Summary
הפיתוח של אינטרפרון-גמא ELISpot וזמינותו של שפן PBMCs מאפשרת אפיון T-cell תגובות במודל זה מאוד רלוונטי ללימוד מחלות זיהומיות. לנו יש להחיל וזמינותו כדי למדוד את תא T תגובות המשויכות intradermal משלוח של חיסונים DNA.
Abstract
שפן שיחק תפקיד מכריע כמו במודל חיה קטנה רלוונטי בפיתוח של חיסונים למחלות זיהומיות כגון שחפת, שפעת, דיפתריה hemorrhagic חום ויראלי. הראו כי פלסמיד-DNA (pDNA) משלוח חיסון לתוך העור מעורר תגובות ההורמונאלית חזקים החזיר גיניאה. עם זאת, השימוש של חיה זו מודל החיסון תגובות היה קצת מוגבל בעבר בשל חוסר ריאגנטים זמין ופרוטוקולים ללמוד תא T תגובות. תאי T לשחק תפקיד מרכזי הן immunoprophylactic והן מנגנונים immunotherapeutic. הבנת התגובות תא T חיוני להתפתחות של מחלה זיהומית, אונקולוגיה חיסונים והתקנים משלוח שמברי. כאן נתאר assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISpot) של אינטרפרון-גמא (IFN-γ) עבור שפן תאי תאי דם היקפיים (PBMCs). וזמינותו מאפשר לחוקרים לאפיין תגובות חיסון ספציפיים T-cell במודל זה מכרסם חשוב. היכולת assay תאים מבודדים מהדם ההיקפי מספק הזדמנות לעקוב immunogenicity בבעלי חיים בודדים.
Introduction
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת הגילוי של אינטרפרון-גמא (IFN-γ) תאים מפרישים לאחר החזרה אנטיגן באוכלוסיה תאי תא (PBMC) דם היקפיים שנקטפו הארטלי שרקנים. לנו יש להחיל וזמינותו לאפיין קינטיקה של מגניטודות של תא T אנטיגן ספציפי התגובות שפעת החיסונים-משטר החזיר גיניאה. אנו מאמינים שפרוטוקול זה משמעותי להניע פיתוח חיסונים תוכניות במודל בעלי חיים מאוד רלוונטי זה קליניים.
תאי T שהפיק חיסונים לשחק תפקיד חיוני להגנה מפני מדבקים מסלולים immunotherapeutic הקשורים עם מחלות אחרות. כבר הדגישה את החשיבות של תאי T במחקרים חיסון מרובים. חיסונים של חמוסים ועכברים עם ה-DNA פלסמיד (pDNA) הקידוד עבור H5 hemagglutinin ו N1 neuraminidase סיפק הגנה מפני התחלואה והתמותה ב אתגר וירוס שפעת בהיעדרו של נטרול נוגדנים, המציין את חשיבות תא t חסינות1. בנוסף חזק נטרול תגובה הומוראלית, תאי-T לשחק תפקיד מכריע עבור לא רק סיווג ויראלי2 , אלא גם הגנה מפני הידבקות בווירוס syncytial הנשימה (RSV) עכברים3. בבני אדם, קיימים תאי CD8 + T היו המשויכים חומרת המחלה ירד במהלך H1N1 מגיפת 20094. ספירת CD4 + T יחד עם ריכוז הפלסמה ציטוקין מסוימים נמצאים בקורלציה עם חומרת מחלת הילדים הנגועים RSV5.
שפן צברה לגדולה כמודל מעבדה למחקר ופיתוח בתחומים שונים של הרפואה כגון רגישות העור עולה, מחקר תזונתי, מחקרים של מערכת השמיעה, הרלוונטיים ביותר לעבודה זו, מחלות זיהומיות. זה היה תפקיד חשוב בזכות הגילוי של חיסונים נגד שחפת ו דיפתריה. לאחרונה שפן משמשת כמודל עבור שפעת6 ו אבולה7. יתר על כן, בעלי דמיון פיזיולוגי העור האנושי8, שפן מציע מודל חיה קטנה נגיש עבור שיטות משלוח סמים עורי. בניגוד החשיבות שלו בשם מודל במעבדה, הזמינות של מבחני ספציפי שפן וזונדים לאפיין תגובות חיסוניות נותר מוגבל9. מבחני הסלולר בסיסיים כגון IFN-γ מקושרים-אנזים immunospot (ELISpot-assay) המשמש באופן שגרתי במחקר וקליני, למנות תא T תגובות שלא היו זמינים.
מבחני מוצק-פאזי מקושרים-אנזים immunospot הראשון שימשו כדי לקבוע את מספר התאים מפריש נוגדן ספציפי תא B-אוכלוסיה10,11. התבנית כולל מתקדמת כדי לזהות תאים הפרשת ציטוקינים כולל IL-1, il-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-אלפא, TNF-ביתא, granzyme B ו- IFN-γ. הבדיקה ELISpot היא בעלת רגישות גבוהה; פוטנציאל ניתן להבחין בכל תא ייצור ציטוקינים. המגבלה של זיהוי עבור מבחני ELISpot דווחה יהיה נמוך יותר מאשר 10 נקודות לכל 100,000 PBMCs12. לאחרונה בוצע זוג נוגדן ספציפי של IFN-γ שפן הזמין13, זה פתח את ההזדמנות כדי לטפל מחסור בשטח.
IFN-γ נחשב של מולקולה אפקטור חשוב בתגובה חיסונית אדפטיבית; זה יכול להיות המיוצר, מופרש על ידי תאי CD4 ו- CD8 T בעת הפעלת. IFN-γ יש רחב טווח ביולוגית מתפקד בהקשר של תגובה חיסונית לזיהום וירוס, כגון את ההפעלה של מקרופאגים, והסדרת מורכבים הגדולות histocompatibility למעלה (MHC) אני MHCII הביטוי. היא גם מקדמת התמיינות תאי B, מעכב צמיחת תאים T-helper-2, ומפעילה תאים רוצח טבעי. IFN-γ חוסם שכפול ויראלי תאים סומטיים נגועים, upregulates הביטוי של מולקולות MHC. לפיכך, הייצור של IFN-γ היא אינדיקציה חשובה מאוד של איכות התגובה תא T החיסון או הפתוגן.
היבט חשוב של ELISpot IFN-γ שהוצגו כאן הוא השימוש של PBMCs במקום splenocytes13. PBMCs ניתן להשיג על-ידי עיבוד דגימת דם שנאספו ללא-מסוף, ואילו האוסף של splenocytes דורש euthanization בעלי חיים לפני הקציר של הטחול. השימוש PBMCs מאפשר תגובות IFN-γ T-cell שיפקחו על פני תקופה של זמן והערכת ההשפעות על התגובות T-cell כגון ראש הממשלה-דחיפה משטרי14.
לחוקרים מי אתה משתמש כעת שפן כמו במודל חיה, השיטה IFN-γ ELISpot ירחיב את מגוון נתונים מדעיים שהם יכולים להשיג. זמינותו עכשיו עשוי להפחית את הצורך לבצע מחקרים עם דגמים בעלי חיים פחות רלוונטי עבור המחלה היעד, אשר נבחרו בעבר עקב ריאגנט הזמינות עבור בחינת התגובות הסלולר. השימוש PBMCs ולא הטחול או בלוטות לימפה מאפשר ניסויים בלתי-מסוף, ניטור רציף של חיות בודדות.
להלן אנו מספקים תיאור מפורט של הצעדים הכרוכים הגילוי של IFN-γ הסלולר מענה שרקנים חיסון pDNA. אנחנו המתאר את נוהל משלוח שלנו. ומתארות וזמינותו ELISpot הכללי המקיף דגימה דם דם עיבוד, PBMC הקציר, הליך assay, ניתוח נתונים. תיאור סכמטי של וזמינותו ELISpot מתואר באיור1.
איור 1 : סקירה סכמטי של שפן פרוטוקול ELISpot. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של Acculab.
הערה: הפרוטוקול מחייב את השימוש בחומרים מסוכנים פוטנציאליים. אנא עיין MSDS של היצרן, ללבוש ציוד אישי מתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) לאורך כל ההליך.
1. הכנת האתר התחסנות שפן, מנטו-הזרקת intradermal ו CELLECTRA-P 3-EP-הליך
-
הכנת אתר טיפול בשפן.
- למקם את השרקן בתא אינדוקציה, להרדים ב-5% אדי-איזופלוריין.
- להסיר את החיה מן החדר, למקם את האף חרוט במיקום, מתן 2% אדי איזופלוריין לשמור על הרדמה לאורך כל ההליך.
- לגלח שטח של 4 ס מ2 באיגוף בטן.
- חיטוי אזור מגולח עם אתנול-ספוגית.
-
הזרקה של pDNA-ניסוח ואלקטרופורציה בהליך.
- השתמש של אינסולין-מזרק להזריק 100 ניסוח µl לתוך הדרמיס בטכניקת מנטו. המחט מוחדרת מסגרת משופעת למעלה בזווית של 10 מעלות עם גוף החיה.
- הסר את המחט, מיד להוסיף את האלקטרודות CELLECTRA® - 3 P מעבר ההזרקה-ויל ולהחיל בשדה חשמלי.
- להסיר את החיה מן ההרדמה ונטר ההתאוששות שלה.
2. ללא-מסוף לדמם
-
דם אוסף של עורק הצוואר מרדימים שפן.
- למקם את השרקן בתא אינדוקציה, להרדים חיה כפי שמתואר 1.1.1
- באמצעות מזרק 3 מ עם מחט 27G 1/2 אינץ ', תנקד ומוחלף על החיה anaesthetized ולאסוף 3 מ"ל של דם.
- מיד להעביר דם לתוך K2EDTA דם אוסף שפופרת, להפוך את צינור מספר פעמים כדי לערבב את הדם עם אנטי מקריש והמקום על קרח.
הערה: הימנעות של קרישת הדם חיונית עיבוד מוצלח במורד הזרם של דגימת דם. - לפקח על השחזור של בעל החיים.
3. עיבוד דגימת דם
-
הפרדת PBMCs כל הדם על ידי צנטריפוגה צפיפות-צבע
- לדלל דם 1:1 מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק).
הערה: כדי למנוע זיהום כל לעבוד מעכשיו צריכה להתבצע ב- cabinet אבטחה יישום הטכניקה aseptic. - שכבה בדילול דם בהדרגה מעל 4.5 מ ל Ficoll-Paque בתוספת בשפופרת 15 מ"ל-חרוט. למנוע הפרעה של הממשק. הערה: כדי להבטיח הפרדה נאותה, Ficoll-Paque להיות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה צינורות-800 rcf למשך 30 דקות עם בלם את.
הערה: כפי חלופית, צינורות SepMate™ (STEMCELL טכנולוגיות) יכול לשמש PBMC-הפרדה. HBSS-בדילול דם מתווסף 15 מ"ל SepMate צינור מלא עם 3.5 מ ל Ficoll-Paque Plus, ואז centrifuged ב 1200 rcf 10 דקות (בלם ב). טכניקה זו צנטריפוגה מעבר לחיסכון בזמן התוצאה שווה הכדאיות, תא-תשואה ספוט-היווצרות. - הקציר באפי-קואט שכבה ו לדלל R10 בינוני (10% (v/v) חום-מופעל FBS ו- 1% (v/v) עט/סטרפ RPMI1640 בינוני) את הנפח הכולל של 15 מ"ל.
- צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב 450 rcf במשך 5 דקות.
- רחץ תאים פעמיים עם R10 בינוני.
- להשעות מחדש תאים 1 מ"ל R10, להעביר תא-השעיה עד 70 מיקרומטר תא-מסננת בתוך צינור חדש.
- לספור תאים וקבע מספר תאים חיים על ידי צביעת Trypan-כחול.
- לדלל תאים R10 בינונית כדי ריכוז עונה 1 פרק 10 ^ 6 תאים חיים לכל ml.
- לדלל דם 1:1 מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק).
4. הכנת ELISpot-פלטות, תא-גירוי
-
וולס המעיל של רחוב של צלחת ELISpot PVDF-הממברנה 96-ובכן לפני זריעה של PBMCs.
- צלחות צריך להיות מראש שטופלו למשך 60 שניות. טיפול קדם אתנול תגרום לא פחות ספציפי ספוט-היווצרות ונקודות עם הגדרת משופר.
הערה: תשמרי תוספת כדי להבטיח הקרום שלם בא במגע עם 15 µl 35% אתנול. - לאחר 60 שניות הוסף 150 PBS 1 x µl לכל טוב ולאחר מכן לרוקן בארות על-ידי היפוך הלוחות.
הערה: הטיפול מראש אתנול רגיש מאוד בזמן. דגירה לא טוב-קרום יותר סעיף 60 ממברנות בטח לא יתייבש במהלך השלבים הבאים של ההליך. - לשטוף צלחות שלוש פעמים עם PBS 1 x µl 250 לכל טוב.
- מעיל עם µl 100/טוב של 5 µg/ml לכידת האנטי-שפן IFN-γ נוגדן V-E4 ב- PBS.
- דגירה עומדי לפחות 12 שעות ב 4 º C.
- לשטוף צלחות על-ידי הוספת µl 250/PBS טוב שלוש פעמים.
- להוסיף 200 µl/טוב חסימה מאגר (10% (w/v) סוכרוז ו- 2% (w/v) BSA ב- PBS), תקופת דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף צלחות עם µl 250/PBS טוב שלוש פעמים.
- צלחות צריך להיות מראש שטופלו למשך 60 שניות. טיפול קדם אתנול תגרום לא פחות ספציפי ספוט-היווצרות ונקודות עם הגדרת משופר.
-
PBMCs צלחת עם אנטיגן ספציפי פפטידים, פקדים חיוביים ושליליים.
- לדלל מאגר חלבון-פפטיד ב R10 כדי ריכוז פפטיד הסופי הרצוי.
- Assay את מדגם PBMCs ב triplicates.
הערה: להוסיף בינוני עם ממריצים הצלחות ELISpot קודם ולהוסיף את המתלים PBMC שנית. - להוסיף µl 50 בינוני פפטיד-R10 בארות המצוין.
- באמת להוסיף 50 µl פפטיד ריק ניסוח R10 לתוך בארות המצוין.
- עבור בקרת חיובי להוסיף 5 µg/ml Concanavalin A (ConA) במדיום R10 לתוך בארות המצוין.
- להוסיף 100 µl PBMC תא-השעיה כל בארות
- דגירה צלחות באווירה 5% CO2 humidified-37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.
הערה: המקום ELISpot צלחות על מתלה/משטח אפילו בחממה ולהימנע כל הפרעה של הצלחות בתקופת הדגירה.
5. איתור נקודות חיוביות אינטרפרון-גמא
-
הדגירה עם זיהוי נוגדנים ופיתוח צלחת.
הערה: עבור כל השלבים בסעיף זה הטכניקה aseptic לא נדרש.- הסר בזהירות את הצלחות מן החממה ולרוקן בבטחה בארות. לשטוף צלחות על-ידי הוספת µl 250/PBS טוב עבור שלוש פעמים.
- להוסיף 100 µl/טוב של 2 µg/ml biotinylated זיהוי שפן אנטי-IFN-γ נוגדן N-G3 מדולל במאגר חסימה.
הערה: מסנן (22 מיקרומטר) נוגדן פתרון כדי להפחית את הרקע. - דגירה עם זיהוי נוגדנים עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- להתעלם supernatant, תשטוף הצלחות על-ידי הוספת µl 250/PBS טוב שלוש פעמים.
- להוסיף 100 µl טוב של phosphatase אלקליין (ALP)-streptavidin מצומדת מדולל במאגר חסימה.
הערה: מסנן פתרון (22 מיקרומטר) כדי להפחית את הרקע. - תקופת דגירה עם המספר המשלים אלפ-Streptavidin של 1שעות בטמפרטורת החדר.
- למחוק פתרון אלפ-Streptavidin לשטוף צלחות על-ידי הוספת µl 250/PBS טוב פעמיים ואני להסיר PBS עודף על-ידי היפוך לצלחת, סופג את זה נגד במגבת נייר נקיה.
- לשטוף את הצלחות על-ידי הוספת מים DI הנדסה גנטית µl/טוב 250 פעם אחת, להסיר את המים העודפים על ידי היפוך לצלחת, סופג את זה נגד במגבת נייר נקיה.
- להוסיף 100 µl של BCIP/NBT (זהירות) המצע פתרון טוב לכל. התראה: BCIP/NBT הוא דליק מאוד, רעילים אם בלע, במגע עם העור, או בשאיפה. לפני השימוש יש לפנות MSDS.
- תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
- יש לשטוף את הצלחת 4 פעמים עם מים יונים. היפוך צלחת והקש כדי להסיר את המים העודפים.
- להסיר פלסטיק הניקוז התחתון של צלחות ELISpot ולאפשר את הצלחות להתייבש.
- לכמת כתמים באופן ידני או על ידי שימוש בקורא ELISpot אוטומטיות, לדוגמה לקורא צלחת S6 CTL-Immunospot.
Representative Results
התוצאות המובאות כאן לשמש כנקודת התייחסות התוצאות צפויות בעקבות השימוש בפרוטוקול זה, תוך שימת דגש על חשיבות מכרעת צעדים ולאשר את היתרונות של אופטימיזציות המתואר.
לאחר צנטריפוגה צפיפות-צבע, כפי שמתואר בשלב 3.1 של הפרוטוקול, הנוזל צמיגה אדום בתחתית של הצינור יכיל ביותר של כדוריות דם אדומות. כפי שמוצג באיור2A, מעל תאי הדם האדומים הוא שכבה של הצפיפות-המדיום. בין שכבה של פלזמה ברורה או צהוב על גבי הצפיפות בינונית הדרגתיות היא שכבה המעיל באפי חום בהיר או לבן, אשר מכיל את רוב תאי דם לבנים טסיות. ההפרדה לא שלמה יבוא לידי ביטוי כמו הנוכחות של תאי דם אדומים על המדיום צפיפות-צבע. צבע אדום של פלזמה איור 2א הוא ככל הנראה עקב המוליזה, כפי דגימת דם היה מאוחסן בצינור אוסף 1.5 h לפני ביצוע העיבוד. איור 2 B מראה מעבר הצבע לפני (משמאל) ואחרי (מימין) צנטריפוגה במכשיר PBMC-בידוד. דגימת דם איור 2ב' היה לעבד עם השהיה מזערית לאחר איסוף דם, פלסמה צבע צהוב.
השפעת מראש להרטיב את הקרומים עם אתנול (ראה שלב 4.1 לפרוטוקול) על המקום-פיתוח מוצג באיור3. כתמים בבארות שטופלו מראש להציג הגדרה שיפור, ויש ירידה במספר מקומות בבארות שליטה שלילי בינוני/דימתיל סולפוקסיד (איור 3א). הכדאיות טיפוסי של שפן מעובד PBMCs נע בסביבות 90% והיא דומה הן רגיל 15 מ"ל צינורות והתקנים PBMC-בידוד (איור 3ב). תשואה של התאים קיימא של דגימת דם 3 מ ל נע בדרך כלל בין 3 x 106 ו 5 x 106.
בעלי חיים היו חיסון עם פלסמיד DNA קידוד של נוקלאופרוטאין (NP) של זן שפעת H1N1 A/PuertoRico8. איור 4 מציגה ספירה של התגובות T-cell IFN-γ שהוצגו באותה נקודה להיוות יחידות (SFU) שנוצר על-פני משך משטר החיסונים. ELISpot assay עם PBMCs שנקטפו לא לחסן חיות תוצאות ספירת ספוט זניח (אין טי אקס). ארבעה עשר ימים לאחר החיסונים הראשונים (פריים), ממוצע של 970 כתמים IFN-γ לכל PBMCs מיליון נספרו לאחר גירוי immunogenic. שבעה ימים לאחר חיסון השני (דחיפה), T-cell תגובות נגד כל שלוש בריכות הורחבו, להגיע בממוצע 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMCs. 46 ימים לאחר חיסון השני (זיכרון), סך ממוצע של SFUs IFN-γ 6310/10... 6 PBMCs נספרו בדם ההיקפי.
איור אגדות:
איור 2 : להחליפן בתמונות של שכבות לאחר צנטריפוגה צפיפות-הדרגה. (א) דם לטעום לפני (משמאל) ואחרי (מימין) צנטריפוגה צינורות רגילים. (B) דם לטעום לפני (משמאל) ואחרי (מימין) צנטריפוגה במכשירים PBMC-בידוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אופטימיזציה של הפרוטוקול. (א) המראה האופייני של נקודות חיוביות IFN-γ צלחת assay ELISpot טוב פיתח לפי הפרוטוקול. דוגמה בארות triplicate מוצגים לאחר הטיפול מראש עם אתנול (מימין) או ללא טיפול קדם (משמאל). התאים היו הדגירה למשך הלילה עם דימתיל סולפוקסיד (למעלה) כפקד לא-גירוי, פפטידים מתאימים-אנטיגן (באמצע), או את mitogen ConA (למטה). PBMCs שמקורם באותו לחיה הבודדת. וולס היו עם תמונה באמצעות צלחת-סורק אוטומטית. השוואה (B) של צינורות צפיפות-צבע שונים על תאי מעובד. 3 מ"ל של דגימות דם מ 3 שרקנים בודדות נאספו. 1.5 מ של כל מדגם עובדו באמצעות צינורות רגילים (צפיפות צבע בינוני) או PBMC-בידוד התקנים. הכדאיות (שמאלה, % ± SEM) ומספר תאים חיים (נכון, x 106 ± SEM) היו נחושים באמצעות תא אוטומטית ספירה המערכת ואת וזמינותו הדרה trypan-כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : זיהוי של תגובות חיסוניות הסלולר חזקים במהלך משטר החיסונים. בימים 1 ו- 15, 30 µg של pDNA קידוד שפעת A נוקלאופרוטאין (NP) נמסרה intra-dermally אל בטן האגף של הארטלי שרקנים ומיד אחריו עור-אלקטרופורציה. IFN-γ ELISpot התגובה נמדדה 14 ימים לאחר את החיסונים הראשונים (פריים) ו 7 ימים (boost) ו 46 ימים (זיכרון) לאחר חיסון השני. רשע SFUs + SEM שורטטו שרקנים שטופלו 5 ו 2 לא מטופל שרקנים (אין טי אקס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
שפן הוא מודל בעלי חיים בעלי ערך להתפתחות ניסויים פרה-קליניים של חיסונים ואסטרטגיות intradermal משלוח. הפרוטוקול הנ ל מתאר את המתודולוגיה כדי למדוד את תא T אנטיגן ספציפי תגובות במודל זה מאוד רלוונטי. וזמינותו מספק ספירה ברורה של היקפי תאי-T לייצר אינטרפרון-גמא על גירוי עם פפטידים אנטיגן ספציפי. ניתן לנטר את קינטיקה של התגובה החיסונית על ידי לקיחת דמים הלא-מסוף.
אופטימיזציה הפרוטוקול ואנו לזהות היבטים קריטיים כדי להשיג תוצאות אופטימליות שימוש assay הזה. לדוגמה, היווצרות של קרישי דם בצינור אוסף תגרום שיוצרת שחזור PBMC ואת הכדאיות. שפן הדם ייקרש במהירות רבה18. זה חיוני לבצע את לקיחת הדם במהירות. Au-Birck et al. לספק מדריך מקיף דימום טכניקות ה הדגם שפן16. מאז האוסף דם דורש הרדמה כללית, מומלץ לסקור ישים נהלי של היבט זה של הליך19. דיו מרדימים שרקנים יגיב על-ידי הזזת הרגליים או ניקוד לאחר קמצוץ קצרה של הרקמה שלהם בין האצבעות שלהם. עם הציפורניים או על ידי מצמוץ אוזניהם ו הזזת שפם שלהם להעביר לאחר צובט את האוזן. העברה מיידית של הדם לתוך צינור עם נוגד קרישה, לערבב ביסודיות על ידי גלגול או היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים הוא צעד חיוני של פרוטוקול זה. עבור פרוטוקול המתואר כאן שימשו EDTA-צינורות, אין קרישה אחרים נבדקו. אנא שימו לב כי EDTA hypertonic, צינורות אידיאלי למילוי יותר מחצי מלא, ולכן גודל צינור המתאים עבור אמצעי האחסון מדגם צריך לשמש.
כאשר מבוצעת כהלכה, צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות בעקביות תוצאות כהכנה PBMC נקי. המדיום צפיפות-הדרגה חייב להיות בטמפרטורת החדר, כאשר שכבות המילוי ההדרגתי לפני צנטריפוגה, הבלמים לא צריכים לשמש שעצרת לצנטריפוגה בעת שימוש רגיל צינורות. שיפור משמעותי מבחינת המעשיות של PBMC-העיבוד היה השילוב של צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע עם התקנים PBMC-בידוד. דבר זה מאפשר ירידה בזמן צנטריפוגה. צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות במכשירים PBMC-בידוד ותוצאות צינורות רגילים הכדאיות דומה, תא חי סופרת PBMCs מעובד, היווצרות ספוט. עצמאית של הסוג של צינור המשמש לצורך הקמת מכשול ההפרדה, הקציר המעיל באפי צריכה פעל מיד. על פני תקופה ארוכה של זמן מגע עם המדיום הדרגתיות צפיפות היא ציטוטוקסיות כדי PBMCs.
ספירה מדויקת של PBMCs קיימא חשוב זרע מספר שווה באופן עקבי של תאים לתוך הבארות assay-צלחת. צריך להיות מיושם שיטה האפליה חי/מת. במעבדה שלנו, אנו משתמשים וזמינותו trypan-כחול הדרה של התא אוטומטית על השיש.
איכות ספוט, כהגדרתו עם קצוות חדים וגבוהים בניגוד כתמים, תגרום שיפור דיוק וממשיכים עקבי ספוט, במיוחד בעת שימוש במערכת ספירה אוטומטית. בהתאם להמלצות היצרן, הבחנו אתנול טיפולי קדם של הלוחות ELISpot להיות שלב חיוני כדי להפחית את מספר המקומות רקע ולשפר את ההגדרה של המקומות. השימוש של קורא צלחת כדי תמונה ELISpot assay-הצלחות בסוף הפרוטוקול מומלץ מאוד. התמונות המקוריות של כל טוב יכול להיות בקלות וביעילות שהושג, מאוחסנים. באמצעות תוכנה ניתוח תמונה תמונות דיגיטליות גם לאפשר ניתוח אובייקטיבי וספירת ספוט בהשוואה ספירה ידנית על ידי מפעילי בודדים.
הכרח מוחלט לפיתוח וזמינותו המתוארים כאן היה הדור של מתאימים אנטי-שפן זוג נוגדן אינטרפרון-גמא. נוגדנים חד-שבטיים העכבר V-E4 ו N-G3 פותחו על ידי ליפידים-טכניקה עם B-cell שיבוטים של עכברים אשר היו חיסון עם שפן רקומביננטי-אינטרפרון-גמא-20. V-E4, אשר IgG1 isotype, ו- N-G3, אשר IgG2a, מדווחים לאגד את שניהם אנטיגן רקומביננטי ומקוריות. הקצאת V-E4 וגם לכידת נוגדן biotinylated N-G3 כמו הנוגדן זיהוי הביא רגישות גבוהה של חלבון רקומביננטי וגם מקורית תוך שמירה על רקע נמוך אות בתבנית כריך-אליסה. שני נוגדנים זמינים עבור הקהילה המדעית באמצעות הסכם ייצור בראשות המעבדה של ד ר הובר שפר, מיהו מחבר שותף של פרסום זה. בקשות שהתקבלו על-ידי המעבדה של ד ר שפר ומיוצרים ואז על ידי שותף מסחרי.
אינטרפרון-גמא הוא דיווח לחוסר יציבות מאגרי או מדיה רגיל21. שפר et al.20 דיווחו רק ירידה מתונה של קצב ההתאוששות בעת שימוש השפיל IFN-y, אשר איבד את פונקציונליות ביולוגי, בתבנית אליסה באמצעות נוגדנים V-E4 ו- N-G3. עם זאת, הגדלת זמן הדגירה של פפטיד גירוי של PBMCs מעל 18 h צריך בזהירות להיבדק.
. דובר על יתרונות השימוש PBMCs. עם זאת, וזמינותו שתואר כאן רק משקף את תגובות אנטיגן ספציפי של מחזורי תאי-T בפריפריה. הסתננות רקמת תאי-T או תאים מבודד איברים הלימפה, כגון הטחול ובלוטות הלימפה, ייתכן שיישומים מאפיינים שונים22,23,24. אין הבדלים משמעותיים בתגובות הסלולר נצפו על השוואה של אינטרפרון-גמא כתמים של PBMCs splenocytes של שרקנים זה היו חיסון עם חיסון נגד שפעת מסוג pNP אותו14.
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר שגרת החיסונים intradermal. מהווה הרציונל העיקרי עבור מזהה חיסון מכוון את צפיפות גבוהה של תאים דנדריטים נוכח העור25. אנחנו ואחרים הראו כי ניתן לפלח במיוחד תאים אלה על-ידי התאמת שיטת מסירה26, ניסוח27או סמים-עיצוב28. תאים אנטיגן מקצועיים מופעל יכול להגר לימפה המנקזים ולהפעיל את מערכת החיסון מסתגלת29,30,31,32. תאים דנדריטים הם חיוניים אנטיגן מצגת התא-הסוג עבור הטרמה תגובות חיסוניות הסלולר פרודוקטיבי.
במחקר זה חיות היו חיסון עם פלסמיד DNA קידוד של נוקלאופרוטאין של שפעת H1N1 זן A/PuertoRico/8. העור מסירה של חיסון זה pDNA (pNP) בשילוב עם אלקטרופורציה הפגין שמעודדים אנטיגן ספציפי התגובות ההורמונאלית שרקנים33, חמוסים ו1,אנושיות פרימטים (NHPs)34. בנוסף, חיסון זה elicited חזקים תגובות T-cell בעכברים לאחר הלידה לתוך האפידרמיס35, אשר ניתן לייחס CD4 ו תאי-T CD8 על ידי גירוי עם פפטידים המייצגים epitopes ספציפיים עבור אוכלוסיות התאים אלה. החיסון pNP היה גם immunogenic לאחר הלידה הרירית כפי שמתואר על ידי הדור של התגובות ההורמונאלית ארנבונים, שרקנים, כמו גם תגובות הסלולר ו ההורמונאלית ב עכברים36. לאחרונה, הקבוצה שלנו היה מסוגל להפגין את הדור של IFN-γT-תא תגובות ב הארנב לאחר הלידה התוך שרירי (נתונים שלא פורסמו).
כיום, המקומות אינטרפרון-גמא שנצפה החזיר גיניאה ELISpot לא ניתן להקצות לקבוצת משנה CD4 + או -CD8 + T-cell. במיוחד עבור העיצוב והפיתוח של טיפולים חיסוניים מיקוד על העור, זה יהיה מאוד שימושי לקבוע אם התדרים הספוט הנצפה אינטרפרון-גמא נגרמות על ידי הרחבת אחד משנה מסוימת או תגובה מאוזן של שניהם על מנת להעריך את היעילות של החיסון כדי לעורר קרוס-מצגת. ניתן יהיה להתגבר על מגבלה זו על-ידי שלילי-מיון תא CD4 או CD8 לפני זריעה התאים בצלחת או על-ידי זיהוי של MHC class II (עבור תגובות CD4) או מחלקה MHC אני (עבור תגובות CD8) מוגבלת epitopes.
וזמינותו אינטרפרון-גמא ELISpot מתואר כאן באמצעות שפן PBMCs כתובות צורך להעריך את הקורס של תגובות הסלולר במודל מעבדה שפן. זה למקד את התפתחות חיסונים, עור משלוח פרוטוקולים. אנו מאמינים שהוא מאפשר העסקתם של מודל זה בעל חיים רלוונטי ללמוד מחלות עם מרכיבים חשובים T-cell כגון שחפת37, אבולה38, HSV39ואחרים. זה יקטין את השימוש במודלים פחות רלוונטי.
Disclosures
המחברים העובדים קתרין Schultheis הולי מ ששחה, בריאן ס יאנג, ג'נט או, הולי מ ששחה, ג'קלין נגוין, לורן Humeau, קייט אי ברודריק, טרוור אר. אף Smithare של Inovio תרופות ככזה מקבלים שכר והטבות, כולל בעלות על מניות, אופציות, מן החברה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות חברי Inovio תרופות R & D המחלקה לסיוע טכני וצוות של Acculab על מתן שירות האחזקה מצוינות. במיוחד ברצוננו להודות ראובן צוקרמן Vu ואגנס ג'ו להגהת כתב היד. עבודה זו לא מומן על ידי כל מענק ספציפי מן מהארגונים במגזר הציבורי, מסחריים, או שלא למטרות רווח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B.
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
