Summary
Denne metoden for første gang beskriver pålitelig eksperimentelle prosedyrer for effektiv induserbart metanol-fri rekombinante proteiner produksjon i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), ansette karbon kilde regulert arrangører P DCog PDF småskala eksperimenter mens dyrking parametere kan bli overvåket online, og en konstant glyserol feed brukes.
Abstract
Metanol er en veletablert karbon kilde og induser for effektiv protein produksjon ansette Pichia pastoris (P. pastoris) som vert på mikro-, lab og industriell skala. Men dens toksisitet og brannfare er det et ønske om å unngå metanol samtidig opprettholde høy produktiviteten til P. pastoris. Småskala bioreactor nærområdet (0,5-5 L volum) brukes vanligvis til å evaluere en belastning og egenskapene protein produksjon siden Mikroskala dyrking i dypt bra plater kan neppe kontrollert eller bruker dyrt utstyr. Videre ble tradisjonelle protokoller for dyrking og induksjon av P. pastoris etablert for grunnleggende uttrykk eller metanol induksjon og så langt ingen pålitelig protokollene ble beskrevet skjermen P. pastoris uttrykk stammer med derepressible arrangører i (kontrollert og overvåket) parallelle nærområdet. For å forenkle slike første lokalt for å karakterisere og sammenligne nye protein produksjon stammer, etablerte vi en enkel riste flasken dyrking system for metanol ytringsfrihet som simulerer bioreactor betingelser inkludert en konstant langsom glyserol feed og online overvåking, og dermed kommer nærmere den virkelige forholdene i bioreactors sammenlignet med mest brukte småskala satsvis i nærområdet. Undertrykt arrangører PDC og PDF ble brukt for å drive rekombinant protein uttrykk i P. pastoris, karbon kilde. Polymer plater med innebygd karbon kilde, slippe en konstant mengde glyserol, sikret en fôr rente levere den nødvendige energien for å opprettholde arrangørene aktive samtidig biomasse generasjon lav.
Introduction
Forbedring i ytelse og pålitelig dyrking forholdene på stor skala for rekombinante proteiner produksjon av mikroorganismer som bakterier eller gjær er en av viktigste behovene til dagens bioteknologi1 og den kommersielle suksessen av industrielle programmer. Dueto enkel dyrking prosedyrer og media, høy avkastning og godt preget verktøy2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) er en mye brukt ikke-konvensjonelle gjær for rekombinante proteiner produksjon. Flere nyskapende verktøy utvikles stadig for denne arten, som nye uttrykk vektorer inkludert nye arrangører som alternativer til den brukte PAOX1, regionen arrangøren av alkohol oksidase 1 gen3, 4,5. En 500 bp lang DNA sekvens oppstrøms hurtigtasten katt1 (CTA1) genet ble identifisert som formidler regionen, som gir en ny metanol-fri og allsidig strategi i P. pastoris. Hurtigtasten katt1 genet er bare catalase genet av P. pastoris protein ligger i peroxisomes. Catalase spiller en viktig rolle i detoksifisering av reaktive oksygen arter, som er som oppstår, f.eks., fra metanol oksidasjon i peroxisomal MUT veien eller under beta oksidering av fettsyrer6,7. Uttrykk for hurtigtasten katt1 genet er undertrykt i prescence glukose eller glyserol i dyrking medium og derepressed på uttømming av disse karbon kilder8. Videre kan uttrykk for catalase genet indusert med metanol og remarkebly også med oljesyre, tilsynelatende blir bare genet av P. pastoris MUT veien som kan bli indusert med oljesyre selv når lignende uttrykk nivåer som med metanol induksjon9.
500 bp fragmentet av denne P. pastoris hurtigtasten katt1 promoter, som kalles PDC (noen ganger også FORKORTEDE Phurtigtasten katt1-500), har allerede blitt testet for produksjon av intracellulært uttrykt og utskilles proteiner og det viste seg for å være en attraktivt alternativ til to klassiske P. pastoris arrangører-sterk konstituerende PGAP og metanol induserbart PAOX1, som ble utviklet mer enn 20 år siden. PDC klarte å nå 21% (CalB) og 35% (HRP) volumetriske aktiviteter sammenlignet PGAPET i sukker rik medium. På metanol induksjon, PDC bare svare ikke raskere enn PAOX1, men også tydelig kunne utkonkurrere det av en 2,8 fold høyere siste titer CalB9.
Foruten PDC, hadde en orthologous selskapet (PDF) identifisert viser en lignende regulering profil. Det er imidlertid betydelig sterkere enn PDC under derepressed samt under metanol-indusert forhold (manuskriptet forberedelse)3.
I tilfeller hvor sterk konstituerende PGAP mislyktes på grunn av fysiologisk problematisk eller cytotoksiske proteiner10,11representerer PDC og PDF et ideelt alternativ. Mikro skala eksperimenter, uttrykket drevet av disse arrangører starter etter uttømming av første karbon kilde (f.eks., glukose eller glyserol), som muliggjør biomasse produksjon uten å belaste cellene med overuttrykte rekombinant protein helt fra begynnelsen. Mens begge disse arrangører er fortsatt induserbart av metanol, aktivering av derepression gjør ytterligere bruk av den preinduction fasen i forhold til uttrykkene ansette PAOX1. Videre kan PDC og PDF brukes for metanol-fri protein produksjon, som er ønskelig mål for store industriprosesser12.
Utviklingen av gjeldende produksjon stammer og uttrykk konstruksjoner må flere trinn i utviklingen sendes for å snevre inn fra mange transformants til den foretrukne kandidaten for oppskalering. Screenings utføres vanligvis i høy gjennomstrømning i flere bra plater (mikro skala: mindre enn 0,5 mL) for å fange en rekke kloner så stor som mulig. Etterfølgende re screening og re-re-screening er det neste trinnet, etterfulgt av riste flasken (liten skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreactor screenings12. Men er det ønskelig å ha en metode, som ligner mest mellom ulike skalaer fra hundrevis av microlitres i dyptgående brønn plater til flere ml i riste flasker til senere skalaen opp av metanol-fri produksjon i godt kontrollerte bioreactors. Selv om rist kolber kan gi allerede lik volumer som små bioreaktorer, finnes det flere begrensninger, som er svært relevante for storskala protein produksjon som konstant mating, lufting og online-overvåking13 av vekst og oksygentilførsel. Optisk overvåking ansette tilpasset riste flasker og risting enheter gir en kostnadseffektiv alternativ til mer avansert utstyr for parallell dyrking samtidig som konstant online informasjon om store kultur parameterne som biomasse og oppløst oksygen konsentrasjon. Langsom frigjøring av karbon kilde fra polymer operatører kan brukes for å sikre en konstant og kontrollert feed uten å stole på komplekse tekniske løsninger og enheter, simulere flere lignende forhold av bioreaktorer enn tidligere brukt enkel full utarming av karbon kilde9,10, begrensende hvor energi for pågående protein uttrykk blir.
Følgende beskriver en liten til middels skala metanol-fri kontrollerbar protein uttrykk i P. pastoris basert på den nye arrangørene PDC og PDF. Induksjon av derepression innebærer to faser. Den første korte fasen av biomasse akkumulasjon uten produksjon av protein av interesse, med en karbon kilde som represses arrangørene og en fase av målet protein produksjon, der en karbon kilde leveres liten, men konstant konsentrasjoner opprettholde selskapet derepressed. Avlytting viktigste dyrking parametere brukes i hele dyrking perioden. Målet var å gi en metanol gratis, pålitelig og skalerbar dyrking system for P. pastoris.
Protocol
1. Media forberedelse
- Bufrede minimal media (BMG med glyserol, BMD med druesukker som karbon kilde) forberedelse (1 L)
- Autoclave 650 mL destillert vann i en 1 L skrukork glassflaske. Etter avkjøling, ferdig medium ved å legge til 100 mL autoklaveres 10 x YNB (134 finans gjær nitrogen base uten aminosyrer), 200 mL kalium fosfatbuffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glukose eller glyserol (avhengig av hvor ønsket genererte biomasse i bunke) 2 mL steril 500 x Biotin (10 mg/mL) løsning og fyll opp til 1 L med sterilt destillert vann.
Merk: Alle ingredienser må være autoklaveres i separate flasker. Biotin er ødelagt når autoklaveres, og derfor må være filter sterilisert med 0,2 µm membran filtre.
- Autoclave 650 mL destillert vann i en 1 L skrukork glassflaske. Etter avkjøling, ferdig medium ved å legge til 100 mL autoklaveres 10 x YNB (134 finans gjær nitrogen base uten aminosyrer), 200 mL kalium fosfatbuffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glukose eller glyserol (avhengig av hvor ønsket genererte biomasse i bunke) 2 mL steril 500 x Biotin (10 mg/mL) løsning og fyll opp til 1 L med sterilt destillert vann.
- Bufrede medierik (BYPG) (1 L)
- Autoclave 700 mL destillert vann med 1% w/v gjær ekstrakt og 2% w/v pepton i en 1 L skrukork flaske. Etter avkjøling, Legg 30-100 mL separat autoklaveres 10% w/v glyserol, 200 mL kalium fosfatbuffer (1 M, pH 6) og fyll opp til 1 L med sterilt destillert vann.
2. rist kolber forberedelse
- Legge til 5 mL destillert vann i 250 mL forbløffet riste flasker, dekke det med to lag bomullsklut og fikse det på plass med gummistrikk. Dekk kluten med et stykke aluminiumsfolie.
- Autoclave flasker på 121 ° C for 20 min for full sterilisering.
- Fjern gjenværende vann fra flasken og aliquot 50 mL av tidligere forberedt media til hver kolbe.
3. over natten kultur vaksinering
- Start en overnatting kultur (ONC) med en enkelt frisk koloni av ønsket uttrykk belastningen i 5 mL av YPD (1% w/v gjærekstrakt, 2% w/v pepton, 2% w/v glukose) i et 50 mL sentrifuge rør samtidig la lokket litt åpen for å tillate riktig lufting.
- La det vokse over natten på 28 ° C, 80% fuktighet, i en shaker på 100-130 rpm (2,5 cm risting diameter).
4. mål oppsett og viktigste kultur dyrking
- For å sette opp online overvåking systemet, følger du produsentens instruksjoner for riktig kalibrering av enhetene.
- Plass en datamaskin der riktig programvare for overvåking er installert i området for en Bluetooth-tilkobling til målet stasjoner. Start programvaren for å koble enhetene via Bluetooth.
- Slå på Bluetooth-tilkoblingen på biomasse måling enheten ved å trykke knappen sølv på forsiden.
- I programmet klikker du enheter og Finne enheter.
Merk: Enheter skal vises som en liste i vinduet under oppgaven linjen. Hvis ikke, er det tilrådelig å Kontroller at batteriene er ladet og datamaskinen er innen rekkevidde for en Bluetooth-tilkobling. - Dra og slipp funnet enhetene til rutene på høyre side av skjermbildet Måling skuffen.
- Klikk Koble.
Merk: Når tilkoblingen er fullført, vises en kontroll-skjerm. - For å starte en prøvetur for Bluetooth-tilkoblingen, klikker du mål.
- Definere eksperimentet.
- Klikk Start måling, navnet eksperimentet og aktiverer alle parametere for å overvåke.
Merk: Lisenser er nødvendig for hver av de mulige målte parametrene. - Angi intervall 3 min.
Merk: Intervallet angir hvor ofte målepunktene tas og hver målingen resultater i en etterpå. Måle hvert minutt er svært nøyaktig, men mye data genereres som gjør det mer arbeidskrevende å vurdere. - Angi Gjennomsnitt målepunktene 11.
Merk: Denne innstillingen bestemmer hvor mange målepunktene faktisk tatt hver 3 minutter. Utdataene er derfor middelverdien av 11 målepunktene over 11 s. - Angi navnene på prøvene.
- Hopp over neste skjermbilde, som vinkelen var allerede kalibrert før (trinn 4.1).
Merk: En prøvetur for Bluetooth-tilkobling før vaksinere de viktigste kulturene anbefales å sikre stabil tilkoblinger og riktig plassering av tilkoblet datamaskinen. Også må batteriene lades.
- Klikk Start måling, navnet eksperimentet og aktiverer alle parametere for å overvåke.
- Måle celle tettheten av ONC (trinn 3.1) fortynnet i dyrking medier (1:20) i et spektrofotometer på 600 nm bølgelengde. Vaksinere 50 mL av mediet (anbefalt karbon kilde konsentrasjon 0.3-1%, ulike medier mulig som beskrevet i trinn 1.) med ONC et OD600 av 0,05 ved hjelp av følgende beregning.
- Plasser flasker i detektorer og riste på 28 ° C, 130 rpm og 80% fuktighet.
Merk: Det er svært viktig å gi kulturen 5 min av risting før starte målingen til unngå celler stikker til bunnen av flasken og gir feil verdier. - Klikk Start måling i programvaren.
- Ta 0,2 mL prøver for cellen tetthet måling 4T etter inoculation og når karbon kilde blir utarmet (besluttsomhet beskrevet i trinn 4.7) i triplicates. Fortynne eksemplene riktig i dyrking media (første måling 1:5, andre måling 1:20) og måle absorpsjon på 600 nm wavelength i et spektrofotometer. Før du fjerner flasker og selv før du stopper shaker, alltid pause målingen i programvaren.
Merk: Detektorer er kalibrert for opptak parameterne under definerte risting forhold og vil gi tull mål når innspillingen fortsatt kulturer. Kontroller også at alltid skal vente 5 min av risting før måling igjen. Cellen tetthet målinger er avgjørende fordi detektoren leverer bare verdier for biomasse og ikke ekte celle tetthet. En kalibrering funksjon mellom OD600 (x-verdier) og verdiene ved online målesystemet (y-verdier) kan oppnås ved å måle flere timepoints spektrofotometrisk. Verdiene er ikke i en lineær men i en logaritmisk relasjon etter følgende kalibrering funksjon:
y: OD600 verdier skaffet spektrofotometer
x: verdier skaffet online målesystem
k: skråningen
d: aksen skjæringspunkt
Stigningstallet og skjæringspunktet aksen kan deretter brukes til å konvertere en verdi til den tilsvarende OD600 verdien. I Excel kan man tegne spektrofotometrisk fått OD600 verdiene mot verdiene fra det elektroniske systemet fra den samme timepoint. En logaritmisk trendlinje og tilsvarende ligningen vil gi kalibrering funksjonen ovenfor. - Dyrke til karbon er nesten utladet (ca 12-20 h). For dette formålet, la kulturer vokse før det kan sees i programvare diagrammene at oksygen konsentrasjon nærmer seg null og cellene i eksponensiell vekstfase.
Merk: Dette er tilfelle for karbon kilde konsentrasjoner i denne protokollen. Timepoint av karbon kilde uttømming kan fastsettes med online overvåking systemet som det vises exemplarily i figur 1 i delen representant resultater når oksygennivået nærmer seg null og cellene i eksponensiell vekst fase.
5. protein uttrykk av de undertrykkelse
- Når timepoint beskrives i trinn 4.6 er nådd, kan du begynne å mate kulturer ved tilsetning av fire feed plater per kolbe under sterile forhold.
Merk: Under beskrevet betingelser, fire glyserol feed plater release 2 mg/t glyserol ifølge produsenten. - Fortsette dyrking 60-90 h mens du tar prøver hver 24 h å overvåke protein uttrykket av en analyse av valg (f.eks., Bradford analysen15, SDS side16 eller aktivitet analyser) og tetthet målinger.
6. kultur høsting
- Etter 60-90 h dyrking, fylle kulturer i 50 mL sentrifuge rør for høsting av sentrifugering 4000 x g, 4 ° C i 10 min.
Merk: Nedbryting (for utskilles proteiner) eller celler (for intracellulær protein uttrykk) kan høstes med sentrifugering 4000 x g, 4 ° C i 10 min og videre analyser kan gjøres. - Eksportere online måling dataene som en regnearkfil fra programvare for videre analyse.
- Fyll 5-10 mL destillert vann til alle flasker og autoklav å deaktivere de resterende cellene.
Representative Results
Som beskrevet i delen protokollen, registrerer programvaren parameterne viktig dyrking over hele dyrking. Figur 1 viser effekten av biomasse utvikling og oksygen konsentrasjon under en dyrking begynte med enten 0,5% (figur 1A) eller 0,3% (figur 1B) karbon kilde i bunken etterfulgt av tillegg av glyserol feed plater. Online overvåking systemet er spesielt nyttig for de undertrykte lokalt som timepoint av karbon kilde uttømming etter batchen kan bestemmes akkurat. Som det kan ses i figur 1, er oksygen konsentrasjon i medium synkende raskt og nærmer seg null, spesielt for 0,5% glyserol i bunken (figur 1A) mens biomassen øker eksponentielt på dette punktet. Her cellene er i eksponensiell vekstfase, og for å få optimal bruk av karbon kilde utgivelsen, kort tid før kultur når den stasjonære fasen, mate platene skal legges slik det er beskrevet i protokollen. Tillegg av feed platene før oksygen konsentrasjon når null er viktig for de undertrykte protein uttrykk å hindre cellene fra oksygen-begrensning. Lavere glyserol konsentrasjoner reduserer effekten av kortsiktige oksygen begrensninger som kan ses i figur 1B og anbefales derfor for de undertrykte protein uttrykk.
I følgende resultatene av to forskjellige dyrking eksperimenter-ansette beskrevet protokollen og overvåkingssystem som vist i figur 1 -er beskrevet. I det første eksperimentet, en P. pastoris belastning produsere gluko fra Aspergillus niger (A. niger) under kontroll av PDC og andre en P. pastoris belastning produsere veksthormon under kontroll av PDF vises.
I dette eksperimentet, ble glukose oksidase produksjon under kontroll av PDC undersøkt. Derfor ulike dyrking strategier ble sammenlignet: glyserol pulserende, konstant glyserol feed ved feed plater og dyrking uten noen feed eller pulserende. Dyrking ble gjort i 50 mL bufrede minimal media med 0,5% glukose som eneste karbon kilde i 250 mL riste flasker (tabell 1).
På 160 h dyrking, de høyeste biomasse konsentrasjonene ble innhentet, når en fôring strategi med glukose satsvis for biomasse produksjon (38 h) og glyserol pulserende (0,25% w/v glyserol etter 38 h., 61 h og 86 h dyrking) var ansatt (0.21 finans totalt sekretoriske protein, 8.4 U/mL). 2-fold reduksjon av biomasse konsentrasjon og den totale mengden utskilles protein ble innhentet, når feed diskene ble lagt etter 38 h. glukose parti, var volumetriske aktiviteten selv 1 U/mL høyere sammenlignet med dyrking med glyserol pulserende . Dette angir at en betydelig mengde utskilles protein ikke bidrar til volumetriske aktiviteten i nedbryting og kan skilles ut i en inaktiv form. Derfor favoriserer høyere glyserol konsentrasjoner fra glyserol pulser tilsynelatende dannelsen av biomasse i stedet for målet protein produksjon og konstant lav glyserol utgivelsen førte til mer enn to ganger høyere bestemt produktivitet.
Et annet eksperiment ansette metoden de undertrykte uttrykket ble gjort ved å uttrykke human growth hormone (hGH) under kontroll av PDF. Konstruer var stabilt integrert i genomet av P. pastoris belastning BSYBG11. Her 50 mL av BYPG, bufres rik medium, i 250 mL forbløffet riste flasker ble brukt med 0,3% (w/v) glyserol som karbon kilde i bunken. På glyserol utarming, ble protein uttrykket med konstant glyserol feed sikret ved tilsetning av 4 feed plater per kolbe og sammenlignet med ingen glyserol feed (figur 2).
Figur 2 viser sammenligningen mellom hGH uttrykk og biomasse utvikling av den samme stammen dyrket med og uten konstant glyserol feed. Som analysen sandwich ELISA ble brukt med sekundær antistoffer del HRP og oppdagelsen ble gjennomført med 3,3′, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) som substrat. Spesielt for dette proteinet, det syntes å være tilfelle at uten noen fôring, cellene begynner å fornedre produsert protein etter ca 30 h (lys blå ruter), mens fôring, denne forringelsen kan være forhindret (mørk blå trekanter) og selv protein konsentrasjon per biomasse fortsatt økt etter 150 h dyrking. Som allerede observert for Hansenula polymorpha14viser dette resultatet hvordan bytte fra parti, som den brukes vanligvis i riste flasken skala, matet satsvis modus kan optimalisere P. pastoris i nærområdet.
Figur 1: visualisering av online registrert parametere under to lokalt med forskjellige glyserol konsentrasjoner i bunken. I nærområdet ble startet med 0,5% w/v (A) og 0,3% w/v (B) glyserol i bunken etterfulgt av de undertrykkelse fase der celler ble matet ved å bruke 4 feed plater per kolbe (slipp hastighet på 0,5 mg/t/plate ifølge produsenten). De stiplede linjene viser oksygen konsentrasjon i medium, mens kontinuerlig linjene viser cellen tetthet (OD600). Viser standardavviket for seks replikerer (2 biologiske, tre tekniske hver). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sammenligning av menneskelig veksthormon (hGH) uttrykk i satsvis og matet-batch modus. hGH innhold indikeres av absorpsjon verdier ved 405 nm ved en ELISA hvor 2nd antistoffer var en HRP fusjon og TMB ble brukt som et medium for gjenkjenning. Vises resultatene for to forskjellige kulturer: lys blå linje og torg skjerm celle tetthet og hGH konsentrasjon normalisert av cellen tettheter på en kultur uten noen feed når, sammenlignet med en kultur, der glyserol feed plater brukt (mørk blå linjer og trekanter). Viser standardavviket for seks replikerer (2 biologiske, tre tekniske hver). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PDC- GOX på 160 h dyrking tid | OD600 | Vol. aktivitet [U/mL] | Totalbeløp utskilles protein [mg/mL] | volumetrisk aktivitet per celle tetthet | |||
| Mener | SD | Mener | SD | Mener | SD | Mener | |
| BMD1% satsvise + glyserol pulserende | 74.6 | 2 | 8.4 | 2.4 | 0,21 | 0,01 | 0,11 |
| BMD1% satsvise + konstant glyserol feed | 32,5 | 0,3 | 9.4 | 0,7 | 0.09 | 0,01 | 0.29 |
| BMD1% satsvis | 18,8 | 0,6 | 3.7 | 0,7 | 0,01 | 0 | 0,2 |
Tabell 1: resultatene av metanol uavhengige GOX uttrykk under kontroll av de undertrykte selskapet PDC .
Discussion
Denne metoden presenterer en protokoll som er pålitelig for effektiv metanol uavhengig induserbart uttrykket av P. pastoris som et alternativ til klassisk metanol indusert protein uttrykk drevet av PAOX112. De repressible arrangører, som PDC, PDF eller beskrevet tidligere mutert PAOX1 varianter17, bygge molekylær grunnlaget for dette nye protein produksjonen konseptet. Vist representant resultatene understreker nytten og gjennomførbarhet av rekombinant protein uttrykk i P. pastoris av de undertrykte arrangører og småskala screening med enkel avlytting. På den ene siden, kan skadelig og giftige metanol som vanligvis brukes for induksjon av AOX1 arrangøren fjernes fra dyrking. På den annen side, vekst og produksjonsfasen protein er montert9 i motsetning konstituerende protein uttrykk, f.eks., med brukte PGAP. Dette er spesielt nyttig når cellene skal uttrykke giftig eller skadelige proteiner som viser en byrde for dem.
Muligheten til å starte i nærområdet med forskjellige karbon kilde konsentrasjoner kan beslutningen om hvor mye biomasse man ønsker å få før produksjonsfasen protein starter. Når du velger en lavere karbon kilde konsentrasjon i bunken, reduseres oksygen overføring begrensninger på grunn av for høy celle tettheter mens derimot høyere celle tettheter kan også resultere i høyere protein titers. Ved å overvåke kultur utviklingen biomasse generasjon og Oksygenkonsentrasjoner, kan det optimale tidspunktet for matet-batch innvielsen bestemmes lett som det er vist i figur 1.
Online overvåking av parameterne dyrking, bør et passende målesystem brukes. Biomasse måleinstrument (f.eksSFR Vario) er en enkel og økonomisk online målesystem for kultur overvåking i riste flasker. Optoelektronisk leseren bestemmer cellevekst i flasken via spredte lys gjenkjenning og leser ut signalet av oksygen sensor integrert i flasken. Optikk for biomasse måling består av en LED som avgir et lys signal, som er spredt av partikler (celler) i kultur buljong og oppdaget med en photodiode. Optiske sensorer avgir fluorescens når opphisset med lys av en bestemt bølgelengde. Avhengig av analytt molekyler stede endres fluorescens signalet, som er oppdaget av leseren optikk og oversatt til konsentrasjon verdier. Men må en celle tetthet måling kalibrering opprettes på forhånd, siden målesystemet ikke er måle faktiske OD600 verdier. Oksygen uptake rate kan beregnes fra skråningen av oksygen kurven med reader-programmet, og kroppstemperatur samt rpm registreres kontinuerlig sammen med de andre parameterne. For å aktivere overvåking med dette systemet, må riste kolber tidligere være utstyrt med passende sensorer for de ønskede parameterne.
Tillegg av fire slow-release polymer plater gir en konstant mengde glyserol til kultur kjøttkraft, biomasse akkumulering er nesten stoppet og rekombinante proteiner produksjon fortsetter. Fastsettelse av feed plate tillegg tidspunktet er ikke en avgjørende skritt i dette eksperimentet, men det anses at en tidlig feed start før den eksplosive vekst fasen kan være hemme selskapet aktiveringen som uttrykket begynner på karbon kilde uttømming. I tillegg kan totalen mate tid på grunn av polymer kapasitetsbegrensninger reduseres, mens forsinke feed når cellene har nådd den stasjonære fasen kan føre til sultne og nedbrytning av allerede produsert protein. Beløpet av mate plater brukes i denne protokollen identifiserte eksperimentelt for optimal karbon kilde versjon å holde selskapet de undertrykte mens du holder biomasse generasjon lav (data ikke vist). På denne måten i nærområdet kan være utført lett over 160-180 h uten innblanding.
Main søknader av denne nye protokollen blir i uttrykket klone screening, enzym utvikling og oppdagelsen, karakterisering og utvikling av nye arrangører ansette en metanol-fri dyrking protokoll i godt overvåket forhold. I prinsippet skal den samme protokollen gjelde for blandet-feed strategier ansette metanol og begrenset fermentative karbon kilde feeder som beskrevet av Panula-Perälä et al. i 201418.
Disclosures
Selv om presentert protokollen er generelt gjelder for dyrking og induksjon under derepressed forhold, erklærer bisy EU har en interesse i kommersialisering av den nye derepressed arrangørene brukt i denne studien.
Acknowledgments
ROBOX har mottatt finansiering fra europeiske Union (EU) prosjektet ROBOX (grant avtalen n ° 635734) under EUs horisonten 2020 program forskning og innovasjon handlinger H2020-LEIT BIO-2014-1. Synspunkter og meninger uttrykt her er bare de av forfatteren/forfatterne, og nødvendigvis ikke de av EU forskning byrået. Den europeiske unionen er ikke ansvarlig for bruk som kan gjøres til informasjonen heri.
Doktoravhandlinger J. Fischer er co-finansiert av en bevilgning for "Industrienahe avhandling" østerrikske finansiering byrået FFG.
Vi takker Gernot John (PreSens GmbH) for nyttig diskusjoner og verdifulle innspill for manuskriptet utkastet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
| Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
| BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
| BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
| Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
| Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
| Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
| Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
| Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
| Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
| SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |
References
- Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).
- Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
- Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
- Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
- Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
- Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
- Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
- Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , Acta University Oulu C 480 (2014).
- Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
- Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
- Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).
