Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda DNA-prover från mat och miljö microbiomes för samordnade upptäckt och subtypning av Salmonella genom quasimetagenomic-sekvensering. Den kombinerade användningen av kultur berikning, immunmagnetisk separation (IMS) och flera deplacement amplifiering (MDA) tillåter effektiv koncentration av Salmonella genomisk DNA från livsmedels- och miljöprov.
Abstract
Quasi-metagenomik sekvensering avser sekvensering-baserad analys av modifierade microbiomes av mat och miljöprover. I detta protokoll syftar mikrobiomet ändring till att koncentrera genomiskt DNA av en target livsmedelsburna patogener förorening att underlätta upptäckten och subtypning av patogenet i ett enda arbetsflöde. Här, vi förklara och demonstrera provberedningssteg för quasi-metagenomik analys av Salmonella enterica från representativa mat och miljöprover inklusive alfalfagroddar, mald svartpeppar, mald nöt, kyckling bröst och miljömässiga kompresser. Prover först utsätts för kultur anrikningen av Salmonella för en förkortad och justerbar varaktighet (4 – 24 h). Salmonella celler fångas sedan selektivt från anrikning kulturen av immunmagnetisk separation (IMS). Slutligen utförs flera deplacement amplifiering (MDA) för att förstärka DNA från IMS-tagna celler. DNA utdata i detta protokoll kan sekvenseras av hög genomströmning sekvensering plattformar. En valfri kvantitativa PCR analys kan utföras för att ersätta sekvensering för Salmonella upptäckt eller bedöma koncentrationen av Salmonella DNA innan sekvensering.
Introduction
Metagenomik sekvensering kan teoretiskt samordnade upptäckt och subtypning av livsmedelsburna patogener. Men presenterar mat prover utmaningar till patogen analysen av sekvensering av den mat mikrobiomet. Först, livsmedelsburna patogener är ofta närvarande på låga nivåer i mat prover. De flesta kommersiellt tillgängliga snabb upptäckt metoder fortfarande kräva 8 – 48 h odling för att berika patogen celler till en detekterbar nivå1. För det andra, många livsmedel innehåller riklig mikroflora celler eller mat DNA, att göra livsmedelsburna patogener DNA en bråkdel av mat metagenome och ett gäckande mål för upptäckt och subtypning av direkt gjorts sekvensering.
Ändring av mat microbiomes har rapporterats att möjliggöra betydande koncentration av livsmedelsburna patogener DNA att underlätta sekvensering-baserad detektion av Shiga toxinproducerande Escherichia coli2,3 och Salmonella enterica4. Eftersom modifierade livsmedel microbiomes fortfarande blandningar av olika mikrobiella arter, deras sekvensering är betecknas som quasi-gjorts analys4. Mikrobiomet modifiering kan utföras genom kultur anrikning ensam2,3 eller i kombination med immunmagnetisk separation (IMS) och flera deplacement amplifiering (MDA)4,5. IMS kan selektivt fånga patogen celler från berikande kultur via antikroppsbelagda magnetiska pärlor. MDA kan generera tillräckliga mängder genomiskt DNA för sekvensering genom högeffektiva ɸ29 DNA-polymeras6. IMS-MDA har tillåtit från kliniska prover7, och förkortning av kultur berikning för quasi-gjorts upptäckt och subtypning av Salmonella i livsmedel prover4upptäckt av kultur-oberoende patogen.
Det övergripande målet med denna metod är att förbereda quasi-metagenomic DNA från mat prover att möjliggöra riktade koncentrationen av Salmonella genomiskt DNA och efterföljande detektion och subtypning av det främmande ämnet på Salmonella av sekvensering. Jämfört med standardmetoder för Salmonella upptäckt8,9 och subtypning10, kan metoden quasimetagenomic väsentligen förkorta handläggningstiden från förorenad mat och miljöprover till molekylära subtyper av patogener genom att förena två vanligtvis separeras analyser i ett enda arbetsflöde. Denna metod är särskilt användbar för applikationer såsom livsmedelsburna utbrott svar och andra spår tillbaka utredningar där robust patogen subtypning krävs förutom upptäckt av patogen och snabba analytiska vändning är viktigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
Obs: Mat prover är förberedda för före berikning enligt mikrobiologi laboratorium guidebok (MLG) av U.S. avdelning av jordbruk livsmedelssäkerhet och Inspection Service (USDA-FSIS)11 och bakteriologiska analytiska handbok (BAM) av US Food och Drug Administration (FDA)12.
- Aseptiskt placera en 25 g portion av mat provet såsom svartpeppar, kycklingbröst, köttfärs, och alfalfagroddar eller en miljö pinnen i en påse med steril laboratorium i mixer med inbyggda filter. Förbereda en miljömässig pinnen genom att aseptiskt Fukta en svamp med anrikningsbuljong (Rappaport-Vassiliadis, RV). Sedan dra pinnen över hela ytan eller förutbestämt område och placera det i en påse med laboratorium i mixer.
Figur 1: representativa mat och miljöprover för quasi-metagenomik upptäckt och subtypning av Salmonella. Prover är placerade i sterila filter stomacher väskor tillsammans med RV buljong. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Grundligt blanda varje 25 g prov med 225 mL RV anrikning buljong med en laboratorium mixer eller hand massage för 30 s.
Obs: Varianter av RV buljong som rekommenderas av MLG och BAM kan användas beroende på provtyper. - Inkubera provet-anrikningsbuljong blandningen i ett laboratorium inkubator vid 42 ° C för 4 – 24 h.
- Efter inkubation, samla ett 50 mL delprov anrikningsbuljong från den filtrerade sidan av påsen i en separat 50 mL centrifugrör.
- Centrifugera röret vid 100 x g i 10 min bort fast skräp i Homogenatet.
- Återställa supernatanten noggrant för att en ny 50 mL Centrifugera röret och centrifugera rören vid 3 000 – 6 000 x g i 10 min att återställa cellpelleten.
- (Valfritt) Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten av resuspension i 5 mL av buffrad pepton vatten (BPW) och centrifugera rören vid 3 000 – 6 000 × g i 10 min.
Obs: BPW kan utarbetas av upplösning 10 g pepton, 5 g natrium klorid, 3.5 g av dinatrium-fosfat, och 1,5 g monokaliumfosfat fosfat till 1 L med destillerat vatten. Slutligt pH justeras till 7,2 ± 0,2 vid 25 ° C. Autoklav vid 121 ° c under 15 min. kommersiellt tillgängliga BPW kan också användas. - Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 5 mL BPW.
2. immunmagnetisk Separation (IMS) och flera deplacement amplifiering (MDA)
Obs: För att förhindra korskontamination mellan prover, arbeta i en biosäkerhet skåp, ändra pipettspetsar för varje tub, Undvik att vidröra röret med pipetten och placera inte rör nära varandra i magnetisk stå under tvätt steg.
- Tina prov bufferten och reaktion bufferten från MDA kit på is eller vid 4 ° C i förväg.
- Blanda 1 mL åter svävande cell pellets i BPW med 20 μL av anti -Salmonella pärlor i 1,5 mL mikrocentrifugrör och placera den på den roterande mixern för 30 min i rumstemperatur.
Obs: Konkurrenskraftiga flora, fett partiklar och proteiner i den återsuspenderade pelleten kan störa IMS. Utspädning av nytt svävande cellpelleten i BPW är bra att minska förlusten av pärla -Salmonella komplexen från magnetiska stativet under tvätt steg. - Sätt in rören i magnetiska stativet och tillåta 3 min för en tillfredsställande återvinning av pärlor genom att invertera racket flera gånger att koncentrera pärlor i en pellet på sidan av röret.
- Hålla rören på magnetiska stativet. Aspirera och kasta bort supernatanten från varje rör, liksom återstående vätskan i varje rörets cap.
Obs: Var noga med att inte störa pelleten av IMS pärlor på sidoväggen av röret mot magneten. - Ta bort röret korthållaren från magnetiska stativet och tillsätt 1 mL av tvättbuffert (PBS som innehåller 0,05% (v/v) polysorbat 20) och Invertera flera gånger för att ta bort icke-specifikt bindande bakterier från anläggningen.
- Upprepa steg 2,3 – 2,5 gånger.
- Efter 3rd tvätten, utför den slutliga magnetisk separering av pärlor genom att upprepa steg 2,3 – 2.4. Ta bort rören från magnetiska rack och placera dem i en microfuge för 1 s att snurra ner pärlor. Sedan placera rören i magnetiska rack för 3 min innan du tar bort eventuella resterande tvättbuffert.
- Återsuspendering pärla -Salmonella komplexen i 9 μl prov buffert och inkubera vid 95 ° C under 3 min för denaturering.
- Efter kylning på 4 ° C på is, kombinera med 9 μL av reaktion buffert plus 1 μL av enzymet blanda och hålla på is.
- I en termocykel, inkubera rören vid 30 ° C i 2 h för amplifiering, följt av värme vid 65 ° C i 10 min för att inaktivera det enzym- och cool till 4 ° C på is.
- Bedöma kvantitet och kvalitet av MDA produkter genom att mäta DNA-koncentration och renhet (260/280 baserat > 1,8) på ett fluorospectrometer instrument.
Obs: På grund av icke-specifik bindning av IMS pärlor, genomisk DNA från organismer än Salmonella är sannolikt att vara närvarande i MDA produkter, men det påverkar inte efterföljande analys. - Lagra slutprodukterna (20 μL) vid-20 ° C fram till användning för realtids-PCR eller bibliotek förberedelse för quasimetagenomics-sekvensering.
3. realtids-PCR
Obs: Detta steg är valfritt för 1) att upptäcka Salmonella utan subtypning, och 2) att bedöma provet kvalitet före quasimetagenomics-sekvensering.
- Förbereda 18 μL PCR blandningen per prov, som innehåller Universal PCR Master Mix (10 μL), vidarebefordra primer (2 μL, 900 nM), reverse primer (2 μL, 900 nM), sond (2 μL, 250 nM), och vatten för molekylär användning (2 μL).
Obs: Salmonella-specifika oligonukleotiden primers (framåt: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, omvänd: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) och sonden var avsedda att förstärka en 94-bp sekvens inom genen ttr (GenBank anslutningen nr. AF 282268)13. - Blanda MDA produkten från steg 2.12 genom pipettering försiktigt upp och ner pärla -Salmonella komplex tillsammans med vätska för att skapa en suspension. Tillsätt 2 μL av upphängningen in 18 μl av PCR-blandning.
- Kör realtids-PCR använder en optimerad realtids PCR-protokoll, ange två innehavsperioder, en vid 50 ° C i 2 min och en annan vid 95 ° C i 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C för 15 s och 60 ° C för 60 s.
- Beräkna den tröskel cykeln (Ct), vilket är antalet cykler som krävs för fluorescensen från amplifierade DNA för att passera tröskeln linjen.
Obs: Raden tröskeln ligger i linjär fas mellan baslinjen och platå av förstärkning tomterna av prover. Negativt resultat motsvarar Ct-värden över 40 eller prover med Ct-värden som är högre än för negativ kontroll.
4. biblioteket inför Quasimetagenomic sekvensering
Obs: MDA produkterna kan sekvenseras av både kort läsa och lång läsa (nanopore) sekvensering plattformar. Använd den senaste versionen av DNA bibliotek prep kit som tillverkarna av sekvensering plattformar. Utföra DNA bibliotek beredning enligt tillverkarnas instruktioner. Använda 2D lågintensivt genomisk DNA protokollet för bibliotek förberedelse för lång-Läs sekvensering plattform5. För bibliotek förberedelse för kort-Läs sekvensering plattformen ges mindre modifieringar tillverkarens protokollet nedan.
- Följ standard bibliotek beredningsmetoder genom att fungera som buffertlösningar och reagenser till MDA produkter. Överföra 40 μl av sekvensering prepped MDA produkter till en ny platta och tillsätt 20 μL av PCR-rening pärlor till varje brunn.
- Inkubera plattan i rumstemperatur i 10 min utan att skaka.
- Tvätta pärlorna med 80% etanol och torka pärlorna i 12 min.
- Återsuspendering torkade pärlor i 53 μL av resuspension buffert och inkubera i 2 min utan att skaka.
- Späd och biljard bibliotek efter tillverkarens anvisningar.
Obs: Ett 10 pM poolade och denaturerat bibliotek är nu redo att sekvenseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före quasimetagenomic sekvensering, kan den totala kvantiteten och renhet av IMS-MDA produkter utvärderas av fluorospectrometer (tabell 1).
| Berikande tid (h) | CT-värde | Koncentration (ng/ul) | Renhetsgrad (260/280) | |
| Märke A | 4 | 24.71 | 812.91 | 1,89 |
| 8 | 25,80 | 900.36 | 1.87 | |
| 12 | 15,41 | 753.88 | 1.84 | |
| Varumärke B | 4 | 20,63 | 872.61 | 1.87 |
| 8 | 22.61 | 993.41 | 1.87 | |
| 12 | 19,08 | 954.44 | 1.87 |
Tabell 1: kvalitativ och kvantitativ bedömning av DNA prover för quasi-gjorts sekvensering. Salmonella celler var inokuleras i 25 g rå kyckling bröstfilé av två märken på 1 CFU/g. Inoculated prover var berikad i RV för 4, 8 och 12 h innan IMS-MDA.
Riktade kvantitet bedömning av Salmonella DNA kan utföras av realtids-PCR (tabell 1 och figur 2), som även fungerar som ett alternativ för Salmonella upptäckt om subtypning inte behövs.
Figur 2: Realtids-PCR för Salmonella upptäckt eller prov bedömningen för quasi-metagenomik sekvensering. Förstärkning-kurvor av realtids-PCR av Salmonella DNA i IMS-MDA produkter efter 4, 8 och 12 h berikande tid visas. Det ingår också ett prov efter endast 2 h anrikning. Salmonella celler (0,27 CFU/g) var inokulerade 25 g rå kyckling bröstfilé från två märken A och B. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Fluorospectrometer avläsningarna tillåta första utvärdering av provberedning. Koncentration av IMS-MDA produkter beredda av Salmonella smittade kycklingbröst prover varierade från 701.54 till 945.86 ng/µL, vilket tyder på att provet DNA har förstärkts. Enligt tillverkarens anvisningar är den minsta DNA prov koncentrationen för kort läsa och läsa länge sekvensering 0,2 ng/µL 1 µg, respektive. 260/280 förhållandet varierade från 1,85 till 1,88 (tabell 1), visar hög renhet av de DNA-proverna med låga nivåer av proteinet kontaminering.
Lägre Ct-värden indikerar högre koncentrationer av Salmonella genomiskt DNA i provet. Som visas i tabell 1 och figur 2, minska Ct-värden för IMS-MDA produkter som berikning ökar. I vår tidigare studie4, när Ct-värden var lägre än 25, majoriteten (> 50%) av SE genomet var sannolikt att sekvenseras och serotyp förutsägelse från raw sekvensering läsningar var framgångsrik.
Misslyckade kultur anrikning eller IMS kan resultera i en relativt hög Ct-värden indikerar låg koncentration av Salmonella genomiskt DNA i det slutliga provet som visas i figur 2. Detta kan inträffa trots en hög DNA-koncentration och renhet av IMS-MDA produkter som föreslagits av fluorospectrometer avläsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av ofta låg överflöd och i-homogen förekomsten av Salmonella i livsmedel och miljöprover, kultur anrikning före IMS-MDA är fortfarande nödvändigt för Salmonella upptäckt och subtypning; Det är därför ett viktigt steg i protokollet. För att identifiera optimala förutsättningar att öka överflödet av Salmonella i förhållande till provets bakgrund flora, kan olika anrikning media utvärderas för specifika prover. Enligt MLG och BAM, kan både selektivt medium såsom RV buljong och icke-selektivt medium såsom buffrad pepton vatten och laktos buljong användas för Salmonella berikning från mat prover. Användningen av RV vid 42 ° C har utvärderats i vår tidigare studie4 för Salmonella berikning från rå kycklingkött, isbergssallad och svartpepparkorn att stödja quasimetagenomic analys av patogenet. Enligt FDA BAM och AOAC precollaborative8,9och samverkande studier14,15rekommenderas RV för analys av hög mikrobiell och låg mikrobiell belastning livsmedel.
Optimala varaktigheten av kultur anrikning beror på flera faktorer, såsom provtyp, av Salmonella kontaminering och det fysiologiska tillståndet av det främmande ämnet på Salmonella . Till exempel när låga nivåer av Salmonella (t ex, < 1 CFU/g) celler är närvarande i ett kött prov och kyl stressad, längre berikande tid (t.ex., > 12 h) kan behövas för att återuppliva och berika Salmonella celler. Tillräcklig överflöd av Salmonella i den modifierade mikrobiomet leder till tillräckliga sekvensering täckning av Salmonella föroreningars genomet, vilken kanna tillåta stamnivå single nucleotide polymorphism (SNP) att skriva4. Kortare kultur anrikning (t.ex. mindre än 12 h) är möjligt för snabb upptäckt5 eller serotypning av Salmonella4.
Högre nivåer av salmonellakontaminering eller längre kultur anrikning av förorenad mat prover kan resultera i högre koncentrationer av Salmonella genomiskt DNA i modifierade livsmedel microbiomes, vilket leder till lägre Ct-värden från den realtids PCR-analys. CT-värdena visar en negativ korrelation med sekvensering täckning av Salmonella föroreningars genomet4, och kan därför användas för optimering och modifiering av arbetsflödet. Enligt vår erfarenhet är kultur berikning, särskilt längden på det, ofta i fokus för felsökning ansträngningar. Till exempel var Ct värdet av IMS-MDA produkten från ett raw kycklingbröst prov relativt hög på 35.94 (figur 1). Detta prov var inokuleras med 2,5 CFU/g SE celler och inkuberas i BPW vid 37 ° C under 2 h. sekvensering av detta prov inte ger tillräcklig täckning av SE genom att tillåta serotyp förutsägelse. I jämförelse, var alla andra prover med 4 h eller längre anrikning framgångsrikt serotyped från quasimetagenomic sekvensering data (data som inte visas).
Efter sekvensering rekommenderar vi använda Kraken16 för att identifiera Salmonella läser för ytterligare bioinformatik analyser. CFSAN SNP pipeline17 och SeqSero18 kan användas för SNP att skriva och serotypning förutsägelse från raw sekvensering läsningar, respektive.
Denna quasimetagenomic teknik har flera begränsningar. Först, DNA-koncentration och renhet av IMS-MDA produkter mäts av en fluorospectrometer bör endast användas som en preliminär indikator för korrekt provberedning. På grund av den höga verkningsgraden för MDA, kan spårmängder av ingående DNA amplifieras för att räcka hela genomet sekvensering19. Hög kvalitet och kvantitet DNA-prover kan därför fortfarande genereras även om kultur anrikning eller IMS underlåter att effektivt koncentrera Salmonella celler. Den valfria realtids PCR-analysen ger en mer målinriktad och informativ bedömning av hela prov förberedelse arbetsflödet. Andra, svårt-att-kultur Salmonella celler, såsom livskraftiga men nonculturable (VBNC) bakterier20, kan inte växa under kultur anrikning. Dessa celler kan därför inte identifieras med vår metod.
Sammanfattningsvis, jämfört med traditionella metoder, vår prov förberedelse metod och quasi-metogenomic sekvensering förhållningssätt kan tillåta betydande minskning av analytiska vändningen från Salmonella-kontaminerad mat och miljöprover till robust subtypning av Salmonella föroreningar. Förutom Salmonellahar denna teknik potential vara snabba och samordnade upptäckt och subtypning andra livsmedelsburna patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Mark Harrison och Gwen Hirsch av University of Georgia för vänligt att ge bakteriestam och andra stöd till denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4 °C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80 °C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80 °C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80 °C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4 °C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. , Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella. , Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018).
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
