить воссоздание буфера: объединить один объем буфера A (4% натрия Додециловый сульфат [ПБ] и 10 мм ЭДТА) с восемь томов буфера B (Бридж-97, 150 NaCl и 50 мм триэтаноламин 1%, рН 7,4).
    3. Центрифуга на 4000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Добавьте ~ 1-2 мл метанола prechilled в гранулах. Пипетка вверх и вниз, чтобы сломать гранулы и убедитесь, что гранулы полностью приостановлены с без видимых куски. Заполните трубу с prechilled метанола. Повторите этот шаг 2 x.
    4. Центрифуга на 4000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Положил обратно, что трубы и центрифуги снова на 4000 x g 5 мин тщательно вытянуть остаточный метанол как можно больше не нарушая гранулы.
    5. Добавьте 10 мл буфера растворения гранул. Пипетка вверх и вниз до полного растворения гранул. Центрифуга на 4000 x g 10 мин при 4 ° C.
    6. Супернатант передать новой трубки. Соберите 20 мкл пример для контроля качества (см. раздел 4).
      Примечание: Теперь образец готова для захвата РНК interactome. Восстановленный пример может храниться на-70 ° C до одной недели.

3. РНК interactome захват

  1. Подготовка стрептавидина агарозы бусины
    1. Учитывать 1600 мкл стрептавидина агарозы навозной жижи (800 мкл поселились бусы) на 10 мл восстановленный образца 15 мл конические пластиковых пробирок.
    2. Спин вниз бусины в 4000 x g для 5 минут тщательно удалить супернатант не нарушая поселились бусины.
    3. Вымойте бусины с 10 мл 50 мм Tris∙HCl (рН 7,5). Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 x.
  2. Сродство пулдаун
    1. Передать образец очищен и восстановленный из шага 2.4.6 стрептавидина агарозы бусины (см. шаг 3.1). Инкубируйте на ночь с нежным вращения при 4 ° C.
  3. Мойка из бисера стрептавидина
    1. Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и передать новой трубки супернатант. Соберите 20 мкл пример для контроля качества.
    2. Вымойте бусины с 10 мл буфера мытья (2% SDS в PBS, рН 7,4). Проинкубируйте втечение 10 мин с нежным вращения (~ 12 мин) при комнатной температуре. Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант. Повторите 1 x.
    3. Повторите шаг 3.3.2 с мыть буфера B (8 M мочевины и 250 мм NH4HCO3 растворяется в воде). Повторите шаг 3.3.2 с мыть буфера C (2,5 М NaCl в PBS, рН 7,4). Затем вымойте бусины с 10 мл 50 мм Tris∙HCl (рН 7,5). Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант.
    4. Сплит бисера равномерно и передавать их на 2 пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  4. Элюирующий захватили RNPs
    1. Подготовить биотин Элюирующий буфер: биотин 12,5 мм, 75 мм NaCl, 7,5 Tris∙HCl (рН 7,5), 1,5 мм ЭДТА, 0,15% SDS, sarkosyl 0,075% и Дезоксихолат натрия 0,02%.
      Примечание: Магазин буфера при комнатной температуре, биотина может осадить при 4 ° C.
    2. Для 400 мкл промывают поселились бусы добавьте 400 мкл буфера биотин.
    3. Инкубируйте их на орбитальный шейкер (1500 об/мин) при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем инкубировать на орбитальный шейкер с блоком тепла (1500 об/мин, 65 ° C) для 10 min. спин вниз бусины (7800 x g 1 мин) и собирать eluted RNP.
    4. Бисер добавить 400 мкл буфера свежие биотина и повторите шаг 3.4.3. Объединить два elutes в одну трубу 15-мл.
  5. РНКазы пищеварение
    1. Добавьте три тома буфера для разведения eluted RNP уменьшить концентрацию SDS. Концентрат разреженных образца с помощью ультрафильтрации 0,5 мл трубки (с молекулярной массой отсечки 10 кДа; спина на 12000 x g при 4 ° C ~ 30 мин) до ~ 40 мкл.
    2. Добавить 0,5 мкг/мкл РНКазы A и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C выпустить ОДП из сшитого РНК. Сбор 2 мкл ОДП для контроля качества (см. раздел 4).

4. контроль качества

  1. Контроль эффективности пулдаун сходства
    1. Возьмите 10 мкл «до пулдаун» образца 2.4.6 и 10 мкл шаг «после пулдаун» образца из шага 3.3.1.
    2. Анализ образцов, с использованием стандартной западной помарке процедур (10% бис трис гель).
    3. Пятно винилидена фторида (PVDF) мембраны с стрептавидина ПХ конъюгата контролировать остаток биотина сигналы «после пулдаун» образца.
      Примечание: Если сигнал биотина образца «после пулдаун» больше чем одной-пятой сигнала «до пулдаун» образца, увеличьте количество стрептавидина агарозы бусы, используемые на шаге 3.1.1.
  2. Контроль эффективности общего захвата
    1. Возьмите 2 мкл выпустила ОДП образца от шаг 3.5.2 и 0,5 мкл образца «до пулдаун» (как 0.1% Ввод) с шагом 2.4.6.
    2. Анализ образцов, с использованием стандартных процедур окрашивания серебра.
      1. Исправьте гель с фиксации буфера (40% этанола, 10% уксусной кислоты) за 20 мин, затем сенсибилизации (13 мм2S Na2O3, ацетат натрия 83 мм, 30% этиловом спирте) за 30 мин.
      2. Промойте гель 3 x с водой на 5 мин и затем, выведение его с 15 мм AgNO3 решение для 20 мин мыть гель 2 x с водой для 1 мин, развивать его в 0,24 М Na2CO3 и 0,012% формальдегида и прекратить с 45 мм ЭДТА, когда окрашивание suffici ent.
        Примечание: Интенсивность окрашивания серебра захваченных ОДП должна быть аналогична ввода 0,1%.

5. Подготовка образцов для MS

  1. Пищеварение трипсина захваченных ОДП в гель 28
    1. Добавьте одной четвертой объема буфера выборки SDS (5 x) выпустила ОДП образцы из шага 3.5.2. Денатурируйте образца на 95 ° C в течение 10 мин.
    2. Разрешить ОДП на геле полиакриламида SDS 10% 1,5 мм.
    3. Пятно гель с серебром, следующие стандартные протоколы.
    4. Акцизный Лейн экспериментального образца или образца управления с штабелируя гель и основные группы РНКазы (~ 15 кДа) удалены.
    5. Подакцизным Лейн мелко нарежьте (~ 1-1,5 мм x ~ 1-1,5 мм).
      Примечание: Короткий край гель кусок должен быть не короче, чем 1 мм для предотвращения засорения в пипетку советы.
    6. Передача части гель пробки microcentrifuge и Отмойте с минигелей буфера (смесь равных объемов 100 мм Na2S2O3 и 30 мм K3[Fe(CN)6]).
    7. Промойте гель куски бикарбонат аммония 200 мм (ABC) до абсолютно бесцветный гель штук.
    8. Обезвоживает гель куски в 1 мл аккуратные Ацетонитрил (АКС). Увлажняет с 200 мкл 10 мм Дитиотреитол (растворяют в 50 мм ABC) и Инкубируйте на 56 ° C на 45 мин.
      Примечание: Полностью обезвоженный гель частей должна быть очень сложной и непрозрачной. Если по-прежнему мягкие куски гель после обезвоживания, удалите АКС и добавьте 1 mL аккуратные ACN к обезвоживанию снова.
    9. Охладить гель штук до комнатной температуры. Добавить 200 мкл iodoacetamide 58 мм (растворяют в 50 мм ABC) и инкубации при комнатной температуре 45 мин в темноте.
    10. После краткого мыть с водой обезвоживает гель куски в 1 мл аккуратные АКС.
      Примечание: Гель кусочки должны быть полностью обезвоженная.
    11. Увлажняет гель штук с соответствующим количеством 10 нг/мкл трипсина (растворяют в 50 мм ABC) и инкубировать при 37 ° C для 12-16 ч.
      Примечание: Куски гель следует полностью Регидратированные без непрозрачной ядер. Удалите любой избыток жидкости.
  2. Стабильных изотопов диметил маркировки переваривается пептидов 29
    1. Экстракт переваривается пептиды из кусочков гель, добавив 200 мкл буфера извлечения (Муравьиная кислота 5% и 50% АКС в воде) и проинкубируйте при 37 ° C за 30 минут с vortexing (на 1200 об/мин).
    2. Повторите шаг 5.2.1 2 x. Объединить экстрактов в одну трубу microcentrifuge.
    3. Сухие извлеченные пептиды вакуумной центрифугированием.
    4. Воссоздать пептидов в 200 мкл бикарбоната triethylammonium 100 мм (СТОС, рН 8,5).
      Предупреждение: Шаги 5.2.4 - 5.2.6 следует выполнять на льду в зонта.
    5. Добавьте 8 мкл 4% CH2O и 8 мкл 4% 13CD2O в экспериментальных и контрольных образцов, соответственно.
      Примечание: Для управления предвзятости стабильных изотопов маркировки, своп стабильных изотопов для экспериментальных и контроль образцов других биологически независимо реплицировать.
    6. Добавить 8 мкл 0,6 М NaBH3CN (сделать его свежие) и хорошо перемешать.
    7. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре за 1 час с vortexing.
    8. Охладить образцы на льду. Утолите реакции, добавив 32 мкл 1% водного раствора аммиака. Затем Далее утолите реакции, добавив 16 мкл муравьиной кислоты.
    9. Объедините экспериментальный образец с образцом из соответствующего управления в одном пробки microcentrifuge. Сухие образцы вакуумной центрифугированием.
  3. Фракционирование диметил меченых пептидов
    1. Подготовьте остановить и го добыча советы (StageTips)30.
      1. Вставьте наконечник 10-мкл Расширенный Длина, C18 мембраны.
      2. Добавьте 300 мкг высоком рН C18 бисера приостановлено в АКС до кончика.
      3. Место кончике upright в microcentrifuge трубки с домашним стойку, которые могут стабилизировать кончик и поднимите кончик от дна.
      4. Вращайте кончик на 1400 x g на 2 мин отклонения потока через.
      5. Вымойте кончик с 50 мкл 80% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
        Примечание: Регулировка рН раствора 10 мм ABC, добавив 28% Окисоводопод аммония.
      6. Вымойте кончик с 50 мкл 50% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
      7. Вымойте кончик с 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
    2. Воссоздать пептидов в 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0).
    3. Добавьте восстановленный пример подготовленный наконечник. Перезагрузите потока через наконечник для обеспечения эффективного пептид привязки.
    4. Вымойте кончик с 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
    5. Элюировать пептида поэтапная 12 фракций с 50 мкл 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% и 6% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0).
    6. Объединить две дроби с равным интервалом (фракция 1 с 7, 2 с 8, и так далее) чтобы получить шесть расход дроби.
    7. Сухие образцы вакуумной центрифугированием. Сушеные пептиды могут храниться при температуре-30 ° C.

6. производительность MS и анализа данных

  1. Пептид анализ по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии
    1. Воссоздать сушеные пептидных фракций от шага 5.3.7 в 15 мкл воды, содержащие 0,1% муравьиной кислоты. Проверьте pH восстановленный пептиды, пятнистость 1 мкл раствора на полосе pH (pH следует до 3 лет).
    2. Inject воссоздать образца в столбце жидкостной хроматографии (LC). Применить соответствующий градиент растворителя (растворитель, который A является вода, содержащие 0,1% муравьиной кислоты, растворитель B ACN, содержащие 0,1% муравьиной кислоты) в высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Типичный градиент растворителя B является следующим: 5% - 35% в 40 мин; 35% - 70% в 4 мин; и в 75% за 10 мин.
    3. Ионизировать eluted пептиды, электроспрей и эксплуатации масс-спектрометр в зависящих от данных режиме. Выбор 15 самых распространенных ионов (умножить заряженных: 2 +, 3 + или выше) в первоначальной MS сканировать тандемные масс-спектрометрия (МС/МС) сканирования (столкновения индуцированной диссоциации, CID). Установите размер динамического исключения 500 с максимальная продолжительность 25 s.
  2. Белка идентификация и количественная оценка с использованием MaxQuant 31
    1. Установите частоту ложных обнаружения (ФДР) идентификации белков 0,01 и задать количество уникальных пептиды 2 в целях повышения точности и надежности.
    2. Минимальный набор необходимых рассчитывает коэффициент (уникальный + бритва) для количественной оценки белков до 2 и включить повторно количественно и матч между запусками функций.
  3. Обогащение значение оценки с использованием Лимма пакет R/Bioconductor 32
    1. Выполнение управляемых t-тест, Реализовано Лимма для тестирования изменений Log2-раза против zero из по меньшей мере три биологических реплицирует. Используйте функцию read.table для чтения таблицы данных. Затем используйте функции lmFit и eBayes для установки данных. Используйте функцию topTable для экспорта результатов вычислений (включая усредненное изменение Log2-фолд и значения P ).
    2. Исправьте значения P с помощью метода Benjamini – Хёхберг для контроля ФДР.
    3. Примените ФДР 0.01 для создания списка белков, значительно обогатили в экспериментальных образцов. Задайте частоту среза двух - или три изменения для дальнейшего управления ложных срабатываний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Представитель результаты контроля качества шаги представлены. Результаты включают показатели анализа флуоресценции в гель, описанный в шаге 2.3.2 (рис. 1), Западный анализ помаркой описано в шаге 4.1.3 (рисунок 2A) и Серебряный пятнать анализа, описанный в шаге 4.2.2 (рис. 2B). Меры контроля качества важны для оптимизации ЦАРСКОЕ протоколов. Всегда включайте контроль качества при подготовке широкомасштабных экспериментов идентификации ОДП.

Figure 1
Рисунок 1: гель флуоресценции анализ образцов нажмите кнопку с надписью, описанные в шаге 2.3.2. (A) этой группы показывает типичный в гель флуоресценции шаблон, нажмите кнопку с надписью образцов. Только в вдвойне помечены примере группа сильных мазка на высокой молекулярной массой (> 250 кДа), который представляет сигнал сшитого RNPs. Чтобы отменить сигнал RNP, опустите 4СУ или ЕС или дайджест с РНКазы а. Фон острые полосы на более низкой молекулярной массой представляют сигналы неспецифических белков с надписью. (B) в некоторых случаях, может наблюдаться сильные смазывают группы (~ 130-250 кДа) в образце no4SU-управления. Эта группа представляет собой сигнал помечены uncross-связанных РНК, которые будет ухудшаться во время тепловой денатурации, в большинстве случаев. Он не будет мешать последующих процедур. CBB = Кумасси синий блестящий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: контроль качества сродства пулдаун эффективности и захватили ОДП. (A) Эта панель показывает Западный анализ помаркой биотина сигналов в образцах до пулдаун (вход) и в образцах после пулдаун (супернатант). Оценить отношение остальных сигналов и оптимизировать шарик сумму, используемые на шаге 3.1.1. (B) Эта группа показывает серебряный пятнать анализа захваченных ОДП, по сравнению с 0,1% ввода общего белка. Для клетки HeLa общий всего улавливания является ~0.05% - 0,1% ввода белков. Это значение может значительно отличаться из-за дисперсии метаболической эффективности маркировки различных типов клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: результаты представитель МС CARIC. (A) Эта панель показывает вулкан сюжет отображения среднем Log2-фолд изменить и скорректировать значения P количественных белков, вычисленное пакетом Лимма. 597 белков с Log2-фолд изменение > 2 и скорректированное значение P < 0,01 были классифицированы как «ЦАРСКОЕ ОДП». (B) Эта группа показывает перекрытие ЦАРСКОЕ белков с ранее выявленных человека poly(A) ОДП7,8,9,10,11. Перекрытые белки главным образом кодирования ОДП, в то время как остальная часть ЦАРСКОЕ ОДП с большей вероятностью некодирующих ОДП. Эта цифра является перепечатано из ранее опубликованных работ с разрешения Национальной академии наук27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сохранение целостности ярмарка РНК является одним из ключей к успешной ЦАРСКОЕ экспериментов. С соответствующие лигандами Cu(I) и тщательной работы деградация РНК может быть значительно меньше, хотя наблюдалось частичной деградации. Коэффициенты замещения ЕС и 4СУ в экспериментальных образцов, 1,18% и 0,46%, соответственно (данные не показаны). Для нетронутыми РНК с длиной 2000 nt, ~ 90% РНК содержат по крайней мере один из ЕС и один 4СУ. Для частично деградировавших РНК с длиной 1000 nt, ~ 70% РНК содержат по крайней мере один из ЕС и один 4СУ. Таким образом частичной деградации РНК не резко снизить эффективность CARIC, тогда как серьезной деградации не является приемлемым.

Еще один важный шаг — шаг 1.4, подготовка нажмите реакции. Cu (I)-нажмите катализируемой реакции на РНК чувствительны к концентрации LDS. Высокая концентрация LDS (> 0,1%) приведет к уменьшению маркировки сигналов на ЕС содержащие РНК и увеличение фонового сигналов на белки (данные не показаны).

В дополнение к ЕС CARIC также совместим с другими интерактивными нуклеозидов, таких как алкинилфосфонатов и azido аналогов аденозин33,34,35,36. Однако применение CARIC существенно ограничена метаболические эффективность неестественным интерактивными нуклеозидов в биологической системе интерес. Поэтому прежде чем выполнять CARIC, используя условия, отличные от тех, кто продемонстрировал в этом протоколе, всегда проверяйте метаболических маркировки энергоэффективности (например, путем флуоресцентных изображений).

Недавно аналогичная стратегия под названием Рик (захват недавно транскрипции РНК interactome с помощью клик-химия), которая включает в себя только ЕС для обозначения всего РНК и использует 254 Нм УФ перекрестные ссылки РНК и белков, был сообщил37. В частности 254 Нм УФ может активировать все четыре природных нуклеозидов, а также ЕС. Таким образом 254 Нм УФ облучение может перекрестные ссылки бесплатно ЕС и его метаболитов (например, ЕС фосфаты) с соответствующей связывания белков, которые должны быть приняты во внимание в качестве возможных ложных срабатываний.

Один интригующий CARIC применяется для выявления ОДП в бактерии, чьи РНК в основном не polyadenylated. Крупномасштабные идентификации ОДП обеспечит бесценными ресурсами для понимания молекулярные основы посттранскрипционного правил в бактерии38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается национальные естественные науки фонд из Китая грантов 91753206, 21425204 и 21521003 и Национальный исследовательский ключ и 2016YFA0501500 развития проекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter