Summary
Le développement du test ELISpot interféron-gamma pour cobaye PBMC permet la caractérisation des lymphocytes T dans ce modèle très pertinent pour l’étude des maladies infectieuses. Nous avons appliqué le test permettant de mesurer les lymphocytes T associés intradermique de vaccins à ADN.
Abstract
Le cochon d’Inde a joué un rôle central comme un modèle animal petit pertinent dans le développement de vaccins pour les maladies infectieuses comme la tuberculose, la grippe, la diphtérie et les fièvres hémorragiques virales. Nous avons démontré que l’administration des vaccins ADN plasmidique (pDNA) dans la peau provoque robustes réponses humorales chez le cobaye. Cependant, l’utilisation de cet animal au modèle des réponses immunitaires a été quelque peu limitée dans le passé en raison de l’absence de disposition réactifs et protocoles pour l’étude des lymphocytes T. Les lymphocytes T jouent un rôle pivot en tant immunoprophylactiques et les mécanismes de l’immunothérapie. Compréhension des lymphocytes T est crucial pour le développement des maladies infectieuses et vaccins de l’oncologie et des dispositifs d’administration accommodants. Nous décrivons ici un dosage d’enzyme-linked immunospot (ELISpot) interféron-gamma (IFN-γ) pour cobaye cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Le test permet aux chercheurs de caractériser les réponses de cellules T du vaccin spécifique dans ce modèle de rongeur important. La capacité d’analyser les cellules isolées du sang périphérique offre la possibilité d’immunogénicité chez les individus de suivre.
Introduction
Le protocole décrit ici permet de détecter de l’interféron-gamma cellules sécrétrices (IFN-γ) après rappel de l’antigène dans une population de cellules mononucléaires (PBMC) de sang périphérique récoltée sur les cobayes Hartley. Nous avons appliqué le test afin de caractériser la cinétique et les amplitudes des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à un schéma de vaccination de grippe chez le cobaye. Nous croyons que ce protocole va propulser significativement le développement préclinique de programmes de vaccination dans ce modèle animal très pertinent.
Les lymphocytes T induites par les vaccins jouent un rôle essentiel dans la protection contre les agents infectieux et les voies immunothérapeutiques associés avec d’autres maladies. A souligné l’importance des cellules T dans plusieurs études de vaccin. Vaccination des furets et des souris avec de l’ADN plasmidique (pDNA) codant pour l’hémagglutinine H5 et protection fournie de neuraminidase N1 de la morbidité et la mortalité dans un défi de virus de la grippe en l’absence d’anticorps neutralisants, indiquant l’importance de De l’immunité cellulaire t1. En plus de forte neutralisation réponse humorale, lymphocytes T jouent un rôle crucial pour non seulement la clairance virale2 , mais aussi une protection contre l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS) en souris3. Chez l’homme, préexistant des cellules T CD8 + ont été associés à la sévérité de la maladie a diminué au cours de la grippe H1N1 pandémique en 20094. Nombre de cellules T CD4 + ainsi que la concentration plasmatique de certaines cytokines est corrélé avec la sévérité de la maladie dans les enfants infectés par le RSV5.
Le cochon d’Inde a gagné la proéminence comme un modèle de laboratoire de recherche et développement dans divers domaines de la médecine comme la sensibilisation de la peau, recherche nutritionnelle, études du système auditif et, les plus pertinentes pour ce travail, les maladies infectieuses. Il était essentiel que la découverte de vaccins contre la tuberculose et la diphtérie. Plus récemment, le cochon d’Inde est utilisé comme modèle pour grippe6 et Ebola7. En outre, le cobaye possédant des similitudes physiologiques de la peau humaine8, propose un modèle animal petit accessible pour les méthodes de livraison de drogue par voie cutanée. Contrairement à son importance comme un modèle de laboratoire, la disponibilité des tests spécifiques de cobaye et des sondes pour caractériser les réponses immunitaires demeure limitée9. Des analyses cellulaires fondamentaux tels que l’IFN-γ-enzymatique immunospot (test ELISpot) qui est régulièrement utilisée dans la recherche préclinique et clinique pour énumérer les lymphocytes T ne sont pas disponibles.
Les premiers essais de phase solide enzyme-linked immunospot ont été utilisés pour déterminer le nombre de cellules sécrétant des anticorps spécifiques dans une cellule de B-population diversifiée10,11. Le format a avancée pour détecter les cellules qui sécrètent des cytokines, notamment IL-1, il-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alpha, bêta-TNF, granzyme B et IFN-γ. Le test ELISpot possède une sensibilité élevée ; potentiellement chaque cellules productrices de cytokines peuvent être détectées. La limite de détection pour ELISpot analyses a été signalée à être inférieure à 10 points par 100 000 PBMC12. Récemment, une paire d’anticorps spécifiques de IFN-γ-cobaye a été effectuée disponible13, et cela ouvre la possibilité de régler cette lacune dans le domaine.
IFN-γ est considéré comme une molécule effectrice important dans la réponse immunitaire adaptative ; Elle peut être produite et sécrétée par des cellules CD4 et CD8 T tant lors de l’activation. IFN-γ a une large gamme de biologique fonctionne dans le cadre d’une réponse immunitaire à une infection par le virus, tels que l’activation des macrophages et la régulation haut du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) j’ai et expression MHCII. Il aussi favorise la différenciation des lymphocytes B, inhibe la croissance des cellules T-helper-2 et active les cellules tueuses naturelles. IFN-γ bloque la réplication virale dans les cellules somatiques infectées et régule à la hausse expression des molécules du CMH. Ainsi, la production d’IFN-γ est une indication très importante de la qualité de la réponse des lymphocytes T à un vaccin ou l’agent pathogène.
Un aspect important de l’ELISpot d’IFN-γ présenté ici est l’utilisation de PBMC plutôt que des splénocytes13. PBMC peut être obtenu par le traitement d’un échantillon de sang non terminal, tandis que le rassemblement des splénocytes exige une euthanasie animale avant la récolte de la rate. L’utilisation de PBMC permet d’IFN-γ-lymphocytes T à surveiller pendant un laps de temps et de l’évaluation des effets sur les réponses de cellules T tels que les régimes de prime-boost14.
Pour les chercheurs qui utilisent actuellement le cobaye comme modèle animal, la méthode de test ELISpot IFN-γ élargira l’éventail des données scientifiques qu’ils peuvent tirer. La disponibilité peut désormais réduire la nécessité de mener des études avec des modèles animaux moins pertinents pour la maladie de la cible, qui ont été préalablement choisis en raison de la disponibilité de réactif pour l’examen des réponses cellulaires. L’utilisation de PBMC plutôt que la rate ou des ganglions permet aux expériences non terminaux et à une surveillance continue des individus.
Ci-dessous, nous fournir une description détaillée des étapes impliquées dans la détection d’une réponse cellulaire d’IFN-γ cochons d’Inde au vaccin pDNA. Nous exposer brièvement notre procédure de livraison spécifiques et décrivent le test ELISpot général englobant les prélèvements sanguins, traitement du sang, la récolte PBMC, mode opératoire et l’analyse des données. Une représentation schématique du test ELISpot est représentée dans la Figure 1.
Figure 1 : Un aperçu schématique du cobaye protocole ELISpot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’utilisation (ACUC) de Acculab et animalier.
Remarque : Le protocole exige l’utilisation de matières dangereuses potentielles. S’il vous plaît se référer à la fiche signalétique du fabricant et porter un vêtement approprié (EPI) tout au long de la procédure.
1. préparation de l’emplacement de la vaccination de cobaye, intradermique Mantoux-injection et CELLECTRA-3P-EP-procédure
-
Préparation de l’emplacement de traitement sur le cochon d’Inde.
- Placez le cobaye dans une chambre à induction et anesthésier à 5 % Isoflurane-vapeur.
- Retirer l’animal de la chambre et mettre coiffe en position, offrant 2 % Isoflurane vapor pour maintenir l’anesthésie tout au long de la procédure.
- Raser la zone d’environ 4 cm2 sur flanc abdominale.
- Désinfecter la zone rasée avec éthanol-écouvillon.
-
Injection de procédure pDNA-formulation et électroporation.
- Utiliser une seringue à insuline pour injecter 100 µl formulation dans le derme par la technique de Mantoux. L’aiguille est insérée en biseau vers le haut à un angle de 10 degrés avec le corps de l’animal.
- Retirer l’aiguille et immédiatement insérer des électrodes CELLECTRA® - 3P à travers l’injection-papule et appliquer le champ électrique.
- Enlever les animaux de l’anesthésie et surveiller sa récupération.
2. Non-terminal saigner
-
Collecte de sang de la veine jugulaire de cobaye anesthésié.
- Placez le cobaye dans une chambre à induction et anesthésier l’animal tel que décrit en 1.1.1
- À l’aide d’une seringue de 3 ml avec une aiguille de 27 1/2 pouce, ponctuent la veine jugulaire de l’animal anesthésié et recueillir 3 ml de sang.
- Transférer immédiatement le sang dans le tube de prélèvement de sang K2EDTA, inverser le tube plusieurs fois pour mélanger le sang anticoagulant et les placer sur la glace.
NOTE : Éviter la coagulation du sang est crucial pour le succès traitement en aval de l’échantillon de sang. - Surveiller le rétablissement de l’animal.
3. traitement des échantillons sanguins
-
Séparation des PBMC du sang total par centrifugation de gradient de densité
- Diluer le sang 1:1 avec Hank Balanced Salt Solution (HBSS).
Remarque : Pour éviter toute contamination, tous les travaux d’ici doit être effectuée dans une armoire de biosécurité appliquant une technique aseptique. - Couche diluée sang progressivement au-delà de 4,5 ml Ficoll-Paque Plus dans un tube de 15 ml-conique. Éviter les perturbations de l’interface. Remarque : Pour assurer une bonne séparation, gradient de Ficoll-Paque doit être à température ambiante.
- Centrifuger les tubes à 800 rcf pendant 30 min avec frein.
Remarque : comme alternative, les tubes de SepMate™ (STEMCELL Technologies) peut être utilisée pour la séparation des PBMC. Sang dilué HBSS est ajouté au tube de SepMate 15 ml contenant 3,5 ml Ficoll-Paque Plus et puis centrifugé à 1200 rcf pendant 10 min (frein). Cette technique de centrifugation en gradient éonomiseur de temps traduit par viabilité égale, rendement des cellules et tache-formation. - Récolte de Buffy-couche et diluer dans le milieu de la R10 (10 % (v/v) chaleur-désactivé SVF et 1 % (v/v) : Pen/Strep en milieu RPMI1640) pour un volume total de 15 ml.
- Pellet cellules par centrifugation à 450 rcf pendant 5 min.
- Laver deux fois avec la R10 moyenne des cellules.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 ml R10 et passez la suspension de cellules par l’intermédiaire de 70 µm cellule-crépine en dans un nouveau tube.
- Compter les cellules et déterminer le nombre de cellules vivantes par coloration au bleu Trypan.
- Diluer les cellules avec R10 moyenne à une concentration de 1 x 10 ^ 6 cellules vivantes par ml.
- Diluer le sang 1:1 avec Hank Balanced Salt Solution (HBSS).
4. préparation des plaques d’ELISpot et stimulation des cellules
-
Manteau et bloc puits d’une plaque à 96 puits ELISpot PVDF membrane avant d’ensemencer les PBMC.
- Plaques doivent être pré-traités pendant 60 secondes. Prétraitement de l’éthanol se traduira par moins imprécise spot-formation et spots avec une meilleure définition.
Remarque : Prendre des précautions supplémentaires pour s’assurer que la membrane complète entre en contact avec 15 µl 35 % éthanol. - Après 60 secondes ajouter 150 µl 1 x PBS / puits et ensuite vider le puits en inversant les plaques.
Remarque : Le traitement préalable de l’éthanol est très sensible au temps. Incuber pas la membrane bien plus longtemps que 60 s Membranes ne doit pas sécher aux étapes suivantes de la procédure. - Laver les plaques trois fois avec du PBS de 1 x 250 µl / puits.
- Nappez avec 100 µl/puits de 5 µg/ml capture anti-cobaye anticorps d’IFN-γ V-E4 dans du PBS.
- Incuber les plaques au moins 12 heures à 4° C.
- Laver les plaques en ajoutant 250 µl/puits PBS trois fois.
- Ajouter 200 µl/puits de tampon de blocage (10 % (p/v) de Sucrose et 2 % (p/v) : BSA dans du PBS) et incuber pendant 2 heures à température ambiante.
- Laver trois fois les plaques avec 250 µl/puits de PBS.
- Plaques doivent être pré-traités pendant 60 secondes. Prétraitement de l’éthanol se traduira par moins imprécise spot-formation et spots avec une meilleure définition.
-
Plaque PBMC avec des peptides spécifiques de l’antigène, les contrôles positifs et négatifs.
- Diluer le pool de protéine-peptide en R10 à concentration peptidique finale désirée.
- Doser les PBMC échantillon en géométrie.
Remarque : Ajoutez moyen avec des stimulants aux plaques ELISpot abord ainsi la suspension PBMC deuxième. - Ajouter 50 µl de milieu de peptide-R10 aux puits indiqués.
- Contrôle négatif ajouter 50 µl formulation de peptide vide en R10 dans les puits indiqués.
- Pour contrôle positif ajouter 5 µg/ml de la Concanavaline A (ConA) dans un milieu R10 dans les puits indiqués.
- Ajouter 100 µl de la suspension cellulaire PBMC dans toutes les loges
- Incuber les plaques en atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37° c pendant 18 heures.
NOTE : Place ELISpot plaques sur une même surface/grille dans l’incubateur et éviter toute perturbation des plaques au cours de la période d’incubation.
5. détection des points positifs de l’interféron-gamma
-
Incubation avec détection développement d’anticorps et la plaque.
Remarque : Pour toutes les étapes de cette section sans asepsie est requise.- Retirer délicatement les plaques de l’incubateur et vider en toute sécurité des puits. Laver les plaques en ajoutant 250 µl/puits PBS pour trois fois.
- Ajouter 100 µl/puits de 2 µg/ml détection anti-cobaye IFN-γ anticorps biotinylé N-G3 dilué dans un tampon bloquant.
Remarque : Filtre (22 µm) anticorps solution pour réduire le fond. - Incubation avec l’anticorps de détection pour 2 heures à température ambiante.
- Jeter le surnageants et laver les plaques en ajoutant 250 µl/puits PBS trois fois.
- Ajouter 100 µl/puits de la phosphatase alcaline (ALP)-conjuguée streptavidine diluée dans un tampon bloquant.
Remarque : Filtre (22 µm) solution pour réduire le fond. - Incuber 1 h à température ambiante avec conjugué streptavidine-ALP.
- Jeter la solution streptavidine-ALP et laver les assiettes en ajoutant 250 µl/puits PBS deux fois enlever excès PBS en inversant la plaque et il buvard contre un essuie-tout propre.
- Laver les assiettes en ajoutant 250 µl/puits d’eau UltraPure DI une fois et enlever l’eau en excès en inversant la plaque et il buvard contre un essuie-tout propre.
- Ajouter 100 µl de solution de substrat BCIP/NBT (prudence) dans chaque puits. Attention : BCIP/NBT est très inflammable et toxique en cas d’ingestion, contact avec la peau ou par inhalation. Avant utilisation, reportez-vous à la fiche signalétique.
- Incuber pendant 20 min à température ambiante, Abrie de la lumière.
- Rincez la plaque 4 fois avec de l’eau désionisée. Inverser la plaque et tapoter pour enlever l’excès d’eau.
- Retirer de drainage en plastique du bas des plaques ELISpot et laisser les plaques sécher.
- Quantifier les taches manuellement ou en utilisant un lecteur d’ELISpot automatisé, par exemple le lecteur de plaque CTL-Immunospot S6.
Representative Results
Les résultats présentés ici servent de référence pour les résultats escomptés suite à l’utilisation de ce protocole, soulignant l’importance des étapes cruciales et confirmant les avantages des optimisations décrits.
Après centrifugation en gradient de densité comme indiqué au point 3.1 du protocole, le liquide rouge et visqueux au fond du tube contient la plupart des globules rouges. Comme illustré à la Figure 2A, au-dessus de globules rouges est une couche de la densité moyenne. Entre une couche de plasma clair ou jaune sur le dessus et la densité de gradient moyen est la couche blanche ou brune couche leuco-plaquettaire, qui contient la plupart des globules blancs et plaquettes. Séparation incomplète se manifeste comme la présence de globules rouges sur le dessus de la moyenne de gradient de densité. La coloration rouge du plasma dans la Figure 2A est très probablement due à l’hémolyse, tel que cet échantillon de sang a été stocké dans le tube de prélèvement 1,5 h avant d’être traités. Figure 2 B montre le dégradé avant (à gauche) et après centrifugation (à droite) dans le dispositif d’isolation des PBMC. Échantillon de sang dans la Figure 2B a été traitée avec un minimum de retard après prélèvement de sang et la plasma une coloration est jaune.
L’effet de prémouillage les membranes à l’éthanol (voir point 4.1 du protocole) sur place-développement est illustré à la Figure 3. Taches dans les puits pré-traité affichent une définition améliorée, et il y a une réduction du nombre de taches dans les puits de contrôle négatif moyen/DMSO (Figure 3A). Viabilité typique de cobaye transformé PBMC varie d’environ 90 % et est similaire pour les tubes réguliers 15 mL et dispositifs d’isolation des PBMC (Figure 3B). Rendement des cellules viables dans un échantillon de sang de 3 mL varie généralement entre 3 x 10,6 et 5 x 106.
Animaux ont été vaccinés avec plasmide ADN codant la nucléoprotéine (NP) de la souche H1N1 Influenza A/PuertoRico8. La figure 4 illustre énumération des réponses lymphocytes IFN-γ présenté comme tache formant unités (SFU) générées sur toute la durée d’un schéma de vaccination. Test ELISpot avec PBMC récoltées sur des animaux non vaccinés résultats négligeables compte spot (pas de tx). Quatorze jours après la première vaccination (prime), une moyenne de 970 places de IFN-γ par millions PBMC ont été comptés après stimulation immunogène. Sept jours après la deuxième vaccination (boost), T-lymphocytes contre tous les trois bassins ont été élargies, pour atteindre une moyenne de 5020 IFN-γ unifamiliales/106 PBMC. quarante-six jours après la deuxième vaccination (mémoire), un effectif total de 6310 IFN-γ unifamiliales/10 6 les PBMC ont été comptés dans le sang périphérique.
LÉGENDES DE LA FIGURE :
Figure 2 : Des images représentatives des couches après centrifugation de gradient de densité. Échantillon de sang (A) avant (à gauche) et après (à droite) centrifugation dans des tubes réguliers. (B) sang déguster avant (gauche) et après (à droite) centrifugation dans des dispositifs d’isolation des PBMC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Optimisation du protocole. (A) l’aspect typique des points positifs de IFN-γ dans une plaque de test ELISpot bien développé selon le protocole. Puits en triple exemple figurent après traitement préalable avec de l’éthanol (à droite) ou sans traitement préalable (à gauche). Cellules ont été incubées pendant la nuit soit avec le DMSO (en haut) en tant que stimuli non contrôle, appariés selon l’antigène peptides (au milieu), ou le mitogène ConA (en bas). PBMC provenaient de l’animal même. Puits ont été projetés à l’aide d’une plaque-module de balayage automatisé. (B) la comparaison des différents tubes de gradient de densité sur les cellules transformées. 3 mL d’échantillons de sang de 3 cobayes individuelles ont été recueillies. 1,5 mL de chaque échantillon ont été traitées à l’aide de deux tubes réguliers (milieu de gradient de densité) ou isolation des PBMC. Viabilité (gauche, % ± SEM) et le nombre de cellules vivantes (à droite, x 106 ± SEM) ont été déterminées à l’aide d’une cellule automatique compte système et le dosage de l’exclusion le bleu trypan. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Détection de la réponse immunitaire cellulaire robuste au cours d’un schéma de vaccination. Aux jours 1 et 15, 30 µg de pDNA encodage nucléoprotéine de grippe A (NP) a été livrée par voie cutanée intra abdominale flanc de cobayes Hartley, immédiatement suivie par peau-électroporation. Réponse d’ELISpot IFN-γ mesurait 14 jours après la première vaccination (prime) et 7 jours (boost) et 46 jours (mémoire) après la seconde vaccination. Moyenne des unifamiliales + SEM ont été tracée pour 5 cobayes traités et 2 cochons d’Inde non traitées (aucune tx). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le cobaye est un modèle animal précieux pour le développement préclinique des vaccins et des stratégies d’administration intradermique. Le protocole ci-dessus décrit la méthodologie pour mesurer les réponses spécifiques à l’antigène des lymphocytes T dans ce modèle très pertinent. Le test fournit une énumération claire de périphériques T-cellules productrices d’interféron-gamma lors de la stimulation avec des peptides spécifiques de l’antigène. La cinétique de la réaction immunitaire peut être surveillée par prélèvements sanguins non terminaux.
Nous optimisé le protocole et identifié les aspects critiques pour obtenir des résultats optimaux en utilisant ce test. Par exemple, la formation de caillots de sang dans le tube de prélèvement se traduira dans la viabilité et la récupération PBMC sous-optimale. Des caillots sanguins de cobaye très rapidement18. Il est crucial d’effectuer le tirage de sang rapidement. UA-Birck Al fournissent un guide complet pour saignement techniques dans le modèle cobaye16. Étant donné que la collecte de sang nécessite une anesthésie générale, il est recommandé de revoir les procédures d’utilisation normalisées applicables de cet aspect de la procédure19. Cobayes insuffisamment anesthésiés réagira en déplaçant leurs jambes ou vocalisation après une brève pincée du tissu entre leurs orteils avec vos ongles ou de broncher leurs oreilles et leurs moustaches progresser après pincement leur oreille. Le transfert immédiat du sang dans un tube avec anticoagulant et mélanger soigneusement par laminage ou renversant le tube plusieurs fois est une étape essentielle dans le présent protocole. Pour le protocole décrit ici EDTA-tubes ont été utilisés, et aucune autres anticoagulants ont été testés. Veuillez noter que l’EDTA est hypertonique, tubes devraient idéalement être remplis plein plus de la moitié et donc la taille du tube approprié pour le volume de l’échantillon doit être utilisé.
Lorsque exécuté correctement, centrifugation en gradient de densité entraîne constamment propre préparation de PBMC. Le milieu de gradient de densité doit être à température ambiante lorsque la superposition du dégradé avant la centrifugation, et freins ne doivent pas être utilisés pour arrêter la centrifugeuse lors de l’utilisation de tubes réguliers. Une amélioration significative en termes de praticité des PBMC du traitement était la combinaison de centrifugation en gradient de densité avec dispositifs d’isolation des PBMC. Cela permet une réduction du temps de centrifugation. Centrifugation en gradient de densité dans les dispositifs d’isolation des PBMC et tubes réguliers résultats similaires viabilité, vivent les numérations des PBMC transformés et formation de spot. Indépendamment du type de tube utilisé pour la séparation, la récolte de la couche leuco-plaquettaire doit suivre immédiatement. Sur une longue période de temps de contact avec le milieu de gradient de densité est cytotoxique pour les PBMC.
Il est important de constamment paritairement de semences de cellules dans les puits de dosage-plaque de comptage précis des PBMC viables. Une méthode pour vivre/dé la discrimination doit être appliquée. Dans notre laboratoire, nous utilisons le test de bleu trypan exclusion et un compteur de cellules automatisé.
Spot qualité, définie sous forme de taches contrastées à arêtes vives et hautes, se traduira par une meilleure précision et comptage spot cohérente, surtout lorsque vous utilisez un système de comptage automatique. Conformément aux recommandations du fabricant, nous avons observé des traitements préalables à l’éthanol des plaques ELISpot pour être une étape cruciale pour réduire le nombre de taches de fond et d’améliorer la définition des taches. L’utilisation d’un lecteur de plaque d’image test ELISpot-plaques à la fin du protocole est fortement recommandée. Les images originales de chaque puits peuvent être facilement et efficacement obtenus et stockés. À l’aide d’un logiciel d’analyse image images numériques permettent également une analyse objective et spot de comptage par rapport au comptage manuel par chacun des opérateurs.
Une nécessité absolue pour le développement de l’essai décrit ici est la génération d’un cobaye anti-adapté paire anticorps interféron-gamma. Anticorps monoclonaux de souris V-E4 et N-G3 ont été développés par hybridome-technique avec des clones de lymphocytes B chez des souris qui ont été immunisés avec cobaye recombinant interféron gamma20. V-E4, qui est isotypes IgG1, et N-G3, qui est IgG2a, sont rapportés pour lier à l’antigène recombinant et native. Assignant V-E4 en tant que l’anticorps de capture et biotinylés N-G3, conclu à l’anticorps de détection haute sensibilité pour des protéines recombinantes et de native tout en conservant le signal faible bruit de fond dans un format "sandwich"-ELISA. Les anticorps sont disponibles à la communauté scientifique à travers un accord de fabrication conduit par le laboratoire du Dr Hubert Schaefer, qui est co-auteur de cette publication. Demandes seront reçus par le laboratoire de Dr. Schaefer et puis fabriqués par un partenaire commercial.
L’interféron-gamma est signalé à être instable dans les tampons ou médias régulière21. Sophie Al20 a signalé qu’une diminution modérée du taux de récupération lorsqu’à l’aide de dégradés IFN-y, qui avait perdu la fonctionnalité biologique, dans un format de ELISA utilisant des anticorps V-E4 et N-G3. Toutefois, augmenter le temps d’incubation de la stimulation de peptide de PBMC plus 18 h doit être soigneusement testé.
Les avantages de l’utilisation de PBMC a été examinée. Cependant, le test décrit ici ne reflète que les réponses spécifiques à l’antigène des cellules T dans la périphérie de circulation. Lymphocytes T-infiltrer les tissus ou cellules isolées des organes lymphatiques, tels que la rate et les ganglions lymphatiques, peuvent présenter des propriétés différentes22,23,24. Aucune différence significative dans les réponses cellulaires ont été observés lors de la comparaison des taches d’interféron-gamma de PBMC et splénocytes de cobayes qui ont été immunisés avec les même du vaccin grippe pNP14.
Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure de vaccination intradermique. Une justification principale de vaccination ID cible la densité élevée des cellules dendritiques présentes dans la peau de25. Nous et autres avons montré que ces cellules peuvent être spécifiquement ciblés en adaptant les bordereaux26, formulation27ou28de la conception des médicaments. Les cellules présentatrices d’antigène professionnels activées peuvent migrer vers un ganglion drainant et activer le système immunitaire adaptatif29,30,31,32. Les cellules dendritiques sont le type cellulaire de la présentation antigène essentiel pour amorcer des réponses immunitaires cellulaires productifs.
Pour cette étude animaux ont été vaccinés avec plasmide ADN codant la nucléoprotéine de grippe H1N1 la souche A/PuertoRico/8. Livraison de la peau de ce vaccin pDNA (pNP) en combinaison avec l’électroporation avait été démontré pour provoquer des réponses humorales antigène-spécifiques en cobayes33, furets et primates non-humains (PNH)1,,34. En outre, ce vaccin a suscité robuste-lymphocytes T chez les souris après l’accouchement dans l’épiderme35, qui pourrait être attribué à CD4 et CD8 T-cellules en stimulant avec des peptides représentant des épitopes spécifiques pour ces populations de cellules. Le vaccin pNP est aussi immunogène après livraison muqueuse comme en témoigne la génération de réponses humorales chez les lapins et cochons d’Inde, ainsi que des réponses cellulaires et humorales chez les souris36. Plus récemment, notre groupe a pu démontrer la génération de réponses IFN-γT-cellulaire chez le lapin après livraison intra musculaire (données non publiées).
Actuellement, les taches de l’interféron-gamma observés chez le cobaye ELISpot ne peuvent être attribués à un sous-ensemble de CD4 + ou CD8 + T-cell. Surtout pour la conception et le développement de thérapies immunisées ciblant la peau, il serait très utile pour déterminer si les fréquences spot d’interféron-gamma observés sont causés par l’expansion d’un sous-ensemble particulier ou une réponse équilibrée des deux afin de évaluer l’efficacité de la vaccination pour déclencher la présentation croisée. Cette limitation peut être surmontée en négatif tri cellulaire pour CD4 ou CD8 avant le semis des cellules sur la plaque ou par identification du CMH de classe II (CD4 réponses) ou CMH de classe I (pour les réponses de CD8) restreint épitopes.
Le dosage d’ELISpot interféron-gamma décrit ici à l’aide de cobaye PBMC répond à la nécessité d’évaluer le cours des réponses cellulaires dans le modèle de laboratoire de cobaye. Cela améliorera le développement de vaccins et les protocoles de remise de la peau. Nous croyons qu’elle permet l’emploi de ce modèle animal pertinent pour étudier les maladies avec des composantes importantes de lymphocytes TB37, Ebola38, HSV,39, et autres. Il permettra de réduire l’utilisation de modèles animaux moins pertinents.
Disclosures
Les auteurs salariés Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick et Trevor R.F. Smithare de Inovio Pharmaceuticals et ainsi recevoir des salaires et avantages sociaux, y compris la propriété de actions et options sur actions, de la compagnie.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres de la Inovio Pharmaceuticals département R & D pour l’assistance technique et le personnel de Acculab pour fournir un service d’élevage excellence. En particulier, nous tenons à remercier Alysha Vu et Joe Agnes pour la relecture du manuscrit. Ce travail n’était pas financé par toute subvention spécifique de bailleurs de fonds dans les secteurs publics, de commerciale ou à but non lucratif.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B.
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
