Разработка интерферона гамма ELISpot assay для морской свинки получения позволяет характеристик Т-клеток ответов в этой весьма актуальны модели для изучения инфекционных заболеваний. Мы применили assay для измерения Т-клеток ответов, связанных с внутрикожное введение вакцины ДНК.
Морская свинка играл ключевую роль как модель соответствующих мелких животных в разработке вакцин против инфекционных заболеваний, как туберкулез, гриппа, дифтерии и вирусных геморрагических лихорадок. Мы продемонстрировали, что плазмида ДНК (pDNA) вакцинации в кожу вызывает надежные гуморальные ответы в морской свинки. Однако использование этого животного к модели иммунные реакции было несколько ограничены в прошлом из-за отсутствия доступных реагентов и протоколов для изучения ответов Т-клеток. Т-клетки играют ключевую роль в иммунопрофилактики и иммунотерапевтических механизмов. Понимание Т-клеток ответов имеет решающее значение для развития инфекционных заболеваний и онкологии вакцин и размещения поставки устройств. Здесь мы описываем assay энзим соединенный immunospot (ELISpot) интерферона гамма (ИФН γ) для морской свинки мононуклеаров периферической крови (получения). Assay позволяет исследователям характеризуют вакцины специфических Т-клеток ответов в этой важной грызунов модели. Способность к assay клетки изолированы от периферической крови предоставляет возможность отслеживать иммуногенности в отдельных животных.
Протокол, описанные здесь позволяет обнаружить интерферона-гамма (ИФН γ) секреции клетки после отзыва антигена в периферической крови мононуклеарных клеток (КСДОР) населения, добываемых из морских свинок Хартли. Мы применили assay охарактеризовать кинетику и величины антиген специфические Т-клеток ответов схема вакцинации против гриппа в морской свинки. Мы считаем, что этот протокол будет значительно продвинуть доклинические развития программ вакцинации в этой весьма актуальны модели на животных.
Т-клетки, вызвал вакцины играть важную роль в деле защиты против инфекционных агентов и иммунотерапевтических пути, связанные с другими заболеваниями. В нескольких исследованиях вакцины была подчеркнута важность Т-клеток. Иммунизации хорьки и мышей с плазмида ДНК (pDNA) кодирования для H5 гемагглютинин и N1 нейраминидазы представил защите от заболеваемости и смертности в вызов вирус гриппа в отсутствие нейтрализующих антител, указывая значение Т-клеток иммунитета1. В дополнение к сильным нейтрализации гуморального иммунного ответа, Т-клетки играют важную роль не только Вирусный Распродажа2 , но и защиту от инфекции с респираторно-синцитиальный вирус (RSV) в мышей3. В организме человека, ранее существовавших CD8 + Т-клетки были связаны с снижение болезнь тяжести во время H1N1 пандемии в 20094. CD4 + Т-клеток вместе с плазменной концентрации некоторых цитокинов коррелируются с тяжести заболевания в RSV-инфицированных детей5.
Морская свинка приобрела известность как модель лаборатория для исследований и разработок в различных областях медицины, такие как чувствительность кожи, питанием исследования, исследования слуховой системы и, что наиболее актуальными для этой работы, инфекционные заболевания. Это имеет решающее значение для открытия вакцин против туберкулез и дифтерия. Совсем недавно морской свинки используется в качестве модели для гриппа6 и7Эбола. Кроме того обладая физиологического сходства для кожи человека8, морская свинка предлагает модель доступной малых животных для методов доставки дермального наркотиков. В отличие от его важность как модель лаборатории наличие конкретных анализов морских свинок и зонды характеризовать иммунных реакций остается ограниченным9. Основные сотовой анализов, например энзим соединенный immunospot ИФН γ (ELISpot проба), обычно используется в доклинических и клинических исследований для перечисления Т-клеток ответы не были доступны.
Первый immunospot энзим соединенный твердофазный анализов были использованы для определения числа конкретных антитела секретирующих клеток в клетки B населения10,11. Формат расширенный обнаружить клетки секретирующие цитокинов, включая IL-1, IL-2, IL-4, Ил-5, IL-6, Ил-10, ГМ-КСФ, ФНО альфа, TNF-бета, Гранзим B и ИФН γ. ELISpot assay обладает высокой чувствительностью; потенциально могут быть обнаружены каждой ячейки производство цитокинов. Сообщается, что предел обнаружения для ELISpot анализов будут ниже, чем 10 спотов в 100000 получения12. Недавно пару специфическое антитело ИФН γ-свинки был сделан доступны13, и это открыло возможность для решения этого дефицита в области.
ИФН γ считается важным эффекторные молекулы в адаптивного иммунного ответа; Это могут быть произведены и выделяется клетками CD4 и CD8 T после активации. ИФН γ имеет широкий спектр биологических функций в контексте иммунного ответа к вирусной инфекции, такие как активация макрофагов и вверх регулирование комплекс гистосовместимости (MHC) я и MHCII выражения. Он также способствует B-клеточной дифференцировки, подавляет рост клеток T-помощник-2 и активирует естественных клеток-киллеров. ИФН γ блокирует репликацию вируса в зараженных соматические клетки и upregulates экспрессии молекул MHC. Таким образом производство ИФН γ является очень важным показателем качества Т-клеток реакции на вакцину или патогена.
Важным аспектом здесь представлена ELISpot ИФН γ является использование репликацию, вместо того, чтобы splenocytes13. Репликацию можно получить путем обработки-терминал сбора крови, тогда как сбор splenocytes требует животных euthanization до сбора урожая в селезенке. Использование получения позволяет ИФН γ T-клеток ответов на наблюдение за определенный период времени и оценки воздействия на Т-клеток ответов, таких как премьер boost схемы14.
Для исследователей, которые в настоящее время используют морскую свинку в животной модели метод ELISpot ИФН γ расширит спектр научных данных, которые они могут получить. Его доступность теперь может уменьшить необходимость проведения исследований с менее соответствующих животных моделей для целевого болезни, которые ранее были выбраны из-за наличия реагента для изучения клеточных реакций. Использование репликацию вместо селезенки и лимфатических узлов позволяет для экспериментов-терминал и непрерывный мониторинг отдельных животных.
Ниже мы предоставляем подробное описание этапов обнаружения ИФН γ клеточного ответа в морских свинок pDNA вакцины. Мы изложить наши процедуры доставки и описать общие ELISpot assay, охватывающих проб крови, анализ крови, КСДОР урожай, процедура анализа и анализа данных. Схема ELISpot assay изображен на рисунке 1.
Рисунок 1 : Схематичный обзор свинки протокол ELISpot. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Морской свинки является ценным животных модель развития доклинических вакцин и внутрикожное введение стратегий. Вышеупомянутый Протокол описывает методологию для оценки реакции антиген специфические Т-клеток в этой весьма актуальны модели. Assay обеспечивает четкое перечисление периферийных устройств T-клетки, вырабатывающие интерферона-гамма при стимуляции с пептидами антиген специфические. Кинетика иммунного ответа может контролироваться забора крови-терминал.
Мы оптимизированный протокол и определили важнейшие аспекты для получения оптимальных результатов, используя этот assay. Например образование тромбов в коллекции трубки приведет к неоптимальной КСДОР восстановления и жизнеспособности. Морская свинка тромбов очень быстро18. Важно быстро выполнить розыгрыш крови. Au-камень et al. обеспечивают полное руководство для кровотечение методов в модели свинка16. Поскольку сбор крови требует общей анестезии, рекомендуется рассмотреть применимые стандартные оперативные процедуры этого аспекта процедуры19. Недостаточно анестезированные морских свинок будет реагировать, перемещая их ноги или вокализация после краткого щепотка ткани между пальцами с ваши ногти или дрогнув свои уши и поступательного продвижения их усы после щипать их уха. Немедленную передачу крови в трубку с антикоагулянтами и перемешать тщательно путем прокатки или инвертирование трубке несколько раз является важным шагом в этом протоколе. Здесь описывается протокол ЭДТА трубы были использованы, и без других антикоагулянты были протестированы. Пожалуйста, обратите внимание, что ЭДТА гипертонический, трубы должны идеально быть заполнены более чем наполовину и поэтому соответствующие трубы размер объем образца должны быть использованы.
Когда выполнена правильно, плотность градиентного центрифугирования неизменно приводит к чистой КСДОР подготовки. Средний градиент плотности должны быть при комнатной температуре, когда слои градиента перед центрифугированием, а тормоза не должны использоваться для остановки центрифуги при использовании регулярных трубы. Значительное улучшение с точки зрения практичности КСДОР-обработки было сочетание градиентного центрифугирования плотности с устройствами КСДОР изоляции. Это позволяет сократить время центрифугирования. Плотность градиентного центрифугирования в устройствах КСДОР изоляции и результаты регулярных трубы в аналогичных жизнеспособности, живой клетки подсчитывает обработанных репликацию, и пятно формирования. Независимо от типа труб, используемых для разделения, урожай Баффи пальто должны следовать сразу. Течение длительного периода времени контакта с средний градиент плотности цитотоксических для получения.
Точный подсчет жизнеспособных получения имеет важное значение для семян последовательно равное количество клеток в Пробирной тарелка скважин. Некоторые метод жить/мертвые дискриминации должны применяться. В нашей лаборатории мы используем Трипановый синий исключения пробирного и автоматизированных-счетчик соматических клеток.
Пятно качества, определяется как острые и высокой противопоставляется пятна, приведет к повышается точность и последовательное пятно подсчета голосов, особенно при использовании автоматизированной системы подсчета голосов. В соответствии с рекомендациями изготовителя мы наблюдали этанола до лечения ELISpot плит, чтобы стать решающим шагом уменьшить количество пятен фоновый и улучшить определение пятна. Настоятельно рекомендуется использовать пластину читателя образ ELISpot assay пластин в конце протокола. Оригинальные образы каждой скважины может быть легко и эффективно получены и хранятся. Использование изображений программное обеспечение для анализа цифровых изображений также позволяют для объективного анализа и пятно подсчета голосов по сравнению с ручной подсчет отдельными операторами.
Абсолютная необходимость для развития assay, описанные здесь был поколения подходящие анти свинки интерферона гамма антитела пара. Моноклональные антитела мыши V-E4 и N-G3 были разработаны путем гибридомной техника с клонами B-клетки от мышей, которые были сделаны прививки с рекомбинантным свинки интерферона гамма20. Сообщается, что V-Е4, которая изотипа IgG1, и N-G3, который IgG2a, связать оба антигена рекомбинантных и родной. Присвоение V-E4 как захват антитела и биотинилированным N-G3 как обнаружение антител привели к высокой чувствительности для рекомбинантных и родной белка при сохранении низких фонового сигнала в формате сэндвич ELISA. Обе антитела доступны для научного сообщества через производственные соглашения, во главе с лабораторией доктор Хьюберт Шефер, который является соавтором данного издания. Запросы будут получены лабораторией доктор Шефер и затем производимых коммерческим партнером.
Сообщается, что интерферон гамма быть неустойчивым в обычных буферов или СМИ21. Шефер 20 et al. сообщили лишь умеренное снижение темпов восстановления, при использовании деградировавших ИФН y, которая потеряла биологических функций, в формате ELISA, с использованием антител V-E4 и N-G3. Однако увеличивая время инкубации пептид стимулирования получения более 18 h должны тщательно проверяться.
Преимущества использования получения был обсужден. Однако здесь описано assay отражает только отзывы антиген специфические циркулирующих Т-клеток в периферии. Проникают в ткани Т-клетки или клетки изолированы от лимфатических органов, например, селезенке и лимфатических узлах, могут демонстрировать различные свойства22,23,24. Никаких существенных различий в клеточных реакций были замечены на сравнение интерферона гамма пятна от получения и splenocytes от морских свинок, которые были сделаны прививки с же pNP гриппа вакцины14.
В этом протоколе мы описали процедуру внутрикожные вакцинации. Главным обоснованием ID иммунизации является ориентация высокой плотности дендритных клеток в коже25. Мы и другие показали, что эти клетки могут быть конкретно адаптации метод доставки26, формулировка27или28наркотиков дизайн. Активированные профессиональный антиген представляющих клеток может перейти на Дренажный лимфатический узел и активировать адаптивной иммунной системы29,30,,3132. Дендритные клетки являются клетки тип представления основных антигена для грунтования продуктивной сотовых иммунных реакций.
Для этого исследования, которые были сделаны прививки животных с плазмидной ДНК кодирования Нуклеопротеиды гриппа H1N1 штамма A/PuertoRico/8. Кожи доставки этой вакцины pDNA (pNP) в сочетании с электропорации было показано, чтобы выявить антиген специфические гуморальные ответы в морских свинок33, хорьки и нечеловеческих приматов (Евросоюзе)1,34. Кроме того эта вакцина вызвала надежные ответы Т-клеток мышей после доставки в эпидермис35, которая может объясняться CD4 и CD8 Т-клеток, стимулируя с пептидами, представляющих конкретные epitopes для популяции этих клеток. Иммуногенность после слизистой доставки, как продемонстрировано поколения гуморальные ответы в кроликов и морских свинок, а также клеточного и гуморального ответы в мышей36pNP вакцины. Совсем недавно наша группа смогла продемонстрировать поколения ИФН γT-клеток ответов в кролика после межмышечная доставки (неопубликованные данные).
В настоящее время наблюдаемых пятен интерферона гамма в морской свинки ELISpot не могут выделяться подмножества CD4 + и CD8 + Т-клеток. Специально для проектирования и разработки иммунной терапии, ориентация на кожу было бы очень полезно определить ли наблюдаемые интерферона гамма пятно частоты вызваны расширением одного конкретного подмножества или сбалансированный ответ как для того чтобы Оцените эффективность вакцинации вызвать кросс презентация. Это ограничение можно преодолеть отрицательное сортировки клеток CD4 и CD8 до заполнения ячеек на плите или идентификации MHC класса II (CD4 ответы) или MHC класса I (для ответов CD8) ограничено epitopes.
Здесь описаны интерферона гамма ELISpot assay с использованием морской свинки получения устраняет необходимость оценки курс клеточных реакций в модели Лаборатория морской свинки. Это будет совершенствовать разработку вакцин и кожи протоколы доставки. Мы считаем, что она позволяет для трудоустройства этой соответствующих животных модели изучения заболеваний с важными компонентами Т-клеток как ТБ37, Эбола38,39HSV и другие. Это позволит сократить использование менее соответствующих животных моделей.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить членов Inovio фармацевтической R & D Департамента по оказанию технической помощи и сотрудников Acculab для обслуживания животноводства передового опыта. В частности мы хотели бы поблагодарить Алиша Vu и Джо Агнес для корректуры рукопись. Эта работа финансировалась не каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.
Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
22µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22µm Filter |
KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |