我们描述了使用广域线虫跟踪平台 (wf-ntp) 的协议, 该平台能够对大量的线虫进行高通量表型表征。这些方案可用于表征突变菌株中微妙的行为变化, 或以高度可扩展的方式响应药理治疗。
线虫是生物医学研究中公认的动物模型, 广泛应用于功能基因组学和衰老研究。为了评估所研究动物的健康和健身, 人们通常依靠运动读数, 比如测量身体弯曲的数量或运动速度。这些测量通常涉及人工计数, 因此很难获得良好的统计意义, 因为时间和劳动限制往往将每个实验中的动物数量限制在25或更少。由于在调查弱表型效应时, 必须有较高的统计能力来获得可重现的结果, 并限制假阳性和阴性结果, 因此最近一直在努力开发自动化协议, 重点是增加运动检测和多参数行为分析的灵敏度.为了将检测的限度扩大到捕捉基因研究和药物发现中往往至关重要的小表型变化所需的水平, 我们在这里描述了一种技术发展, 这种技术使多达 5, 000只动物能够进行研究同时, 与手动检测相比, 测量的统计能力增加了约 1000倍, 与其他可用的自动化方法相比增加了约100倍。
大约半个世纪前 , 悉尼布伦纳引入了线虫作为研究发育和神经生物学的模型系统, 因为这种小的 ( 长 1 毫米 ) 透明的线虫很容易纵基因上和维护在实验室 1。今天,线虫被用来研究各种各样的生物过程, 包括细胞凋亡, 细胞信号转导, 细胞周期的性质, 基因调控, 代谢,老化2。此外, 细胞和组织的复杂性, 蛋白质表达模式和保存之间的疾病途径之间的线虫和更高的生物体 (80% 的蠕虫基因有一个人类的同源体), 与简单和培养的成本效益, 使其成为一种有效的体内模型生物, 适合高通量遗传3,4,5,6, 7, 8,9,10,11,12,1 3日和毒品 1 4、1 5、1 6次筛查。由于所有这些原因,线虫已被用于表征正常和疾病相关的分子途径;例如, 在神经退行性变领域, 它使人们能够探索衰老对蛋白质聚集3、4、7、15、17的影响。 18, 以及蛋白聚集的启动子和抑制剂的特性3,4,5,6,7, 14, 18岁
蠕虫的整体适应性是这类研究中定义的一个重要行为参数, 它可以通过多种方式手动测量, 例如通过计算每分钟身体弯曲次数 (bends)4,6,19, 或通过测量运动速度 20,21, 22, 以及通过测量平均寿命和瘫痪率。虽然手动测量身体弯曲和运动速度已经导致了许多重要的见解, 各种分子途径和机制3,4,14,19, 20,23, 手动检测仍然是目前的低吞吐量, 高度劳动密集型, 耗时, 同时容易出错和人类偏见。这些问题在收集数据方面提出了相当大的挑战, 有足够的统计能力来区分微妙的行为变化。这种限制与药物筛选特别相关, 因为具有潜在药物分子的治疗往往导致小的表型变化24, 因此需要对大量动物进行研究, 以获得可重现的结果。为了说明这一点, 最近的研究表明, 有必要有信心地定义行为的任何重大变化, 并限制假阳性结果 25.这使得线虫社区有强烈的动机用可重现、自动化、时间和经济高效的测量来取代手动计数。为了满足这一需求, 一些实验室最近开发了对更多的蠕虫进行高灵敏度测量和精确蠕虫跟踪的方法, 22、26、27、28 29,30, 31,32,33.
为了进一步将自动化过程扩展到具有统计意义的测量所需的大量动物, 我们最近开发了一个宽视场线虫跟踪平台 (wf-ntp)15,34 ,35,36, 它可以同时研究多个表型读数的非常大的蠕虫种群, 一个关键因素在统计相关的表型检测25。wf-ntp 目前不仅可以同时监测多达 5, 000只动物, 而且表型读数还包括多个参数, 包括身体弯曲的速率和振幅、运动速度、瘫痪人口的比例以及大小的动物。因此, 可以很容易地同时筛选数以千计的蠕虫, 并将不同的读数组合到行为地图中,以创建多维指纹36。相关的开源软件是用 python 编写的, 它也是操作它所必需的, 并且是完全可定制的。还提供了图形用户界面 (gui), 使用户能够采用此技术。
在这里, 我们提出了一系列的协议, 说明了 wf-ntp 的一些潜在应用。特别是, 我们讨论了化合物的管理, 从小分子到蛋白质疗法, 并描述了如何筛选其影响直接对大量的蠕虫, 从而有效地消除了样本小亚人口。为此目的使用 wf-ntp 已经在旨在设计阿尔茨海默氏症 (ad)15、34、35 和帕金森病 (pd) 18 的药物发现方案的程序中带来了显著的优势使用体内数据评估治疗候选 35,37。
由于光学科学领域的技术迅速扩展, 现在有可能以全新的方式满足线虫研究中对自动化方法的要求。因此, 设计了一些数字跟踪平台20、41、42、43、44、45、46台,并提供了在过去的几年里, 为了取代手动计数的参数, 如运动速度, 弯曲频率, 瘫痪率, 以及更复杂的行为形式, 如欧米茄转弯, 寿命测量。最近的自动化平台大大提高了线虫研究41的重现性和灵敏度, 并提供了关于小群甚至单个动物的高质量数据。我们决定扩大蠕虫行为分析的自动化范围, 以便也可以同时评估数千只动物群体的表型。研究蠕虫队列的方法的主要优点是, 它允许考虑蠕虫行为24 的高内在变异性, 并考虑到药物治疗研究往往导致微妙的表型变异, 这是在使用一小群动物时, 很难被发现具有足够的统计意义。高检测能力 (pod) 确实是必要的, 以自信地检测行为的任何显著变化, 并限制假阳性结果25。
在这里, 我们描述了一系列的协议, 基于最近报告的自动筛选方法的线虫, 广域线虫跟踪平台 (wf-ntp)36。这里描述的协议分为5个部分。第1部分和第2部分描述了大量蠕虫种群的制备。关键的步骤是工作条件的无菌性以及运行实验所需的试剂和板材的制备。我们注意到, 由于与其他筛选方法相比, 该议定书提供的吞吐量增加了36, 因此还需要增加试剂的数量;在实验设计中需要仔细考虑这个因素。我们还注意到, 漂白步骤至关重要, 需要提前进行测试, 因为运行这些实验需要大量的鸡蛋和健康的幼虫。本协议的第3部分详细介绍了如何在固体介质和筛网蠕虫种群中提供药物。我们注意到, 议定书的这一部分在很大程度上取决于使用者平行检测的药物数量和药物浓度。筛选过程的完全自动化和快速数据采集将限制步骤从行为观察转移到试剂制备、大型蠕虫种群的生长和同步。行为筛选过程中的关键步骤是记录的计时和任何蠕虫处理步骤 (例如, 蠕虫从 ngm 板转移到跟踪平台)。这里描述的协议是一个例子, 旨在筛选蠕虫长达9天的成人寿命;但是, 此协议可以很容易地适应屏幕尽可能多的时间点, 如, 连续 18天36天.第4部分随后说明了将蛋白质分子 (如抗体和分子伴侣) 传递到线虫中的协议的应用, 并说明了如何根据所需的需要轻松定制第1-3部分中所述的协议。应用。我们展示了如何将这一程序不仅推广到药物样分子的传递, 而且还可用于分子伴侣或抗体的管理。除非另有说明, 前四个步骤 (部分) 是在无菌条件下进行的。所有液体成分在使用前都应高压灭菌, 孵育步骤应在70% 的相对湿度下进行。在第5部分中, 我们将介绍如何使用与跟踪阶段相结合提供的软件包。该软件是为分析与大型蠕虫种群行为相关的 wf-ntp 数据而定制设计的。我们建议用户遵循第5部分中提供的数据分析指南;但是, 这些参数取决于录制的视频的特定功能 (即 fps、视场、视频分辨率、获取帧数)。gui 中提供的示例函数旨在便于在分析之前对正确的参数进行评估。
通过这些一系列协议, 可以有效地分析大量线虫 (目前多达5000只个体蠕虫) 的表型, 从而减少了由于动物行为的内在变异性而产生的人工制品,同意对检测能力所必需的初步研究, 以实现对线虫25的研究所具有的统计意义。该平台使用高分辨率摄像机系统, 能够高速记录大量动物的图像, 同时记录多个大型队列。wf-ntp 协议的高性能和高吞吐量使得能够以非常准确的方式确定蠕虫行为的非常小的变化。因此, 这种方法不仅可以考虑研究线虫的生物学, 而且可以考虑药理和医学研究, 例如对基因修饰和药物进行高通量筛选治疗。这个程序的另一个优点是允许瘫痪研究与其他行为测量平行进行, 这是分子筛选研究的一个关键特征。
到目前为止, 在 ad15、34、35 和pd18 的药物发现计划中取得的成果表明, 广泛的视场数据采集在大幅增加可在单个实验中监测的动物数量, 从而显著减少实验误差, 大大提高了研究的统计有效性。虽然该议定书目前描述的方法侧重于应对药物发现领域的挑战, 但我们希望该方法将在社区得到广泛采用, 并将其应用推广到复杂的遗传和遗传领域。行为研究, 并扩大目前可检测到的表型的数量。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了错动疾病中心的支持。faa 得到联合王国阿尔茨海默氏症协会高级研究金奖的支持 (赠款编号 317, as-sf-16-003)。从线虫遗传中心 (cgc) 中获得了线虫菌株。
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |