Denne metode for første gang beskrives pålidelige eksperimentelle procedurer for effektiv inducerbar methanol-fri rekombinante protein produktion i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), beskæftiger carbon kilde reguleret initiativtagere P DCog PDF i lille skala eksperimenter mens dyrkning parametre kan overvåges online, og en konstant glycerol foder anvendes.
Methanol er en veletableret carbon kilde og inducer for effektiv protein produktion beskæftiger Pichia pastoris (P. pastoris) som vært på mikro-, lab og industriel skala. Men på grund af dens toksicitet og antændelighed, der er et ønske om at undgå methanol samtidig opretholde den høje produktivitet af P. pastoris. Lille skala bioreaktor udlæg til planteavl (0,5-5 L arbejder bind) er almindeligt anvendt til at evaluere en stamme og protein produktion karakteristika da individuel dyrkning i dyb brønd plader kan næppe kontrolleret eller afhængig af dyrt udstyr. Derudover blev traditionelle protokoller for dyrkning og induktion i P. pastoris etableret for konstituerende udtryk eller methanol induktion og indtil videre ingen pålidelig protokoller blev beskrevet til skærmen P. pastoris udtryk stammer med derepressible initiativtagerne i (kontrollerede og overvågede) parallelle udlæg til planteavl. For at forenkle disse indledende udlæg til planteavl til at karakterisere og sammenligne nye protein produktionsstammer, etableret vi en simpel ryste kolben dyrkning system for methanol ytringsfriheden, der simulerer bioreaktor betingelser herunder en konstant langsom glycerol feed og online overvågning, dermed kommer tættere på de reelle forhold i bioreaktorer i forhold til det meste anvendte små batch udlæg til planteavl. Undertrykt initiativtagere PDC og PDF blev anvendt til at drive rekombinante protein udtryk i P. pastoris, carbon kilde. Polymer-diske med integrerede carbon kilde, frigive en konstant mængde af glycerol, forsikrede et tilførselshastigheden levere den nødvendige energi til at opretholde initiativtagerne aktive samtidig med at den biomasse generation lav.
Forbedring af udbyttet og pålidelige dyrkning betingelser på stor skala for rekombinante protein produktion af mikroorganismer såsom bakterier eller gær er en af største dagens bioteknologi1 og de kommercielle succes af industrielle behov applikationer. Dueto enkel dyrkning procedurer og medier, højt udbytte og godt karakteriseret værktøjer2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) er en meget anvendt ikke-konventionelle gær for rekombinante protein produktion. Yderligere innovative værktøjer udvikles konstant for denne art, ligesom nye udtryk vektorer herunder nye projektledere som alternativer til den udbredte PAOX1, regionen promotor af alkohol oxidase 1 gen3, 4,5. En 500 bp lange DNA-sekvens opstrøms af CAT1 (CTA1) genet blev identificeret som promotor-regionen, som giver mulighed for en ny methanol-frie og alsidige udtryk strategi i P. pastoris. CAT1 gen er den eneste katalase gen af P. pastoris og protein er beliggende i peroxisomerne. Katalase spiller en vigtig rolle i afgiftning af reaktive ilt arter, som opstår, fx., fra methanol oxidation i peroxisomal MUT pathway eller under beta oxidation af fedtsyrer6,7. Udtryk af CAT1 -genet er undertrykt i nærvær af glucose eller glycerol på mellemlang og dyrkning og derepressed ved nedbrydningen af disse carbon kilder8. Desuden kan udtryk for katalase gen induceres med methanol og remarkebly også med oliesyre, tilsyneladende er den eneste gene i P. pastoris MUT reaktionsvej, som kan være fremkaldt med oliesyre selv at nå lignende udtryk niveauer som med methanol induktion9.
500 bp fragmentet af denne P. pastoris CAT1 promotor, som kaldes PDC (undertiden også forkortede PCAT1-500), er allerede blevet testet for produktionen af intracellulært udtrykt og udskilles proteiner og det viste sig for at være en attraktivt alternativ til de klassiske to P. pastoris initiativtagere – stærk konstitutiv Pedersenhul og methanol inducerbar PAOX1, som blev udviklet for mere end 20 år siden. PDC var i stand til at nå 21% (CalB) og 35% (HRP) af de volumetriske aktiviteter i forhold til Pedersenhul i sukker rig medium. Methanol induktion, PDC kun reagerer ikke hurtigere end PAOX1, men kunne også tydeligt udkonkurrerer det med en 2,8 fold højere endelige titer af CalB9.
Udover PDC, var blevet identificeret en orthologous promoter (PDF) udviser en lignende forordning profil. Det er imidlertid væsentligt stærkere end PDC under derepressed som under methanol-induceret betingelser (håndskriftet under forberedelse)3.
I tilfælde hvor stærk konstitutiv Pedersenhul mislykkedes på grund af fysiologisk problematisk eller cytotoksiske proteiner10,11, repræsenterer PDC og PDF et ideelt alternativ. I micro skala eksperimenter, udtrykket drevet af disse initiativtagere starter efter nedbrydningen af den oprindelige carbon kilde (fx., glucose eller glycerol), som letter biomasseproduktionen uden at belaste celler med overekspression af det rekombinante protein lige fra begyndelsen. Mens begge af disse initiativtagere er stadig inducerbar af methanol, aktivering af derepression gør ekstra brugen af den preinduction fase i forhold til udtryk beskæftiger PAOX1. Desuden, PDC og PDF kan bruges til methanol-fri protein produktion, som er et ønskværdigt mål for store industrielle processer12.
For udviklingen af gældende produktionsstammer og udtryk konstruktioner skal flere trin i udviklingen være bestået for at indsnævre fra et stort antal transformants til den foretrukne kandidat for opskalering. Screeninger normalt udføres i høj overførselshastighed i multi godt plader (mikro skala: mindre end 0,5 mL) for at indfange en række kloner så stor som mulig. Efterfølgende re screening og re-re-screening er det næste skridt, efterfulgt af ryste kolben (lille skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreaktor screeninger12. Det er imidlertid ønskeligt at have en metode, der er mest ens mellem de forskellige skalaer fra hundredvis af μl i dyb-godt plader op til flere milliliter i ryste kolber op til senere opskalering af methanol-fri produktion i velkontrollerede bioreaktorer. Selvom ryste kolber kan give allerede lignende mængder som små bioreaktorer, findes der flere begrænsninger, som er yderst relevante for storstilet protein produktion som konstant fodring, beluftning og online-overvågning13 af vækst og iltforsyning. Optisk kontrol beskæftiger tilpasset ryste kolber og ryster enheder giver en omkostningseffektiv alternativ til mere avanceret udstyr til parallel dyrkning mens det stadig giver konstant online oplysninger om større kultur parametre såsom biomasse og koncentration af opløst ilt. Langsom frigivelse af CO2 kilde fra polymer luftfartsselskaber kan anvendes for at sikre en konstant og kontrolleret feed uden at påberåbe komplekse tekniske løsninger og udstyr, simulerer flere lignende forhold af bioreaktorer end de tidligere anvendte simpel fuld nedbrydning af kulstof kilde9,10, begrænsende hvor energi for igangværende protein udtryk bliver.
Følgende metode beskriver en lille til mellemstor skala methanol-fri styrbar protein udtryk system i P. pastoris baseret på de nye promotorer PDC og PDF. Induktion af derepression omfatter to faser. En første korte fase af biomasse ophobning uden produktion af protein af interesse, ved hjælp af en carbon kilde, der undertrykker initiativtagerne og en anden fase af target protein produktion, hvor en carbon kilde leveres i lille men konstant koncentrationer opretholdelse af selskabet derepressed. Online overvågning af mest kritiske dyrkning parametre anvendes hele dyrkning i perioden. Målet var at give en methanol gratis, pålidelige og skalerbare dyrkning system for P. pastoris.
Denne metode giver en pålidelig protokol for effektiv methanol uafhængige inducerbar udtryk af P. pastoris som et alternativ til klassiske methanol induceret protein udtryk drevet af PAOX112. De repressible initiativtagere, som PDC, PDF eller tidligere beskrevet muterede PAOX1 varianter17, bygge det molekylære grundlag for denne nye protein produktionskoncept. Vist repræsentative resultaterne understreger nytten og gennemførligheden af rekombinante protein udtryk i P. pastoris af de undertrykte initiativtagere og små screening med enkle online overvågning. På den ene side kan de skadelige og giftige methanol, der normalt anvendes til induktion AOX1 -promotoren fjernes fra dyrkning. På den anden side vækst og protein produktionsfase er frakoblet9 i modsætning til konstituerende protein udtryk, fx., med den almindeligt anvendte Phul. Dette er især gavnligt, når cellerne bør udtrykke toksiske eller skadelige proteiner, der viser en byrde for dem.
Mulighed for at starte udlæg til planteavl med forskellige kulstof kilde koncentrationer giver mulighed for afgørelse af, hvor meget biomasse, man gerne vil vinde før protein produktionsfasen starter. Når du vælger en lavere kulstof kilde koncentration i partiet, kan ilt overførsel begrænsninger på grund af for høj celle tætheder reduceres, mens til gengæld højere celle tætheder kan også resultere i højere protein titers. Ved at overvåge kultur udvikling i form af biomasse generation og ilt koncentrationer, kan det optimale tidspunkt for fed-batch indledningen bestemmes let som det er vist i figur 1.
Online overvågning af disse parametre, dyrkning, bør en passende målesystem anvendes. Biomassen måleapparat (fxSFR Vario) er en simpel og økonomisk online målesystem til overvågning af kultur ryste kolber. Optoelektroniske læser bestemmer cellevækst i kolben via spredte lys påvisning og læser signal af lambda-sonden integreret i kolben. Optikken for biomasse måling består af en LED, der udsender et lyssignal, som er spredt af partikler (celler) i kultur bouillon og registreret med en fotodiode. De optiske sensorer udsender fluorescens når ophidset med lys af en bestemt bølgelængde. Afhængigt af mængden af analysand molekyler nuværende ændres fluorescens signalet, som er opdaget af læseren optik og oversat til koncentrationsværdier. Imidlertid har en celle tæthed måling kalibrering skal fastsættes på forhånd, da målesystemet ikke er måle faktiske OD600 værdier. Ilt optagelse sats kan beregnes ud fra hældningen af ilt kurve med skærmlæser-software, og temperatur samt rpm registreres løbende sammen med de andre parametre. Hvis du vil aktivere overvågning med dette system, har ryste kolberne tidligere udstyret med passende sensorer for de ønskede parametre.
Ved tilsætning af fire langsom frigivelse polymer diske at levere en konstant mængde af glycerol til kultur bouillon, biomasse ophobning er næsten stoppet og rekombinante protein produktion er fortsat. Bestemmelse af foder disc tilføjelse tidspunkt er ikke et kritisk skridt i dette eksperiment, men det bør overvejes, at en tidlig feed start før den eksponentielle vækstfase kunne hæmme aktiveringen af initiativtageren, som udtrykket starter ved Carbon kilde udtynding. Derudover kan alt fodringstid på grund af polymer kapacitetsbegrænsninger reduceres, mens at udsætte feed efter cellerne har nået den stationære fase kan føre til sultende og forringelse af allerede produceret protein. Mængden af foder-diske bruges i denne protokol var bestemmes eksperimentelt for optimal carbon source frigivelse til at holde selskabet de undertrykt mens du holder biomasse generation lav (data ikke vist). På denne måde, at udlæg til planteavl kan udføres nemt over 160-180 h uden indgriben.
Vigtigste ansøgninger af denne nye protokol bliver udtryk klon screening, enzym evolution og opdagelsen, karakterisering og engineering af nye promotorer beskæftiger en methanol-fri dyrkning protokol i godt overvåget betingelser. I princippet bør samme protokol gælde for blandet foder strategier ansættelse af methanol og begrænset Fermentativ carbon kilde feeds som beskrevet af Panula-Perälä mfl. i 201418.
The authors have nothing to disclose.
ROBOX har modtaget støtte fra den Europæiske Union (EU) projekt ROBOX (grant aftale n ° 635734) under EUs Horisont 2020-programmet forskning og Innovation handlinger H2020-LEIT BIO-2014-1. De synspunkter og udtalelser heri er kun dem, for hvem der har udarbejdet, og nødvendigvis afspejler ikke de af EU ‘s forskningsagentur. Den Europæiske Union er ikke ansvarlig for enhver anvendelse, der kan være lavet af oplysningerne heri.
Ph.d.-afhandling af J. Fischer er samfinansieret af et tilskud til “Industrienahe afhandling” af det østrigske finansiering agenturet FFG.
Vi takker Gernot John (PreSens GmbH) for nyttige diskussioner og værdifulde input til udkastet til manuskriptet.
Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |