Udviklingen af interferon-gamma ELISpot assay for marsvin PBMC tillader karakterisering af T-celle svar i denne meget relevante model til at studere infektionssygdomme. Vi har anvendt analyse til måling af T celle svar tilknyttet intradermal levering af DNA-vacciner.
Marsvin har spillet en central rolle som relevante små dyr model for udviklingen af vacciner mod infektionssygdomme som tuberkulose, influenza, difteri og viral hæmoragisk feber. Vi har demonstreret, at plasmid-DNA (pDNA) vaccine levering ind i huden fremkalder robust humorale respons i marsvin. Brugen af dette dyr til model immunrespons var dog noget begrænset i fortiden på grund af manglen på tilgængelige reagenser og protokoller til at studere T-celle svar. T celler spiller en central rolle i både immunoprophylactic og immunterapeutisk mekanismer. Forståelse af T celle svar er afgørende for udviklingen af smitsomme sygdomme og onkologi vacciner og imødekommende levering enheder. Her beskriver vi en interferon-gamma (IFN-γ) enzym-forbundet immunospot (ELISpot) analyse for marsvin perifert blod mononukleære celler (PBMC). Analysen gør det muligt for forskere at karakterisere vaccine-specifikke T-celle respons i denne vigtige gnaver model. Evnen til at assay celler isoleret fra de perifere blod giver mulighed for at spore immunogenicitet hos det enkelte dyr.
Protokollen beskrevet her tillader påvisning af interferon-gamma (IFN-γ) hemmelig celler efter antigen tilbagekaldelse i perifert blod mononukleære celler (PBMC) indbyggere høstet fra Hartley marsvin. Vi har anvendt assay for at karakterisere kinetik og omfanget af antigen-specifikke T-celle svar til en Influenza vaccination-regime i guinea gris. Vi mener, at denne protokol vil betydeligt fremdrive præklinisk udvikling af vaccination programmer i denne meget relevante dyremodel.
T celler fremkaldes ved vacciner spiller en væsentlig rolle i beskyttelse mod smitstoffer og immunterapeutisk veje forbundet med andre sygdomme. Betydningen af T-celler er blevet fremhævet i flere vaccine undersøgelser. Vaccination af fritter og mus med en plasmid DNA (pDNA) kodning for H5 hemagglutinin og N1 neuraminidase forudsat beskyttelse fra sygelighed og dødelighed i en influenza virus udfordring i mangel af neutraliserende antistoffer, der angiver betydningen af T-celle immunitet1. Ud over stærke neutralisere humorale respons, T-celler spiller en afgørende rolle for ikke kun viral clearance2 , men også beskyttelse mod infektion med respiratorisk syncytialvirus (RSV) i mus3. Hos mennesker var præ-eksisterende CD8 + T celler forbundet med nedsat sygdommens sværhedsgrad i løbet af H1N1-pandemien i 20094. CD4 + T celle tæller sammen med visse cytokin plasmakoncentration er korreleret med sygdommens sværhedsgrad i RSV-smittede børn5.
Marsvin har fået fremtrædende plads som en laboratoriemodel for forskning og udvikling i forskellige områder af medicin såsom sensibilisering af huden, ernæringsmæssige forskning, undersøgelser af det auditive system og mest relevante for dette arbejde, infektionssygdomme. Det var afgørende for opdagelsen af vacciner mod tuberkulose og difteri. For nylig bruges marsvin som model for Influenza6 og Ebola7. Derudover tilbyder besidder fysiologiske ligheder med menneskers hud8, marsvin en tilgængelig lille dyremodel for dermal drug leveringsmetoder. I modsætning til dens betydning som en laboratoriemodel forbliver tilgængeligheden af marsvin specifikke assays og sonder at karakterisere immunrespons begrænset9. Grundlæggende cellulære assays såsom den IFN-γ enzym-forbundet immunospot (ELISpot-assay) som bruges rutinemæssigt i prækliniske og kliniske forskning til at optælle T-celle svar har ikke været tilgængelige.
De første fast-fase enzym-forbundet immunospot assays blev anvendt til at bestemme antallet af specifikke antistof-secernerende celler i en forskelligartet B celle-befolkningen10,11. Formatet har avanceret for at finde celler udskiller cytokiner, herunder IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, granzyme B og IFN-γ. ELISpot analysen besidder høj følsomhed; potentielt kan hvert cytokin-producerende celle påvises. Påvisningsgrænsen for ELISpot assays er blevet rapporteret at være lavere end 10 steder pr. 100.000 PBMC12. For nylig et marsvin IFN-γ specifikt antistof par blev gjort tilgængelige13, og det har åbnet op for muligheden for at afhjælpe denne mangel i feltet.
IFN-γ er betragtes som en vigtig effektor molekyle i den adaptive immunrespons; Det kan fremstilles og udskilles af både CD4 og CD8 T celler ved aktivering. IFN-γ har en bred vifte af biologiske funktioner i forbindelse med en immunrespons på en virusinfektion, såsom aktiveringen af makrofager og forordningen op af større histocompatibility komplekse (MHC) jeg og MHCII udtryk. Det skal også fremmer B-celle differentiering, hæmmer T-hjælper-2 cellevækst og aktiverer naturlige dræberceller. IFN-γ blokerer viral replikation i inficerede somatiske celler og upregulates udtryk af MHC molekyler. Produktion af IFN-γ er således en meget vigtig indikation af kvaliteten af T-celle respons til en vaccine eller patogen.
Et vigtigt aspekt af den her præsenteres IFN-γ ELISpot er brugen af PBMC snarere end splenocytes13. PBMC kan opnås ved behandling af en ikke-terminal indsamlede blodprøve, indsamling af splenocytes kraever animalske euthanization før høsten af milten. Brugen af PBMC muliggør IFN-γ T-celle svar overvåges over en periode og evaluering af virkningerne for T-celle svar som prime-boost regimer14.
For forskere, der i øjeblikket bruger marsvin som en dyremodel, vil metoden IFN-γ ELISpot udvide viften af videnskabelige data, de kan få. Dens tilgængelighed kan nu reducere behovet for at gennemføre undersøgelser med mindre relevante dyremodeller for target sygdommen, som tidligere blev valgt på grund af reagens tilgængelighed for undersøgelse af cellulære svar. Brugen af PBMC snarere end milt eller lymfeknuder giver mulighed for ikke-terminal eksperimenter og løbende overvågning af enkelte dyr.
Nedenfor giver vi en detaljeret beskrivelse af de trin i påvisning af en IFN-γ cellulære respons i marsvin til pDNA vaccine. Vi skitsere vores særlige levering procedure og beskrive den generelle ELISpot assay omfatter udtagning af blodprøve, blod behandling, PBMC høst, ANALYSEPROCEDURE, og dataanalyse. En skematisk af ELISpot assay er afbildet i figur 1.
Figur 1 : Skematisk oversigt over marsvin ELISpot protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Marsvin er en værdifuld dyremodel for præklinisk udvikling af vacciner og intradermal levering strategier. Den ovennævnte protokol beskriver metoden til at måle antigen-specifikke T-celle respons i denne yderst relevant model. Analysen giver et klart optælling af perifert T-celler producerer Interferon-gamma efter stimulation med antigen-specifikke peptider. Kinetik af immunresponset kan blive overvåget af ikke-terminal blod prøveudtagning.
Vi optimeret protokollen og identificeret kritiske aspekter for at opnå optimale resultater ved hjælp af denne analyse. For eksempel, vil dannelsen af blodpropper i collection tube resultere i suboptimal PBMC opsving og levedygtighed. Marsvin blodpropper meget hurtigt18. Det er afgørende at udføre blod tegne hurtigt. AU-Birck et al. giver en omfattende guide til blødning teknikker i guinea-svin model16. Da samlingen blod kræver generel anæstesi, anbefales det at gennemgå relevante standardforskrifter, som dette aspekt af proceduren19. Utilstrækkeligt bedøvet marsvin vil reagere ved at flytte deres ben eller vocalization efter en kort knivspids af vævet mellem deres tæer med dine negle eller ved at blinke deres ører og flytte deres knurhår frem efter klemme deres øre. Øjeblikkelig overførsel af blod ind i et rør med antikoagulans og bland grundigt ved rullende eller invertere røret flere gange er et vigtigt skridt i denne protokol. Den her beskrevne protokol EDTA-rør blev brugt, og ingen andre antikoagulanter blev testet. Bemærk venligst at EDTA er hypertonisk, rør bør ideelt set være fyldt mere end halvt fuldt, og derfor passende rør størrelse sample volumen skal bruges.
Når udført korrekt, resulterer tæthed gradient centrifugering konsekvent i ren PBMC forberedelse. Densitet-gradient medium skal ved stuetemperatur, når lagdeling gradient inden centrifugering, og bremser bør ikke anvendes for at stoppe centrifugen, når ved hjælp af regelmæssig rør. En betydelig forbedring med hensyn til praktiske PBMC-behandling var kombinationen af tæthed gradient centrifugering med PBMC-isolation enheder. Dette giver mulighed for en nedsættelse af centrifugeringstiden. Tæthed gradient centrifugering i PBMC-isolation enheder og regelmæssig rør resultater i lignende levedygtighed, levende celle tæller forarbejdede PBMC og spot dannelse. Uafhængig af typen af røret bruges til adskillelse, buffy coat høsten skal følge umiddelbart. Over en længere periode er kontakt med tæthed gradient medium cytotoksiske til PBMC.
Præcis optælling af levedygtige PBMC er vigtigt at frø konsekvent lig antallet af celler i assay-plade brønde. Nogle metode til live/døde forskelsbehandling bør anvendes. I vores laboratorium bruger vi trypan-blå udstødelse analysen og en automatiseret celle-counter.
Spot kvalitet, defineret som skarp og høj kontrast steder, vil resultere i forbedret nøjagtighed og konsekvent spot optælling, især når du bruger et automatisk tælle system. I overensstemmelse med producentens anbefalinger observeret vi ethanol pre behandlinger af ELISpot pladerne til at være et afgørende skridt til at reducere antallet af baggrunden steder og forbedre definitionen af steder. Brug af en Pladelæser til billede ELISpot assay-plader i slutningen af protokollen er stærkt anbefales. Originale billeder af hver brønd kan nemt og effektivt fremstillet og opbevaret. Bruger et billede analyse software digitale billeder også muliggøre objektive analyse og spot tælle i forhold til manuel optælling af individuelle operatører.
En absolut nødvendighed for udviklingen af analysen beskrives her var generation af en egnet anti-marsvin Interferon-gamma antistof par. Musen monoklonale antistoffer V-E4 og N-G3 blev udviklet af hybridom-teknik med B-celle kloner fra mus, som blev immuniseret med rekombinant marsvin interferon gamma20. V-E4, som er IgG1 isotype, og N-G3, som er IgG2a, er rapporteret at binde begge at det rekombinante og indfødte antigen. Tildele V-E4 som fange antistof og biotinylated N-G3 som detektor-antistofs resulterede i høj følsomhed for både rekombinant og indfødte protein samtidig bevare lave baggrunden signal i en sandwich-ELISA format. Begge antistoffer er tilgængelige til det videnskabelige samfund gennem en produktion aftale ledet af laboratoriet for Dr. Hubert Schaefer, der er medforfatter af denne publikation. Anmodninger modtaget af Dr. Schaefer’s lab og derefter fremstillet af en kommerciel partner.
Interferon-gamma er rapporteret at være ustabil i regelmæssig buffere eller media21. Schaefer et al.20 rapporteres kun en moderat fald i genfindingsprocenten når ved hjælp af forringet IFN-y, som havde mistet biologiske funktionalitet i en ELISA format ved hjælp af antistoffer V-E4 og N-G3. Dog bør stigende inkubationstiden peptid stimulation af PBMC over 18 h være omhyggeligt afprøvet.
Fordelene ved at bruge PBMC er blevet drøftet. Den her beskrevne analyse afspejler imidlertid kun antigen-specifikke svar af cirkulerende T-celler i periferien. Væv-infiltrerer T-celler eller celler isoleret fra lymfatiske organer som milt og lymfeknuder, kan udvise forskellige egenskaber22,23,24. Ingen væsentlige forskelle i cellulære Reaktionerne blev observeret ved sammenligning af interferon-gamma steder fra PBMC og splenocytes fra forsøgskaniner, som blev immuniseret med den samme pNP influenza vaccine14.
I denne protokol beskrev vi en intradermal vaccination procedure. En vigtigste rationale for ID immunisering er rettet mod den høje tæthed af dendritiske celler i huden25. Vi og andre har vist, at disse celler kan målrettes specifikt ved at tilpasse leveringsmetode26, formulering27eller narkotika-design28. Aktiveret professionel antigen-præsenterer celler kan overføre til en dræning lymfeknude og aktivere adaptive immunsystem29,30,31,32. Dendritiske celler er essentielle antigen præsentation celle-type til priming produktive cellulære immunrespons.
Denne undersøgelse dyr blev immuniseret med plasmid DNA kodning nucleoprotein af H1N1-influenza stamme A/PuertoRico/8. Huden levering af dette pDNA vaccine (pNP) i kombination med elektroporation havde vist sig at fremkalde antigen-specifikke humorale respons i marsvin33, fritter og ikke-menneskelige primater (primaterne)1,34. Derudover denne vaccine fremkaldte robust T-celle respons i mus efter levering i epidermis35, som kunne henføres til CD4 og CD8 T-celler ved at stimulere med peptider der repræsenterer specifikke epitoper for disse cellepopulationer. PNP vaccinen, var også immunogen efter slimhinde levering som det fremgår af generation af humorale respons i kaniner og marsvin samt cellulære og humorale respons i mus36. Senest har var vores gruppe stand til at påvise generation af IFN-γT-celle respons i kanin efter intramuskulaer levering (ikke-offentliggjorte data).
I øjeblikket, kan ikke de observerede Interferon-gamma steder i marsvin ELISpot tildeles til en CD4 + eller CD8 + T-celle delmængde. Især for design og udvikling af immun behandlingsformer rettet mod huden, ville det være meget nyttigt at afgøre hvorvidt observerede interferon-gamma enkeltfrekvenser er forårsaget af udvidelse af et særligt undersæt eller en afbalanceret reaktion af både for at evaluere effektiviteten af vaccination til at udløse cross-præsentation. Denne begrænsning kan overvindes ved negativ celle-sortering for CD4 og CD8 før såning celler på pladen eller ved identifikation af MHC klasse II (til CD4 svar) eller MHC klasse I (til CD8 svar) begrænset epitoper.
Her beskrives Interferon-gamma ELISpot analysen ved hjælp af marsvin PBMC omhandler behovet for at vurdere forløbet af cellulære svar i guinea gris laboratoriemodel. Dette vil forfine udvikling af vacciner og hud levering protokoller. Vi mener, at det giver mulighed for ansættelse af denne relevante dyremodel til at studere sygdomme med vigtige T-celle elementer såsom TB37, Ebola38, HSV39m.fl. Det vil reducere brugen af mindre relevante dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af Inovio Pharmaceuticals R & D afdeling for teknisk bistand og ansatte i Acculab for at levere topkvalitet dyrehold service. Vi vil navnlig gerne takke Alysha Vu og Joe Agnes til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde blev ikke finansieret af nogen særlige tilskud fra finansielle organer i de offentlige, kommercielle eller ikke-for-profit sektorer.
Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
22µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22µm Filter |
KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |