Summary
我们描述了使用广域线虫跟踪平台 (wf-ntp) 的协议, 该平台能够对大量的线虫进行高通量表型表征。这些方案可用于表征突变菌株中微妙的行为变化, 或以高度可扩展的方式响应药理治疗。
Abstract
线虫是生物医学研究中公认的动物模型, 广泛应用于功能基因组学和衰老研究。为了评估所研究动物的健康和健身, 人们通常依靠运动读数, 比如测量身体弯曲的数量或运动速度。这些测量通常涉及人工计数, 因此很难获得良好的统计意义, 因为时间和劳动限制往往将每个实验中的动物数量限制在25或更少。由于在调查弱表型效应时, 必须有较高的统计能力来获得可重现的结果, 并限制假阳性和阴性结果, 因此最近一直在努力开发自动化协议, 重点是增加运动检测和多参数行为分析的灵敏度.为了将检测的限度扩大到捕捉基因研究和药物发现中往往至关重要的小表型变化所需的水平, 我们在这里描述了一种技术发展, 这种技术使多达 5, 000只动物能够进行研究同时, 与手动检测相比, 测量的统计能力增加了约 1000倍, 与其他可用的自动化方法相比增加了约100倍。
Introduction
大约半个世纪前 , 悉尼布伦纳引入了线虫作为研究发育和神经生物学的模型系统, 因为这种小的 ( 长 1 毫米 ) 透明的线虫很容易纵基因上和维护在实验室 1。今天,线虫被用来研究各种各样的生物过程, 包括细胞凋亡, 细胞信号转导, 细胞周期的性质, 基因调控, 代谢,老化2。此外, 细胞和组织的复杂性, 蛋白质表达模式和保存之间的疾病途径之间的线虫和更高的生物体 (80% 的蠕虫基因有一个人类的同源体), 与简单和培养的成本效益, 使其成为一种有效的体内模型生物, 适合高通量遗传3,4,5,6, 7, 8,9,10,11,12,1 3日和毒品 1 4、1 5、1 6次筛查。由于所有这些原因,线虫已被用于表征正常和疾病相关的分子途径;例如, 在神经退行性变领域, 它使人们能够探索衰老对蛋白质聚集3、4、7、15、17的影响。 18, 以及蛋白聚集的启动子和抑制剂的特性3,4,5,6,7, 14, 18岁
蠕虫的整体适应性是这类研究中定义的一个重要行为参数, 它可以通过多种方式手动测量, 例如通过计算每分钟身体弯曲次数 (bends)4,6,19, 或通过测量运动速度 20,21, 22, 以及通过测量平均寿命和瘫痪率。虽然手动测量身体弯曲和运动速度已经导致了许多重要的见解, 各种分子途径和机制3,4,14,19, 20,23, 手动检测仍然是目前的低吞吐量, 高度劳动密集型, 耗时, 同时容易出错和人类偏见。这些问题在收集数据方面提出了相当大的挑战, 有足够的统计能力来区分微妙的行为变化。这种限制与药物筛选特别相关, 因为具有潜在药物分子的治疗往往导致小的表型变化24, 因此需要对大量动物进行研究, 以获得可重现的结果。为了说明这一点, 最近的研究表明, 有必要有信心地定义行为的任何重大变化, 并限制假阳性结果 25.这使得线虫社区有强烈的动机用可重现、自动化、时间和经济高效的测量来取代手动计数。为了满足这一需求, 一些实验室最近开发了对更多的蠕虫进行高灵敏度测量和精确蠕虫跟踪的方法, 22、26、27、28 29,30, 31,32,33.
为了进一步将自动化过程扩展到具有统计意义的测量所需的大量动物, 我们最近开发了一个宽视场线虫跟踪平台 (wf-ntp)15,34 ,35,36, 它可以同时研究多个表型读数的非常大的蠕虫种群, 一个关键因素在统计相关的表型检测25。wf-ntp 目前不仅可以同时监测多达 5, 000只动物, 而且表型读数还包括多个参数, 包括身体弯曲的速率和振幅、运动速度、瘫痪人口的比例以及大小的动物。因此, 可以很容易地同时筛选数以千计的蠕虫, 并将不同的读数组合到行为地图中,以创建多维指纹36。相关的开源软件是用 python 编写的, 它也是操作它所必需的, 并且是完全可定制的。还提供了图形用户界面 (gui), 使用户能够采用此技术。
在这里, 我们提出了一系列的协议, 说明了 wf-ntp 的一些潜在应用。特别是, 我们讨论了化合物的管理, 从小分子到蛋白质疗法, 并描述了如何筛选其影响直接对大量的蠕虫, 从而有效地消除了样本小亚人口。为此目的使用 wf-ntp 已经在旨在设计阿尔茨海默氏症 (ad)15、34、35 和帕金森病 (pd) 18 的药物发现方案的程序中带来了显著的优势使用体内数据评估治疗候选 35,37。
Protocol
1.为线虫制备材料
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要制备 10倍 m9 缓冲液, 在1升高压灭菌瓶中加入30克磷酸二钾、60克二基磷酸钠和50克氯化钠。
- 在约121°c 的温度下加入1升纯净水和高压灭菌器15分钟。
- 在净化水中稀释 10次, 在约121°c 下稀释15分钟。
- 冷却时, 加入1毫升硫酸镁溶液的1毫升。
注: 在以下步骤中, 只能使用 1x m9 (m9) 进行蠕虫处理。
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制备线虫生长介质 (rich-ngm), 在121°c 下混合2.7 克氯化钠、15.75 克琼脂、5.75 克酪蛋白、900毫升纯净水和121°c 高压灭菌器15分钟。
- 如果不立即使用, 将 rich-ngm 介质转移到加热烤箱 (约 70°c);在无法使用之前, 可以将富重 nm 在大约70°c 下保持熔融12小时。
- 在 rich-ngm 混合物中, 在绝对乙醇中加入900μl 的 1 m 氯化钙溶液, 为 1 m 硫酸镁溶液添加 900μl, 在绝对乙醇中加入900μl 的溶液。
请注意:使用前不需要高压灭菌。 - 为了制备保持年龄同步种群的实验板, 在里氏 ngm 的812μm 至 900 ml 时加入92μl 的 5-氟-2 '-脱氧尿嘧啶 (fudr)。
请注意:fudr 是有毒和致癌的, 所以它是必要的, 除了实验室外套和安全眼镜, 必须戴丁腈手套。不要让废物进入一般废物流, 用加热器焚烧处理。 - 将蒸压的里氏堆在9厘米的无菌培养皿中, 生成一个生长板 (Rich-NGM 板)。将蒸压的里氏长核 (chi-ngm) 倒进一个9厘米长的无菌培养皿中, 制成一个运动板 (莫特板)。将20毫升的富 ngm 与 fudr 放入一个9厘米的无菌培养皿中, 生成一个 fudr 板。
请注意:莫特板的低琼脂体积方便了相机的对焦和蠕虫跟踪 (参见步骤 3.2.5)。
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在121°c 条件下高压灭菌1 l,制备 op50 大肠杆菌菌株, 在121°c 下进行15分钟的高压灭菌, 冷却后接种启动培养。
- 允许细菌培养物在37°c 下生长, 并对用于离心的试管进行消毒。
- 将细菌转移到无菌管和离心机, 以 4, 600 x克的速度15分钟。
- 装饰上清液, 并使用无菌水, 悬浮在原来体积的 10%, 以创建 10倍 (10倍浓缩) op50 股票。
- 稀释15毫升的 10倍 op50 库存到150毫升, 生成 1x op50, 使用无菌水, 然后用于种子里米 ngm 板。使用剩余的10倍溶液来播种 fudr 板。
请注意:mot 板将保持未播种, 并且仅在图像采集步骤中使用。
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将富 ngm 和 fudr 板分离到种子板。
- 在无菌条件下, 在里克-nm 板中加入350μl 的 1x op50, 均匀地分布。
请注意:不要扩散到盘子的边缘, 因为虫子会爬上盘子的两侧而死亡。 - 在无菌条件下, 在 fudr 板中加入350μl 的 10倍 op50, 均匀地分布。
- 使用前, 请让板材干燥并在20°c 孵育2d。
- 在无菌条件下, 在里克-nm 板中加入350μl 的 1x op50, 均匀地分布。
2.制备与wf-ntp 一起使用的线虫
- 在富有-ngm 的盘子上保持线虫, 或通过将少量含有蠕虫的琼脂正面转移到新鲜的细菌层。在启动实验协议之前, 以这种方式保持线虫菌株。
- 使用转移技术 (见步骤 2.1), 使用饲料良好的混合阶段蠕虫, 将每个菌株的20个板材种子, 并允许它们在20°c 下生长 2 d。
- 用15毫升的 mL 清洗5个含有蠕虫的盘子, 并将其灌当一个15毫升的管。对每个应变的所有20个板重复上述步骤。
- 以 2, 000 x克的速度离心蠕虫 2分钟, 去除上清液, 并悬浮在 mL 溶液的2毫升中。
- 以3:2 伏的比例将13% 的次氯酸钠和 4 m 氢氧化钠混合, 制备出10毫升的漂白溶液。
请注意:此解决方案不需要高压灭菌。这两种成分和由此产生的溶液都具有腐蚀性, 应小心使用丁腈手套进行处理。氢氧化钠对玻璃有轻微的腐蚀作用, 应存放在塑料容器中。 - 在每个离心管中加入1毫升的漂白溶液, 用力摇晃约3.5 分钟或直到角质层完全溶解。
- 在无菌条件下, 将样品稀释至15毫升 mL, 离心机以 2, 000 x g的速度稀释 2分钟, 取出上清液并悬浮在 mL 溶液的15毫升中。
- 重复 2.7 6 次, 直到只剩下虫卵, 溶液不再有氯的气味。
- 以 2, 000 x g离心样品 2分钟, 去除上清液, 并悬浮在 mL 溶液的2毫升中。
- 在无菌条件下, 使用无菌玻璃移液器将含有鸡蛋的2毫升 mL 转移到12井组织培养板的每口井中, 并在20°c 孵育至少16小时。
请注意:对每个菌株使用单独的板, 以防止交叉污染。从离心管到多井的转移步骤有助于避免蠕虫窒息。 - 将从12孔板孵化出来的蠕虫转移到15毫升的离心管中。取3滴5μl 的蠕虫溶液, 并计算在第一个幼虫阶段 (l1) 存在的蠕虫的数量。
- 计算每μl 溶液中的蠕虫数。
- 种子 l1 蠕虫到 rich-ngm 板上, 每个板 3, 000 蠕虫, 并允许它们在20°c 下生长 2天, 直到它们达到最后的幼虫阶段 (l4) 阶段。
3. wf-ntp 一般议定书
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在 6个 fudr 板上加入浓度适当的每种药物化合物的2.2 毫升 (例如, 至少为透明胺18和 bexarotene15等药物添加25或 10 mm), 并允许每个所需的蠕虫菌株在无菌条件下干燥。
请注意:对于正在检查的每一种化合物, 对于每个浓度和使用的每个溶剂, 重复此步骤。- 使用 mL 缓冲液15毫升, 将在第2.13 步制备的5个富有 ngm 板上清洗蠕虫, 并将蠕虫转移到离心管中。
- 以 2, 000 x 克离心 2分钟, 去除上清液, 并悬浮在 mL 的3毫升中。取3滴含有蠕虫的 m9 溶液 5μl, 并计算在最后幼虫阶段 l4 存在的蠕虫数量。
- 计算 m9 缓冲液每μl 的蠕虫数。
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种子 700 l4 幼虫到6干 fudr 板含有给定的化合物, 重复每个浓度的每个化合物, 并允许在无菌条件下干燥。
- 在 l4 的24°c 条件下对蠕虫进行培养, 用于仅通过提高温度而诱发蠕虫麻痹的菌株, 如 ad菌株 38。将 l4 幼虫阶段后的第二天计算为成年后的 d0。
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打开跟踪器的舞台灯。
- 用70% 乙醇清洁玻璃舞台, 确保没有可见残留, 然后取下镜片盖。使用空气除尘器清洁成像镜头。确保相机已正确插入并安装, 并开始使用图像捕获软件进行录制。
- 调整相机设置以记录20个帧, 设置单声道16个记录参数;记录1200帧, 以95% 的压缩率保存 mjpeg 格式。使用一个空的9厘米培养皿, 以确保舞台设置到正确的高度, 并在必要时进行调整。
请注意:确保板材的边缘在录制中可见, 因为这将允许 "保持死" 算法正常工作 (图 1a)。 - 在无菌条件下, 取2个先前在步骤3.2 中制备的相同条件下的板, 并在步骤1.2.4 中制备1个莫特筛检板。将 mL 溶液的3毫升添加到 mL 板。使用其他2毫升的 mL 将步骤3.2 中准备的2个板的表面积洗到 mot 板上。
- 将含有约5毫升 mL 溶液和大约600蠕虫的 mL 板放置在跟踪器阶段。使用单个蠕虫对焦相机, 然后开始录制。
- 录音完成后, 用蠕虫丢弃莫特板;将 fudr 板标记为使用过一次, 并将其返回到孵化器。
- 重复步骤3.3.3 为每个实验条件3.3.5。
- 重复3.3.3 步骤, 为成人寿命中的每个时间点3.3.6。
注: 筛查程序可以在蠕虫成年寿命的任何时间点 (约3周) 进行。这些协议有助于筛选多达9个时间点;作者建议从成年后的第一天开始每2天进行一次筛查。
4. 离散剂量研究的优化
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通过重复 3.1.3 3.1.1 的步骤来准备蠕虫。
- 种子约 1000 l4 蠕虫到 5个 fudr 板。在24°c 的温度下培育板材, 直到成年后的 d3, 用于涉及 ad38 蠕虫的实验。
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使用无菌玻璃移液器, 将在无菌条件下制备的蠕虫从板材转移到15毫升的离心管, 离心机为 2, 000 x g , 2分钟, 并取出上清液。
- 挂起 mL 缓冲区 1 ml 中蠕虫的解。将蠕虫转移到微离心管, 离心机在 300 x g下 2分钟, 并取出上清液。
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对于蛋白质转导, 在所需浓度 (通常为 40μm) 下加入40μl 的转染传递试剂和20μl 的原生蛋白, 并在室温下孵育30分钟。
- 在无菌条件下, 使用无菌玻璃移液器将蠕虫从步骤转移到含有包封蛋白质的微离心管中, 使其总体积为 1060μl. 水平放置管, 并在24°c 晃动的孵化器中晃动, 时间为8小时。
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在无菌条件下, 将 mL 溶液中加入4毫升, 并将一个蠕虫微离心管加药物转移到 mL 板上。
- 通过重复步骤 3.3 3.3.2 来设置跟踪器。
- 在无菌条件下, 将 mL 溶液中加入4毫升, 并将一个蠕虫微离心管加药物转移到 mL 板上。
- 将 mot 板放在跟踪器舞台上, 将相机聚焦在单个蠕虫上, 然后开始录制。完成后, 标记 mot 板并设置为一侧。
- 对所有示例重复步骤4.4.1 和4.4.3。
- 使用玻璃移液器, 在无菌条件下将蠕虫从 moot 板转移到15毫升的离心管, 并以 2, 000 x g的离心机 2分钟, 取出上清液, 将颗粒转移到 fudr 板上, 并允许在无菌条件下干燥。
- 对所有示例重复步骤4.4.5。
- 在24°c 下培育蠕虫, 直到成年后的 d6。
请注意:多个抗体孵育也是可能的。 -
将 mL 缓冲液的3毫升添加到 mL 板中, 并使用 mL 溶液的2毫升将所有蠕虫从 fudr 板清洗到 mL 板上。
- 通过重复步骤 3.3 3.3.2 来设置跟踪器。
- 将 mot 板放置在跟踪器舞台上, 根据需要聚焦相机, 并开始录制。录制完成后, 丢弃 mot 板或根据需要将其恢复以进行进一步筛选。
- 重复步骤 4.6, 对所有示例4.6.2。
5. 分析视频数据
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获取视频后, 在软件 gui 中选择适当的参数 (图 2) 进行数据分析。
- 通过浏览功能加载单个或多个视频。选择输出目标文件夹。确保600到 1, 200 帧用于 30 s 分析。
注: 可以分析任意范围的帧。 - 插入像素到 mm 的转换因子, 该转换系数为 0.029, 用于以全分辨率成像9厘米的 petri 培养皿。选择跟踪算法 "保持死亡"。
请注意:转换因子将取决于所使用的视场。z 变换算法也可以作为一种替代方法。 - 填写"定位" 部分中的参数 (图 2): z 使用图像= 100, z 填充= 3, std 像素= 54,阈值= 9, 打开 = 1 ,关闭= 2。将筛选参数调整为最小大小= 20,最大大小= 180,类似蠕虫= 0.94。
- 调整形成轨迹参数:最大距离移动 = 10;最小长度= 150,内存= 10。
- 设置弯曲和速度参数。使用1.8 为弯曲阈值, 0 用于最小弯曲, 150 用于帧来估计速度。
- 调整死蠕虫统计信息。对每分钟最大节拍使用 5.0,对最大速度使用1.0。
- 选择输出文件夹。将输出帧数设置为50。将字体大小设置为10。
请注意:(可选) 选择一个或多个感兴趣的区域(roi)。
- 通过浏览功能加载单个或多个视频。选择输出目标文件夹。确保600到 1, 200 帧用于 30 s 分析。
- 使用"示例" 函数测试参数。输出示例图像, 并检查蠕虫在8个阈值步骤中是否可见 (图 1)。
- 使用"开始" 作业功能。
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通过合并整个数据集的单个结果来分析文本结果文件。在 gui 中使用 "导出到 tsv" 函数。
请注意:或者, 在人口研究中也可以考虑蠕虫的单个指标。- 使用统计软件包分析数据。
Representative Results
通过易于操作、多参数分析和图文并茂的 wf-ntp 协议 (图 1和图 2) 的高吞吐量, 可以非常准确地确定蠕虫行为的非常小的变化。成像平台基于定制的光学机械, 它可以使用一个 6 mp 单色相机与16毫米焦距高分辨率镜头相结合, 用于 1 ' ' 传感器, 用 8 ' 由 8 ' 的白背光照明 (见材料表以及参考36以了解更多详细信息)。相关的 wf-rtp 软件是用 python 编写的, 是为在 windows 平台上运行而开发的。它在具有 3.00 ghz 八核处理器和 64 gb 随机存取内存 (ram) 的自定义组装计算机上运行。该软件还设计为基于计算机的 ram 和 cpu 对工作和视频分析进行并行化;也就是说,计算功率较低的机器将导致并行运行的视频减少。我们目前正在使用的设置经过优化, 可同时运行多达16个视频, 并可以在一夜之间完成对大约 100个视频的分析。此外, wf-ntp 的 gui 中提供的高度详细的自定义允许极大地控制成像分析的质量。gui 可用于以并行或单独的视频直接上传大型数据集;还可以选择特定的帧进行详细的子分析, 以及像素转换因子, 该因子可用于估计行为指标。根据用户是否希望在分析中考虑瘫痪的动物, 可以选择两种不同的跟踪算法之一 (保持死和 z 变换)。阈值参数可根据视频和实验质量进行相应的调整。打开和关闭参数允许用户消除噪声并进一步实现阈值功能。骨架化算法提供了一种替代的分析方法。对象大小截止 (过滤) 为背景噪声提供了一个额外的过滤器, 类似蠕虫的参数允许用户只考虑具有椭球形状的蠕虫, 从而区别于可能具有相同像素大小的其他对象。蠕虫。在这些阈值操作之后, 可以将所有生成的标记区域标识为单个蠕虫, 然后为每个帧存储这些区域的位置, 以便随后进行分析和跟踪。利用每个履带蜗杆的偏心度来估计蜗杆弯曲程度 (bpm) 等蠕虫指标与时间的关系。还允许用户选择冲突后在软件内存中保留蠕虫的帧数, 并且蠕虫可以在帧之间移动的像素数也可以进行调整, 以区分动物和噪音。"最小轨道长度" 选项允许用户丢弃仅跟踪了几个帧的蠕虫。其他关键参数, 如弯曲和速度, 允许用户选择所需的弯曲程度作为身体弯曲和帧数被认为是估计动物的速度所需的。可进一步调整截止参数以纳入瘫痪动物。输出将自动显示在结果文件中。这些值被认为是评估瘫痪动物比例的上限。用户还可以选择一个或多个感兴趣的区域。此功能对于分析蠕虫的子群特别有用, 并且输出会在结果文件中自动排序。输出选项允许用户选择输出文件夹以及将为其生成的跟踪帧数。各种工具集还可用于进一步的数据分析, 例如显示单个蠕虫轨道的绘图路径工具和允许用户创建指纹图的指纹工具。
这种方法使人们能够采用新的方法, 不仅对线虫进行生物学研究, 而且用于药理和医学研究目的, 例如对基因修饰进行高通量筛选和药物治疗。我们通过描述大量人群研究 (n & gt; 1000) 的表型特征来说明这种潜力, 这些模型是神经退行性疾病 (额叶痴呆 (ftd)39, 帕金森病 (pd)7阿尔茨海默氏病 (ad)16,40和肌萎缩侧索硬化症 (als)19 (图 3a), 并使用 pd18和 ad的蠕虫模型描述潜在治疗分子的影响15、12 (图 3b)。两个小分子, 角胺18和 bexarotene15, 分别在浓度为25μm 至 pd (图 3b) 和10μm 至ad 38 (图 3b) 蠕虫。在所测试的浓度范围内, 这两种化合物都表现出明显的剂量依赖性效应。我们已经证明, 这种高精度的测量是通过增加蠕虫的数量, 可以分析与传统方法相比 (图 3c)。我们说明了样本大小 (图 3c) 在分子筛选和突变菌株表征中的重要性。温度从20°c 升高导致大约一半的 ad 蠕虫在成年3天后瘫痪。在不同的条件下筛选蠕虫种群, 例如,当过度表达淀粉样蛋白β肽 (aβ1-42) (ad蠕虫)的42残留形式的蠕虫暴露在微妙的温度变化中 (图 3c, 左当 aβ1-42 在所有神经元中表达时 (图 3c, 中央面板), 或当 ad 蠕虫暴露于 bexarotene 时 (图 3c, 右面板)。还从使用 wf-ntp (n & lt; 50, 黄条) 获得的视频的完整视野中随机抽取的小组织中分析了蠕虫, 重点是将这些蠕虫的运动与整个蠕虫种群 (n) 的平均运动进行比较& lt; 1, 000)。在所有的面板中, 对整个蠕虫种群的测量差异似乎有统计学意义, p≤0.0001 (* * * *)。
此处描述的 wf-ntp 协议还允许同时记录多个参数 (图 1b), 以最佳方式支持内部验证和开发各种条件的综合指纹相对于控制样本, 允许跨多个研究进行有意义的比较。这种多参数方法包括同时分析多种行为特征, 包括弯曲频率、速度、麻痹率、尺寸、弯曲振幅和弯曲位移36。这使得对数以千计的动物进行了非常详细的监测, 具有非常高的敏感性和统计意义, 并为大量人口的研究提供了机会。这种跟踪程序的另一个优点是允许瘫痪研究与其他行为测量平行进行, 这是分子筛选研究的一个关键特征。
到目前为止在 ad15、34、35和 pd18药物发现中取得的成果表明, 广泛的视场数据采集对于大幅增加可在广告中的动物数量十分重要。在一次实验中进行监测, 显著减少了实验误差, 大大提高了研究的统计有效性。基于这些结果, 我们预计我们随时为社区提供的 wf-ntp 协议将显著扩大线虫的使用范围.
图 1: wf-ntp 分析步骤和指纹示例.(a) 1。原始视频。2. 背景图像。3. 背景减去图像。4-6. 按住步骤。7-9. 蠕虫的单一标签。(b) 报告了多种表型, 并对野生蠕虫和 pd 和 ad 蠕虫模型进行了指纹检查。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: wf-ntp 的图形用户界面 (gui).可以在 gui 中选择特定的视频和选定的帧进行分析, 并可以插入像素转换因子, 然后使用两个给定的跟踪算法之一进行分析。可以选择作为身体弯曲所需的弯曲程度以及估计动物速度所需的帧数。身体弯曲和速度阈值可以确定瘫痪蠕虫统计信息。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: wf-ntp 方法启用的应用程序示例。(a) wf-ntp 在 ftd、pd、ad 和 als 等一系列神经退行性疾病的 bpm 模型的大规模种群研究 (n & gt; 1, 000) 中的应用。(b) wf-ntp 在药物发现中的应用。(c) 人口研究在温度敏感性、药物疗效和突变株特性方面的重要性。将亚种群 n & lt; 50 (黄条) 的表型与整个蠕虫种群 (n & lt; 1000) 的表型进行比较。误差线表示平均值 (sem) 的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
由于光学科学领域的技术迅速扩展, 现在有可能以全新的方式满足线虫研究中对自动化方法的要求。因此, 设计了一些数字跟踪平台20、41、42、43、44、45、46台,并提供了在过去的几年里, 为了取代手动计数的参数, 如运动速度, 弯曲频率, 瘫痪率, 以及更复杂的行为形式, 如欧米茄转弯, 寿命测量。最近的自动化平台大大提高了线虫研究41的重现性和灵敏度, 并提供了关于小群甚至单个动物的高质量数据。我们决定扩大蠕虫行为分析的自动化范围, 以便也可以同时评估数千只动物群体的表型。研究蠕虫队列的方法的主要优点是, 它允许考虑蠕虫行为24 的高内在变异性, 并考虑到药物治疗研究往往导致微妙的表型变异, 这是在使用一小群动物时, 很难被发现具有足够的统计意义。高检测能力 (pod) 确实是必要的, 以自信地检测行为的任何显著变化, 并限制假阳性结果25。
在这里, 我们描述了一系列的协议, 基于最近报告的自动筛选方法的线虫, 广域线虫跟踪平台 (wf-ntp)36。这里描述的协议分为5个部分。第1部分和第2部分描述了大量蠕虫种群的制备。关键的步骤是工作条件的无菌性以及运行实验所需的试剂和板材的制备。我们注意到, 由于与其他筛选方法相比, 该议定书提供的吞吐量增加了36, 因此还需要增加试剂的数量;在实验设计中需要仔细考虑这个因素。我们还注意到, 漂白步骤至关重要, 需要提前进行测试, 因为运行这些实验需要大量的鸡蛋和健康的幼虫。本协议的第3部分详细介绍了如何在固体介质和筛网蠕虫种群中提供药物。我们注意到, 议定书的这一部分在很大程度上取决于使用者平行检测的药物数量和药物浓度。筛选过程的完全自动化和快速数据采集将限制步骤从行为观察转移到试剂制备、大型蠕虫种群的生长和同步。行为筛选过程中的关键步骤是记录的计时和任何蠕虫处理步骤 (例如, 蠕虫从 ngm 板转移到跟踪平台)。这里描述的协议是一个例子, 旨在筛选蠕虫长达9天的成人寿命;但是, 此协议可以很容易地适应屏幕尽可能多的时间点, 如, 连续 18天36天.第4部分随后说明了将蛋白质分子 (如抗体和分子伴侣) 传递到线虫中的协议的应用, 并说明了如何根据所需的需要轻松定制第1-3部分中所述的协议。应用。我们展示了如何将这一程序不仅推广到药物样分子的传递, 而且还可用于分子伴侣或抗体的管理。除非另有说明, 前四个步骤 (部分) 是在无菌条件下进行的。所有液体成分在使用前都应高压灭菌, 孵育步骤应在70% 的相对湿度下进行。在第5部分中, 我们将介绍如何使用与跟踪阶段相结合提供的软件包。该软件是为分析与大型蠕虫种群行为相关的 wf-ntp 数据而定制设计的。我们建议用户遵循第5部分中提供的数据分析指南;但是, 这些参数取决于录制的视频的特定功能 (即 fps、视场、视频分辨率、获取帧数)。gui 中提供的示例函数旨在便于在分析之前对正确的参数进行评估。
通过这些一系列协议, 可以有效地分析大量线虫 (目前多达5000只个体蠕虫) 的表型, 从而减少了由于动物行为的内在变异性而产生的人工制品,同意对检测能力所必需的初步研究, 以实现对线虫25的研究所具有的统计意义。该平台使用高分辨率摄像机系统, 能够高速记录大量动物的图像, 同时记录多个大型队列。wf-ntp 协议的高性能和高吞吐量使得能够以非常准确的方式确定蠕虫行为的非常小的变化。因此, 这种方法不仅可以考虑研究线虫的生物学, 而且可以考虑药理和医学研究, 例如对基因修饰和药物进行高通量筛选治疗。这个程序的另一个优点是允许瘫痪研究与其他行为测量平行进行, 这是分子筛选研究的一个关键特征。
到目前为止, 在 ad15、34、35 和pd18 的药物发现计划中取得的成果表明, 广泛的视场数据采集在大幅增加可在单个实验中监测的动物数量, 从而显著减少实验误差, 大大提高了研究的统计有效性。虽然该议定书目前描述的方法侧重于应对药物发现领域的挑战, 但我们希望该方法将在社区得到广泛采用, 并将其应用推广到复杂的遗传和遗传领域。行为研究, 并扩大目前可检测到的表型的数量。
Disclosures
提交人声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了错动疾病中心的支持。faa 得到联合王国阿尔茨海默氏症协会高级研究金奖的支持 (赠款编号 317, as-sf-16-003)。从线虫遗传中心 (cgc) 中获得了线虫菌株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable reagents | |||
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
| C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
| C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
| C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
| pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| air duster | Office Depot | 1511631 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
| 8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
| 16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
| 6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
| FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
| WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
| Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |
References
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