Summary
Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.
Abstract
Spermiograms standards décrivant la qualité du sperme sont principalement basées sur les paramètres physiologiques et visuels, tels que le volume de l’éjaculat et concentration, mobilité et motilité progressive et la morphologie des spermatozoïdes et la viabilité. Cependant, aucun de ces évaluations est assez bon pour prédire la qualité de sperme. Étant donné que le maintien de la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle dépend de l’intégrité membranaire et intracellulaire fonctionnalité, évaluation de ces paramètres pourrait permettre une meilleure prédiction de la compétence de la fécondation de sperme. Nous décrivons ici trois méthodes possibles pour évaluer la qualité du sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées avec des analyses fluorescence microscopie ou écoulement cytometry. Analyses a évalué l’intégrité de la membrane plasmique avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’iodure de propidium (PI), intégrité de la membrane acrosomique utilisant conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine agglutinine de Pisum sativum (FITC-PSA) et intégrité de la membrane mitochondriale à l’aide de 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1). Combinaisons de ces méthodes sont également présentées. Par exemple, utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique). Nous croyons que ces méthodes, qui reposent sur l’examen des membranes de spermatozoïde, sont très utiles pour l’évaluation de la qualité du sperme.
Introduction
L’intégrité et la fonctionnalité des membranes des spermatozoïdes sont quelques-uns des facteurs indiquant la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle. La membrane plasmique agit comme une barrière entre les compartiments intracellulaires et extracellulaires, préservant ainsi l' équilibre osmotique cellulaire1. Tout stress qui provoque des dommages à l’intégrité de la membrane plasmique pourrait nuire à l’homéostasie, réduire la capacité de viabilité et de la fertilisation et augmenter la mort cellulaire. Par exemple, cryoconservation réduit la viabilité de sperme la dommages à sa membrane plasmique, par suite de changements de température et de stress osmotique2. Nous avons déjà indiqué que l’exposant de sperme de taureau à de faibles concentrations de contaminants d’origine alimentaire tels que l’atrazine de pesticides, son principal métabolite diaminochlorotriazine ou l’aflatoxine mycotoxine B1, réduit sperme viabilité1,3 . Cela a été déterminé par marquage de l’ADN double-brin au DAPI en combinaison avec PI, qui se lie à l’ADN des cellules avec une membrane plasmique endommagée.
Réaction de l’acrosome (AR) implique la fusion de la membrane de l’acrosome externe et la membrane plasmique sus-jacente, aboutissant à la libération d’enzymes acrosomique4,5. Voici les événements essentiels pour pellucide pénétration et plus loin la fusion du spermatozoïde avec l' ovocyte6. En conséquence, l’évaluation de l’intégrité membranaire acrosomique constitue un paramètre utile pour évaluer la qualité du sperme et la fertilité masculine7,8,9. Plusieurs techniques de fluorescence sont appropriés pour la vérification de l’intégrité de l’acrosome, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Dans nos études précédentes, en utilisant les patrons de PSA FITC coloration1,3, nous fournit des définitions précises de (i) acrosome intact, (ii) endommagé la membrane de l’acrosome et (iii) a réagi acrosome. Dans le présent rapport, nous évaluer l’état d’acrosome cytométrie dédiés au sperme et comparer les résultats à ceux utilisant la microscopie à fluorescence.
Les mitochondries sont des organites multifonctionnels impliqué dans, entre autres choses, ATP synthèse, production d’espèces oxygénées radicalaires, signalisation calcique et l’apoptose. Des dysfonctionnements physiologiques, y compris la stérilité masculine et féminine, sont associés à l’altération de la fonction mitochondriale11. Mitochondries du sperme sont disposées dans la pièce et jouent un rôle crucial dans la motilité de sperme12. Il est bien reconnu que haut potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) est associé à la motilité normale et fertilisation haute capacité13. En revanche, ΔΨm faible est associé à un niveau élevé d’espèces réactives de l’oxygène et réduit le taux de fécondation14. Néanmoins, divers composés environnementaux, par exemple de perturbateurs endocriniens, peuvent provoquer le stress cellulaire et conduisent à une augmentation transitoire de la ΔΨm, hyperpolarisation1,3, augmentation de la production de radicaux libres et, éventuellement, 15de l’apoptose. La sonde fluorescente 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1) permet d’examiner par exemple, les effets des toxines d’origine alimentaire sur sperme ΔΨm1,3.
Spermiograms standards, en fonction des paramètres physiologiques et morphologiques, ne sont pas assez bons pour prédire la qualité de sperme. Des méthodes plus précises sont nécessaires pour assurer la qualité du sperme. Ici, nous fournissent deux méthodes possibles pour déterminer la qualité du sperme fondée sur des évaluations des membranes des spermatozoïdes : coloration quadruple simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques et la microscopie de fluorescence, décrit dans nos études1,3 et cytométrie en flux de sperme-dédiée avancée, utilisées récemment dans notre laboratoire et déjà utilisé par d’autres16,17,18.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives israélien 1994 pour le bien-être animal. Sperme bovin a été fourni par la compagnie israélienne commerciale pour élevage et d’insémination artificielle. Les éjaculats de 11 taureaux ont été évalués dans cette étude.
1. préparation de l’échantillon de sperme
Remarque : La procédure est issue protocole1,3 du laboratoire Roth.
- Obtenir environ 1 à 6 mL de sperme de taureau dans un tube de 15 mL à température ambiante.
- À chaque 1 mL de sperme, ajouter 6 mL de tampon NKM préchauffée (à 37 ° C) (110 mM NaCl, KCl, 5 mM 20 mM MOPS [3-N-morphilino sulfonique ; pH 7,4]) et centrifuger à 8 min à 600 g, 1 à 2 fois jusqu'à ce que le liquide surnageant est clair.
Remarque : Si la concentration des spermatozoïdes ou le volume initial est très élevé, divisé en deux tubes au premier lavage. - Immédiatement, retirer et jeter le surnageant clair et laisser environ 1 cm du surnageant au-dessus du culot.
- Soigneusement se pencher les tubes selon un angle de 30° pour augmenter la surface des spermatozoïdes à nager vers le haut et attendez 20 à 30 min pour permettre des spermatozoïdes à nager vers le haut à 37 ° C.
Remarque : Turbidité peut être vu. - Aide d’une micropipette soigneusement, enlever le haut 1 mL du surnageant contenant les spermatozoïdes dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Garder le sperme à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
Remarque : Une chambre de comptage différente peut être utilisée à la place, mais le décompte est différent.- Pour éviter tout mouvement de spermatozoïde, diluer 100 µL des spermatozoïdes motiles avec 10 mL d’eau bidistillée (DDW) (dilution 1 : 100) dans un tube de 15 mL et mélanger doucement.
- Charger 10 µL de l’échantillon de chaque côté de l’hémocytomètre et lamelle. Veillez à éviter la formation de bulles à l’intérieur de la chambre car cela peut entraîner une numération des spermatozoïdes inexactes.
- Observer au microscope composé avec un objectif 20 X.
Remarque : La grille complète sur un hémocytomètre contient 9 grands carrés, chacun de 1 mm2, et la lamelle repose 0,1 mm au-dessus du sol de la chambre. Ainsi, le volume au-dessus de la zone centrale de comptage est de 0,1 mm3 ou 0.1 µL. La zone centrale de l’hémocytomètre contient 25 places moyennes et chaque carré moyen a 16 carrés plus petits avec des lignes simples. - Compter le nombre total de cellules 4 places d’angle moyen et la place centrale. Pour une plus grande précision, compter deux chambres (les deux côtés de l’hémocytomètre Neubauer) et la moyenne permet de calculer la concentration cellulaire.
- Calculer le nombre de spermatozoïdes en multipliant le nombre moyen obtenu par 5 (pour obtenir le nombre de cellules par zone de comptage) et par 10 000 (pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL d’échantillon dilué). Alors, multipliez le nombre obtenu par le facteur de dilution (1/100).
Remarque : Par exemple, un nombre moyen de spermatozoïdes comptés dans 5 des 25 places moyennes dans la zone centrale de comptage de deux chambres est 150 ([152 + 148] / 2). Ainsi, le nombre moyen de spermatozoïdes par chambre (ou par 0,1 µL) est de 150 x 5 = 750. Multipliez les 750 par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL de l’échantillon dilué (7 500 000) et puis multiplier par 100 (facteur de dilution) afin d’obtenir 75 x 107 cellules / mL d’échantillon de sperme original.
2. technique #1 : Évaluation simultanée des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de multiples Fluorescent sondes
Remarque : Des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) ont été évaluées comme décrit par Celeghini et al.10, avec quelques modifications. La microscopie épifluorescente servait, combiné avec un appareil photo numérique avec excitation à 450-490 nm et d’émission à 515-565 nm en utilisant un filtre triple.
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Préparer les solutions.
- Préparer à 0,1 mg/mL solution DAPI en dissolvant 5 mg de DAPI dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 10 µg/mL).
- Préparer 1 mg/mL solution FITC – PSA en dissolvant 1 mg de FITC – PSA dans 1 mL de PBS. Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 100 µg/mL).
- Préparer 1 mg/mL JC-1 solution en dissolvant 1 mg de JC-1 dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec le DMSO à 01:10 (solution de travail ; 0,1 mg/mL).
- Préparer la solution mère de PI en dissolvant 10 mg de PI dans 400 µL de PBS (soit 2,5 mg/mL). Conserver à + 4 ° C. Diluer stock 1 avec du PBS à 01:20 (solution de travail ; 0,125 mg/mL). Conserver à + 4 ° C comme une solution-mère.
ATTENTION : PI est un potentiel mutagène et doit être manipulé avec soin. Le colorant doit être éliminé en toute sécurité et conformément aux réglementations locales applicables.
- Transférer 133 µL des spermatozoïdes motiles (étape 1.5) dans un nouveau tube de 1,5 mL (25 x 106 spermatozoïdes/mL).
Remarque : Si la concentration de l’échantillon est plus élevée, le diluer dans le tampon NKM à obtenir la concentration requise ; Si la concentration de l’échantillon de la natation, l’échantillon est inférieure, centrifuger le surnageant obtenu après avoir nagé vers le haut à 1 000 x g pendant 5 min, prélever 0,5 mL du surnageant et compter les spermatozoïdes à nouveau. - Ajouter 17 µL de DAPI (solution de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Au culot, ajouter 100 µL de tampon NKM.
- Ajouter 50 µL de FITC – PSA, 2 µL de JC-1 et 3 µL de PI (solutions de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
- Au culot, ajouter 40 µL de tampon de NKM et remettre en suspension par pipetage.
- Transférer 10 µL de l’échantillon à une lame de verre, le frottis et la lamelle couvre-objet.
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Visualiser immédiatement par microscopie à épifluorescence (utilisation 40 x objectif) avec un triple filtre, équipé d’un appareil photo numérique et de capturer une image séparément pour chaque filtre.
Remarque : Il n’y a pas d’importance à l’ordre des filtres visualisé.- Visualiser sous canal DAPI avec excitation à 358 nm et d’émission à 461 nm.
- Visualiser sous canal FITC de monomères verts avec excitation à 450 – 490 nm et d’émission à 515 – 565 nm.
- Visualiser sous canal PI pour les agrégats rouges avec excitation à 488 nm et d’émission à 590 nm.
- Visualiser sous JC-1 rouges agrégats avec excitation à 559 nm et d’émission de l’ordre de 574 – 627 nm ; JC-1 verts monomères avec excitation à 488 nm et d’émission de l’ordre de 500 – 535 nm.
- Fusionner les trois images provenant des filtres au format JPG/JPEG, à l’aide de l’option de « fusion » du logiciel de la caméra.
- Ouvrez l’image fusionnée avec l’outil « Paint » et utilisez l’option de la brosse pour marquer les spermatozoïdes comptés.
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Classer les spermatozoïdes basées sur la fluorescence émise par chaque sonde :
- Évaluer en général au moins 200 spermatozoïdes par lame — toutes les cellules apparaissent en bleus (DAPI).
- Évaluer la viabilité en comptant les cellules mortes, qui apparaissent pourpre (PI [rouge] + DAPI [bleu]) et de calculer le pourcentage de cellules mortes (dead cellules/total compté cellules x 100).
- Évaluer le statut d’acrosome en utilisant les patrons de coloration fluorescente (FITC – PSA). Calculer les pourcentages des différents modèles (x 100 des cellules intactes, endommagés ou réagie acrosome cellules/total compté).
Remarque : Membrane acrosomique endommagé apparaît comme un capuchon acrosome entièrement tachée, vert ; réaction acrosomique membrane montre résiduelle vert équatoriale ou supérieure de coloration ; cellules contenant une membrane acrosomique intacte n’affichera aucune coloration verte de la région acrosomique. - Évaluer les ΔΨm en distinguant les spermatozoïdes avec ΔΨm élevé, qui présentent une pièce colorées au rouge et avec ΔΨm faible, les spermatozoïdes qui présentent une coloration vert bien. Compter les rouge et vert midpieces séparément et calculer leur ratio (rouge/vert).
3. technique #2 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes avec les Kits prêts à l’emploi et de la cytométrie en flux
Remarque : Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique, intégrité acrosomique et potentiels de membrane membrane mitochondriale a été réalisée avec les kits de cytométrie en flux de prêts à l’emploi contenant des fluorochromes lyophilisées dans chaque puits. La procédure s’est déroulée selon les fabricants avec quelques modifications.
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Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique
- Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de viabilité et de la concentration (PI et SYbr14), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
- Ajouter 199 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.
- Ajouter 1 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (57 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
- Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
- Incuber pendant 10 min à 37 ° C, abri de la lumière.
- Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec la « viabilité » de réglage.
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Potentiel de membrane mitochondrial
- Prendre le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de l’activité mitochondriale (JC-1), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
- Ajouter 10 µL d’éthanol absolu / puits et Pipeter pour remettre en suspension de la poudre présente dans le puits.
- Ajouter 190 µL de PBS / puits et homogénéiser par pipetage.
- Ajouter 0.75 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (50 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
- Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
- Incuber 30 min à 37 ° C, abri de la lumière.
- Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec l’activité d’établissement de ʽmitochondrial'.
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Intégrité de la membrane acrosomique
Remarque : FITC – PSA coloration (voir Technique #1) permet l’évaluation des 3 catégories de l’acrosome (acrosome intact, acrosome réagie et acrosome endommagé). Utilisant le cytomètre en flux et la viabilité & la trousse d’intégrité acrosome (PI et FITC – ANP), les spermatozoïdes sont séparés dans ces 3 catégories.- Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit intégrité viabilité & acrosome, transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
- Ajouter 200 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.
- Ajouter 0,7 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (40 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
- Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
- Incuber pendant 45 min à 37 ° C, abri de la lumière.
- Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec le paramètre ʽInCyte'.
- Analyser l’histogramme résultant en bloquant les trois zones de marqueur selon l’intensité de la fluorescence, soit négligeables, faible fluorescence des cellules avec acrosome intact, sans coloration (R1), faible fluorescence cellules avec résiduel teinté partie de l’acrosome (R2) et cellules hautement fluorescentes avec acrosome perturbé (R3).
Remarque : Utilisez la section « analyse des fichiers acquis à l’aide d’autres modules » dans le guide utilisateur de l’instrument afin de créer les trois régions (R1, R2, R3).
4. technique #3 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de sondes fluorescentes et cytométrie en flux
Remarque : Utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique).
- Préparer 1 x annexine tampon de liaison V de 20 x solution mère (dilué 500 µL de tampon de liaison V 20 x solution-mère dont 9,5 mL d’eau distillée stérile d’annexine).
- Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer tel que décrit dans la section 1.7.
- Lavez 106 spermatozoïdes dans 1 mL de 1 x annexine V fixation tampon et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant complètement.
- Resuspendre le culot dans 100 µL de 1 x annexine tampon de liaison V.
- Ajouter 10 µL de l’annexin V conjugué à l’ITCF.
- Bien mélanger et laisser incuber pendant 15 min à l’obscurité à température ambiante.
- Laver les spermatozoïdes en ajoutant 1 mL de 1 x annexin V fixation tampon par 106 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant complètement.
- Resuspendre le culot dans 500 µL de 1 x annexin V fixation tampon par 106 cellules total.
- Ajouter 1 µg/mL PI immédiatement avant l’analyse avec un cytomètre en flux.
- Exécuter l’exemple à travers le cytomètre situé sur ʽInCyte'.
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Representative Results
Figure 1 montre fluorimétrique simultanée évaluation des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) à l’aide de PI, DAPI, FITC-PSA et JC-1. Évaluation des membranes des spermatozoïdes à l’aide de coloration simultanée avec quatre sondes fluorescentes permet, par exemple, évaluer la proportion de spermatozoïdes dans chaque catégorie — vivre vs morts ; élevé par rapport à faible ΔΨm ; intact vs. endommagé acrosome — simultanément pour chaque spermatozoïde.
La figure 2 présente les résultats de sperme évaluation de membrane à l’aide de sondes fluorimétrique. Seulement le sperme contenant au moins 80 % de spermatozoïdes ont été utilisées pour l’expérience. Au moins 200 cellules ont été examinés par le taureau. Il a été possible d’évaluer les différences de qualité d’échantillon de sperme sur le plan de l’intégrité membranaire. Par exemple, le sperme de taureau n ° 7 avait un pourcentage relativement faible de cellules mortes, une faible proportion des spermatozoïdes avec pseudo réagi acrosome et potentiel, par rapport à l’éjaculat de taureau n ° 1 de membrane mitochondrial plus élevée.
La figure 3 montre les échantillons représentatifs évaluées pour viabilité (Figure 3 a–3C) et de l’activité mitochondriale (Figure 3D–3F). Les intensités de fluorescence des échantillons ont été évaluées par un dédié microcapillaire sperme cytomètre, avec un logiciel dédié. Ce cytomètre de flux contient un laser bleu de la phase solide (448 nm) et les deux photodiodes : transmettre la dispersion et diffusion latérale. Il mesure précisément les propriétés d’émission de sperme avec trois tubes photomultiplicateurs (vert : 525/30 nm, jaune : 583/26 nm ; rouge : 655/50 nm) et peut accueillir les filtres et les répartiteurs optiques16. Il permet l’évaluation des 5 000 spermatozoïdes par analyse.
Le kit d’évaluation de viabilité contient une sonde avec perméabilité différentielle viable (membrane plasmique intacte) et de spermatozoïdes morts (membrane de plasma endommagée) (Figure 3). ΔΨm de sperme a été évaluée à l’aide d’un kit qui fait la distinction entre polarisation membranaire mitochondriale (fluorescence apparaissant en orange) et dépolarisé la membrane mitochondriale (fluorescence apparaissant en vert) (Figure 3F).
La figure 4 présente une évaluation de l’intégrité d’acrosome réalisée avec le kit prêt-à-utiliser, lire avec la cytométrie en flux (Figures 4 a–4C), divisant l’histogramme résultante des spermatozoïdes à déchenchements périodiques en trois zones de marqueur, représentant des cellules de fluorescence faible négligeables avec acrosome intact, sans coloration (R1), faible fluorescence des cellules avec résiduel teinté partie de l’acrosome (R2) et cellules réagissant fortement perturbé acrosome (R3).
Le tableau 1 présente une comparaison des deux techniques fluorimétrique pour évaluation des membranes des spermatozoïdes. Les mêmes échantillons de sperme de trois taureaux différents ont été évaluées pour la viabilité, potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) et l’intégrité des acrosome avec coloration quadruple simultanée ainsi que cytométrie en flux. Cette comparaison est très importante, car il montre les résultats correspondants à l’aide de chacune des deux techniques. Données ont été analysées par une analyse et test t de Student. Pas de différences statistiquement significatives ont été observées.
La figure 5 montre un échantillon représentatif, évalué pour l’apoptosis en utilisant annexin V (AV) et fluorochromes (PI) de l’iodure de propidium. Utilisation de ces deux sondes permet de distinguer entre elles les quatre schémas indiquant les cellules viables (AV-, PI-), les cellules apoptotiques précoces (AV +, PI-), les cellules apoptotiques (AV +, PI +) et des cellules nécrotiques (AV-, PI +).
Figure 1 : la photomicrographie épifluorescence des spermatozoïdes colorés simultanément avec plusieurs sondes fluorescentes. (A) simultanée de coloration avec quatre sondes PI, DAPI, FITC-PSA et JC-1) (B) Live spermatozoïde DAPI de coloration du noyau et haut potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm), colorées avec JC-1 sonde. Spermatozoïde morts (C) avec membrane de plasma endommagée teinté avec sonde PI, endommagé acrosome coloré avec sonde FITC-PSA et ΔΨm faible. (D) Live, a réagi l’acrosome spermatozoïde avec coloration équatorial résiduelle et faible ΔΨm. (E) Live, a réagi l’acrosome spermatozoïde avec une coloration résiduelle supérieure et haute ΔΨm. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : évaluation des membranes de sperme de taureau à l’aide de sondes fluorimétrique. Sperme (A) la viabilité a été déterminée avec des sondes fluorescentes 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’iodure de propidium (PI). Acrosome (B) situation a été déterminée selon les colorations FITC-PSA. La proportion de spermatozoïdes avec acrosome réagie sont présentées. (C) potentiel de membrane Mitochondrial (ΔΨm) a été évalué en utilisant avec JC-1 sonde fluorescente et présenté comme étant le rapport entre la proportion moyenne de colorées au rouge (potentiel élevé) et teinté vert sperme (faible potentiel). Données sont présentées sous forme de pourcentage des cellules hors des cellules évaluées totales. Au moins 200 spermatozoïdes ont été analysés par le taureau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : viabilité (A-C) et évaluation de fluorescence de l’activité mitochondriale (D-F) d’échantillons représentatifs mesurée par EasyCyte cytomètre. Histogrammes représentent les spermatozoïdes non vannés et spermatozoïdes de débris (A, D), fermé (B, E), distribution des spermatozoïdes viable (vert) et les cellules mortes (rouge) (C) et la distribution des spermatozoïdes à polarisée (jaune) et (dépolarisé membrane mitochondriale vert) (F). Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : évaluation de la Fluorescence de l’acrosome intégrité des échantillons représentatifs mesurée par EasyCyte cytomètre. Histogramme (A) des spermatozoïdes non vannés et débris. (B, C) Histogrammes de spermatozoïdes fermées avec évaluation de l’intégrité acrosome, réalisée avec le kit prêt-à-utiliser, lire avec réglage adapté « InCyte », divisant l’histogramme résultante de gated spermatozoïdes en trois zones de marqueur, soit négligeable, faible fluorescence des cellules avec intact, sans coloration acrosome (R1), faible fluorescence des cellules avec résiduel teinté partie de l’acrosome (R2) et les cellules hautement fluorescentes avec perturbé acrosome (R3). Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Moyenne de No de cellules | Vialbility | Potentiel de Membrane mitochondrial | Intégrité de l’acrosome | ||||||
| Viable | Morte | Dépolarisé | Polarisé | Rapport / rouge/vert | Acrosome intact | Acrosome réagie | Acrosome perturbé | ||
| Quadruple de coloration | 253 | 32,7 ± 1,53 % | 67.3 ± 1,53 % | 65,7 ± 2,25 % | 34,3 ± 2,52 % | 0,5 ± 0,06 | 37,3 % de 7,2 ± | 38,0 ± 5,7 % | 24,3 ± 3,0 % |
| Flux Cytomtery | 5 000 | 32,3 % de 2,08 ± | 67,7 ± 2,08 % | 65,0 ± 1,00 % | 35,0 ± 1,00 % | 0,5 ± 0,02 | 39,5 ± 5,7 % | 39,5 ± 6,5 % | 21,0 ± 8,0 % |
Tableau 1 : comparaison des deux techniques pour l’évaluation des membranes des spermatozoïdes fluorimétrique. Les mêmes échantillons de sperme ont été évaluées pour la viabilité, potentiel de membrane mitochondrial et l’intégrité des acrosome avec coloration quadruple simultanée et cytométrie en flux. Les données sont présentées comme moyenne proportion ± écart-type des cellules examinées, calculé pour 3 répétitions.
Figure 5 : annexine V et PI fluorescence d’un échantillon représentatif mesurée par un cytomètre. Représentent des histogrammes (A) non vanné spermatozoïdes et de débris et de distribution (B) des spermatozoïdes fermées au début apoptotiques (AV +, PI-), apoptotiques (AV +, PI +), viable (AV-, PI-) et nécrotiques (AV-, PI +) des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Fertilisation de sperme potentielle dépend de multiples facteurs reflétant sa qualité. Une forte concentration de spermatozoïdes et une forte proportion des spermatozoïdes très progressivement pourraient considérer sperme de haute qualité. Néanmoins, une telle évaluation ne prend pas en compte autres paramètres cellulaires et fonctionnelles. L’utilisation de « table » microcapillaire cytomètre de flux peut être facilement adaptée à l’évaluation des différentes structures de sperme à l’aide de sondes fluorescentes, comme indiqué précédemment par d’autres17 et démontré ci-après (Technique n ° 3). Par exemple, sperme acrosome intégrité est très importante pour l’apparition de la fécondation naturelle réussie et par conséquent, une évaluation précise du statut de l’acrosome est justifiée. Une telle évaluation peut être facilement réalisée par classification du statut d’acrosome en utilisant les modèles de fluorescent coloration (FITC-PSA, FITC-PNA, c.-à-d. Technique #1, comme décrit précédemment)1,3. En particulier, il est très important de déterminer la proportion des spermatozoïdes avec l’acrosome intacte (p. ex., pièces un acrosome colorées ou non) par rapport à ceux qui ont endommagé acrosome. En ce qui concerne le sperme de ce dernier, avec acrosome endommagé peut exposer un PAC acrosomique (i) un entièrement tachée, ce qui indique que la membrane est endommagée, ce qui permet du colorant s’écouler à travers la membrane dans la vésicule de l’acrosome ; (ii) l’acrosome-réagi les spermatozoïdes qui présentent seulement acrosome résiduel contenu, indiquant que l’AR a déjà eu lieu (c.-à-d., pseudo-AR). Il est à noter qu’une telle évaluation peut également être effectuée avec le cytomètre en flux dédié.
Le kit prêt-à-utiliser viabilité & acrosome intégrité définit les deux viabilité de sperme (viable ou mort) et de l’intégrité acrosomique (intacte ou perturbée). Ici, nous conseillons d’utiliser le cytomètre dédié pour définir les trois statuts acrosomique susmentionnés (p. ex., intact, endommagé, a réagi). Nous avons adapté la plate-forme de cytomètre de flux microcapillaire pour une évaluation plus précise, qui identifie le sperme a réagi l’acrosome (p. ex., faible fluorescence) tout en excluant de ceux qui ont perturbé acrosome (fluorescence élevée), plutôt que d’inclure les avec ceux qui ont un acrosome intact. Ce qui donne une proportion précise de sperme avec acrosome fonctionnel ou non fonctionnel. Sperme avec acrosome réagie comme membrane acrosomique perturbé ont perdu leur capacité à féconder l’ovocyte. En outre, une analyse précise pourraient jeter la lumière sur le mécanisme sous-tendant l’altération de l’acrosome, c.-à-d., endommagé membrane acrosome vs activation acrosome pseudo.
Nous avons comparé les résultats obtenus avec la Technique #1 et #2 de Technique et trouvé grande compatibilité entre eux, en particulier dans l’évaluation de la viabilité et de ΔΨm (tableau 1). L’un des principaux avantages d’utiliser le le cytomètre dédié est le grand nombre de spermatozoïdes évaluées par rapport au petit nombre de spermatozoïdes qui sont évalués dans la pratique par la microscopie en fluorescence et sondes (des milliers ou des centaines, respectivement ). En outre, cette dernière procédure est chronophage et subjectif, même lorsque effectué par un observateur expérimenté. Cytométrie en flux détecte seulement associés aux particules de fluorescence, il n’y a pas besoin de laver la sonde non liée de la solution, qui est une longue étape17. En revanche, l’évaluation fluorimétrique des membranes de sperme décrit dans Technique #1 permet une évaluation simultanée de plusieurs membranes. Nous avons été en mesure d’utiliser jusqu'à quatre sondes fluorescentes ensemble1,3.
Enfin, il est à noter que le cytomètre dédié a été développé comme un module de test ouvert, fournissant tous les outils de base pour l’analyse de données et acquisition des échantillons. La fonction d’acquisition permet de recueillir différents types d’informations auprès d’un échantillon de cellules et permet donc une adaptation pour une évaluation plus précise, comme ici pour l’index de statut et d’apoptose acrosome.
En conclusion, les méthodologies décrites dans cet article sont très utiles pour l’évaluation de la qualité du sperme. Examinant les membranes de spermatozoïde est très important pour déterminer la compétence de la fécondation de sperme.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier la société israélienne « SION » pour l’insémination artificielle et l’élevage (Hafetz Haim, Israël) pour leur aide et coopération et d’assistance avec le réglage de l’instrument et la formation de Mme Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, France).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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