Summary
Se describen los protocolos para el uso de la plataforma de seguimiento de nematodos de amplio campo de visión (WF-NTP), que permite alto rendimiento caracterización fenotípica de poblaciones grandes de Caenorhabditis elegans. Estos protocolos se pueden utilizar para caracterizar cambios sutiles del comportamiento en cepas mutantes o en respuesta al tratamiento farmacológico de manera altamente escalable.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un modelo bien establecido en la investigación biomédica, ampliamente empleada en estudios de envejecimiento y genómica funcional. Para evaluar la salud y la aptitud de los animales bajo estudio, uno normalmente se basa en lecturas de la motilidad, como la medición de la cantidad de curvas del cuerpo o la velocidad de movimiento. Estas medidas implican generalmente el recuento manual, lo que es difícil obtener buena significación estadística, como el tiempo y las limitaciones de mano de obra a menudo limitan el número de animales en cada experimento a 25 o menos. Ya que alta potencia estadística es necesario para obtener resultados reproducibles y limitar resultados falsos positivos y negativos cuando se investigan los efectos fenotípicos débiles, recientemente se han hecho esfuerzos para desarrollar protocolos automatizados se centró en el aumento de la sensibilidad de detección de motilidad y multi-paramétrico de perfiles conductuales. Para ampliar el límite de detección al nivel necesario para capturar los pequeños cambios fenotípicos que son a menudo cruciales en estudios genéticos y descubrimiento de fármacos, se describe aquí un desarrollo tecnológico que permite el estudio de los animales individuales hasta 5.000 simultáneamente, aumentar el poder estadístico de las mediciones por unos 1,000-fold en comparación con el análisis manual y unos 100-fold en comparación con otros métodos automatizados disponibles.
Introduction
Hace aproximadamente medio siglo Sydney Brenner introdujo Caenorhabditis elegans (C. elegans) como un sistema modelo para estudiar desarrollo y Neurobiología, como este pequeño (1 mm de longitud), gusano del nematodo transparente es fácil de manipular genéticamente y a mantener en el laboratorio1. C. elegans se utiliza hoy, para el estudio de una amplia variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, la naturaleza del ciclo celular, regulación génica, metabolismo y envejecimiento2. Además, la complejidad celular y tejido, patrones de expresión de la proteína y la conservación de los caminos de la enfermedad entre C. elegans y organismos más altos (80% de los genes del gusano tienen un orthologue humano), con la sencillez y rentabilidad del cultivo, que sea un organismo eficaz en vivo modelo susceptibles a genética de alto rendimiento3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , drogas y 13 14,15,16 proyecciones. Por todas estas razones, C. elegans se ha empleado para la caracterización de vías moleculares normales y relacionadas con la enfermedad; en el campo de la neurodegeneración, por ejemplo, ha permitido la exploración de los efectos del envejecimiento en la proteína agregación3,4,7,15,17, 18y la caracterización de promotores e inhibidores de la proteína agregación3,4,5,6,7,14, 18.
La condición física general de los gusanos, que es un parámetro de comportamiento importante en este tipo de estudio, puede medirse manualmente en una variedad de maneras, como contando el número de curvas de cuerpo por minuto (BPM)4,6, 19, o mediante la medición de la velocidad de movimiento20,21,22, así como mediante la medición de la vida útil promedio y las tasas de parálisis. Aunque mediciones manuales de cuerpo curvas y velocidad de movimiento han conducido a muchos conocimientos profundos e importantes en una variedad de vías moleculares y mecanismos3,4,14,19, 20,23, manual de ensayos siguen siendo actualmente bajo rendimiento altamente necesitandos mucho trabajo y mucho tiempo y son propensos a errores y prejuicios humanos. Estas cuestiones presentan desafíos considerables en la recogida de datos con suficiente poder estadístico para distinguir cambios sutiles del comportamiento. Esta limitación es particularmente relevante para drogas de detección como los tratamientos con drogas potenciales moléculas a menudo conducen a cambios fenotípicos pequeños24, requiriendo por lo tanto el estudio de un gran número de animales con el fin de obtener resultados reproducibles. Para ilustrar este punto, estudios recientes han demostrado que un alto poder de detección (POD) es necesario definir con confianza cualquier cambio significativo en el comportamiento y limitar falsos positivos25. Esto ha resultado en una fuerte motivación en la comunidad de C. elegans para reemplazar el conteo manual con mediciones reproducible, automatizada, tiempo - y costo - efectiva. Para satisfacer esta demanda, varios laboratorios han desarrollado recientemente métodos para mediciones de alta sensibilidad y seguimiento gusano precisa de mayor número de gusanos22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Para ampliar aún más el proceso de automatización a las cohortes grandes de animales necesarios para las mediciones estadísticamente significativas, hemos desarrollado recientemente un nematodo de amplio campo de visión de seguimiento de plataforma (WF-NTP)15,34 ,35,36, que permite la investigación simultánea de múltiples lecturas fenotípicas en las poblaciones de gusano muy grande, un factor clave en la detección fenotípica estadísticamente relevantes25. No sólo puede el WF-NTP monitor actualmente hasta 5.000 animales en paralelo, pero las lecturas fenotípicas también incluyen varios parámetros, incluyendo el ritmo y la amplitud de las curvas del cuerpo, la velocidad de movimiento, la fracción de la población que está paralizada, y la tamaño de los animales. Por lo tanto es fácilmente posible pantalla miles de gusanos en paralelo y para combinar las diferentes lecturas en un mapa de comportamiento para crear una huella digital multidimensional36. El software de código abierto asociado está escrito en Python, que es también necesaria para operarlo y es totalmente personalizable. También se proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI) para permitir a los usuarios a adoptar esta tecnología.
Aquí, presentamos una serie de protocolos que ilustran algunas de las aplicaciones potenciales de la WF-NTP. En particular, discutimos la administración de compuestos, que van desde moléculas pequeñas de proteínas terapéuticas y se describe cómo detectar sus efectos directamente sobre grandes poblaciones de gusanos, efectivamente eliminando así la necesidad de la muestra pequeño las subpoblaciones. El uso del NTP WF para ello ya ha traído ventajas significativas en procedimientos encaminados a diseñar programas de descubrimiento de drogas de la enfermedad de Alzheimer (EA)15,34,35 y enfermedad de Parkinson (EP)18 con datos in vivo para la evaluación de los candidatos terapéuticos35,37.
Protocol
1. preparación de materiales para protocolos de C. elegans
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Para preparar una solución de tampón de x M9 10, agregue 30 g de fosfato de potasio monobásico, 60 g de fosfato dibásico de sodio y 50 g de cloruro de sodio a una botella de 1 L en autoclave.
- Añadir 1 L de agua purificada y autoclave en aprox. 121 ° C durante 15 minutos.
- Diluir 10 veces en agua purificada y autoclave a aprox. 121 ° C durante 15 minutos.
- Cuando haya enfriado, añadir 1 mL de una solución 1 M de sulfato de magnesio.
Nota: Solamente 1 x M9 (M9) debe ser utilizado para gusano en lo siguiente.
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Para preparar el medio de crecimiento de nematodos (ricos-NGM), mezcle 2,7 g de cloruro de sodio, 15,75 g de agar, 5,75 g de caseína, 900 mL de agua purificada y autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
- El medio rico-NGM de transferencia a un horno de calentamiento (aprox. 70 ° C) si no se utiliza inmediatamente; la NGM rico podrá mantenerse fundido en aprox. 70 ° C durante 12 h antes de convertirse en inutilizable.
- A lo ricos-NGM mezclar, agregar 900 μl de una solución de cloruro de calcio, 900 μl de una solución 1 M de sulfato de magnesio y 900 μl de una solución de colesterol 5 mg/mL de 1 M en etanol absoluto.
Nota: Colesterol no requiere antes de autoclavar usar. - Para preparar las placas experimentales que mantienen una población sincrónica, añadir 92 μl de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) en 812 μm a 900 mL de ricos-NGM.
Nota: FUDR es tóxico y cancerígeno, por lo que es indispensable usar guantes de nitrilo además de batas de laboratorio y gafas de seguridad. No permita que basura entrar basura corriente y eliminar por incineración con un dispositivo de poscombustión. - Vierta 20 mL de la rica-NGM esterilizado en un plato de Petri estéril de 9 cm para generar una crecimiento placa (ricos-NGM). Verter 15 mL de lo ricos-NGM esterilizado en un plato de Petri estériles de 9 cm hacer una motilidad placa (Mot). Vierta 20 mL de ricos-NGM con FUDR en un plato de Petri estériles de 9 cm para generar una placa FUDR.
Nota: El volumen de agar bajo de la placa Mot facilita la cámara enfocar y gusano de seguimiento (ver paso 3.2.5).
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Preparar la cepa OP50 Escherichia coli , en autoclave 1 L de caldo LB a 121 ° C durante 15 minutos y se inoculan con cultura de arrancador cuando haya enfriado.
- Permiten el cultivo bacteriano crecer durante la noche a 37 ° C y para esterilizar el tubo utilizado para la centrifugación.
- Transferir las bacterias a tubos estériles y centrifugar a 4.600 x g durante 15 minutos.
- Decantar el sobrenadante y utilizar agua estéril, suspender en el 10% del volumen original para crear 10 valores OP50 de x (10 veces concentrada).
- Diluir 15 mL del stock de x OP50 10 a 150 mL para generar 1 x OP50, usando agua estéril, antes de utilizar placas de ricos-NGM la semilla. Los restantes 10 x solución a placas FUDR semilla.
Nota: Las placas Mot permanecerán no sembradas y se utilizará sólo en la etapa de adquisición de imagen.
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A placas de semilla con las bacterias, segregan la NGM ricos y placas FUDR.
- Bajo condiciones estériles, añadir 350 μl de 1 x OP50 a NGM ricos platos y repartir uniformemente.
Nota: No se extendido hasta el borde de la placa como gusanos se arrastran hacia los lados de la placa y mueren. - Bajo condiciones estériles, añadir 350 μl de 10 x OP50 a FUDR platos y repartir uniformemente.
- Permita que las placas en seco e incubar a 20 ° C por 2 d antes de su uso.
- Bajo condiciones estériles, añadir 350 μl de 1 x OP50 a NGM ricos platos y repartir uniformemente.
2. preparación de C. elegans para uso con el WF-NTP
- Mantener C. elegans en platos ricos NGM o mediante la transferencia de una pequeña cantidad de agar que contiene gusanos cara abajo sobre una fresca capa bacteriana. Mantener las cepas de C. elegans , de esta manera antes de iniciar los protocolos experimentales.
- Mediante la técnica de transferencia (vea el paso 2.1), 20 placas semillas de cada cepa con gusanos etapa bien alimentados, mezclado y permitirles crecer por 2 d a 20 ° C.
- Lavar las placas de 5 que contienen gusanos usando 15 mL de M9 y piscina en un tubo de 15 mL. Repita para todas las 20 placas de cada cepa.
- Centrifugue los gusanos a 2.000 x g durante 2 min, eliminar el sobrenadante y suspensión en 2 mL de solución de M9.
- Preparar 10 mL de solución de blanqueo mediante la mezcla de hipoclorito de sodio 13% y 4 M hidróxido de sodio en una proporción de 3:2 vol/vol.
Nota: Esta solución no requiere de autoclave. Componentes y la solución resultante son corrosivos y deben ser manejados con cuidado utilizando guantes de nitrilo. Hidróxido de sodio es ligeramente corrosivo para el vidrio y deben almacenarse en recipientes de plástico. - Añadir 1 mL de solución de blanqueo a cada tubo de centrífuga y agite vigorosamente por unos 3,5 min o hasta que la cutícula se ha disuelto completamente.
- Bajo condiciones estériles, diluir las muestras M9 de 15 mL y centrifugar a 2.000 x g por 2 minutos quite el sobrenadante y suspender en 15 mL de solución de M9.
- Repita el paso 2,7 6 veces, hasta que quedan sólo huevos del gusano, y la solución ya no tiene un olor de cloro.
- Centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 2 min, eliminar el sobrenadante y suspensión en 2 mL de solución de M9.
- Bajo condiciones estériles, utilice una pipeta de vidrio estéril transfiera 2 mL de M9 que contienen huevos en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos 12-bien e incubar a 20 ° C durante un mínimo de 16 h.
Nota: Utilizar placas separadas para cada cepa para evitar la contaminación cruzada. El transferencia paso de los tubos de centrífuga a la ayuda de varios pozos para evitar asfixia de gusano. - La transferencia de los gusanos que nacieron la noche de las placas 12-bien en tubos de centrífuga de 15 mL. Tomar 3 gotas de 5 μl de solución worm y contar el número de gusanos presentes en el primer estadio larval (L1).
- Calcular el número de lombrices por μl de la solución.
- Semilla L1 gusanos en platos ricos NGM en 3.000 lombrices por placa y que puedan crecer durante 2 días a 20 ° C, hasta que llegan a la última etapa de estadio larvario (L4).
3. general WF-NTP protocolo
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Añadir 2,2 mL de cada medicamento compuesto en la concentración adecuada (tal como 25 o 10 mM para drogas como escualamina18 y bexaroteno15, respectivamente) a FUDR 6 placas y dejar para secar en condiciones estériles para cada uno el deseado cepa de gusano.
Nota: Este paso se repite para cada compuesto en estudio, para cada concentración y cada solvente utilizado.- Lave los gusanos de 5 placas de NGM ricos preparados en el paso 2.13 usando 15 mL de buffer M9 y trasladar las lombrices a un tubo de centrífuga.
- Centrifugar a 2.000 x g durante 2 min, eliminar el sobrenadante y suspender en 3 mL de M9. Tomar 3 gotas de 5 μl de la solución M9 gusanos y contar el número de gusanos presentes en el último estadio larvario L4.
- Calcular el número de lombrices por μl de buffer M9.
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Las larvas L4 de semilla 700 en 6 de las placas FUDR secas contiene un compuesto dado, repita para cada concentración de cada compuesto y deje que se seque bajo condiciones estériles.
- Incubar los gusanos a 24 ° C de L4 para esas tensiones donde la parálisis gusano es inducida sólo por aumento de la temperatura, como el anuncio cepa38. Contar del día siguiente a la etapa larval L4 como D0 de la edad adulta.
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Encienda las luces del escenario para el perseguidor.
- Limpie la platina de vidrio con etanol al 70% y asegurar que no quede residuo visible, luego retire la tapa del objetivo. Limpie la lente de proyección de imagen usando un plumero de aire. Asegúrese de que la cámara está conectada correctamente e instalada y empezar a grabar con el software de captura de imagen.
- Ajustar la configuración de la cámara para grabar 20 fotogramas/s, con 16 mono grabación configuración de parámetros; registrar 1.200 marcos, guardar en formato MJPEG a una tasa de compresión de 95%. Utilice un vacío plato de Petri de 9 cm para asegurarse de que el escenario está preparado a la altura correcta y ajustar si es necesario.
Nota: Asegurar que los bordes de la placa son visibles en la grabación, esto permitirá que el algoritmo de 'mantener muerto' funcionar correctamente (Figura 1a). - Bajo condiciones estériles, tome 2 placas previamente preparadas en el paso 3.2 con las mismas condiciones y 1 Mot proyección plato preparado en el paso 1.2.4. Añadir 3 mL de la solución de M9 a la placa Mot. Uso otros 2 mL de M9 para lavar 1/3 de la superficie de 2 placas preparada en el paso 3.2 sobre la placa Mot.
- Coloque la placa Mot que contiene aproximadamente 5 mL de la solución de M9 y aproximadamente 600 gusanos en la etapa de seguimiento. Enfoque la cámara usando un gusano individual y comenzar a grabar.
- Cuando la grabación termine, deseche la placa Mot con los gusanos; marcar las placas FUDR como se utiliza una vez y volver a la incubadora.
- Repita los pasos 3.3.3 a 3.3.5 para cada condición experimental.
- Repita los pasos 3.3.3 a 3.3.6 para cada momento en la vida adulta.
Nota: Los procedimientos de cribado pueden realizarse en cualquier momento de la vida adulta del gusano (aprox. 3 semanas). Estos protocolos de facilitan la detección de hasta 9 puntos del tiempo; los autores recomiendan screening cada 2 días a partir de día 1 de la edad adulta.
4. optimización para estudios de dosis discretas
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Preparar gusanos repitiendo los pasos 3.1.1 a 3.1.3.
- Semillas ca. 1000 L4 gusanos sobre placas FUDR 5. Incubar las placas a 24 ° C hasta D3 de la edad adulta, para experimentos AD38 gusanos.
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Con una pipeta de vidrio estéril, transferencia los gusanos prepararon bajo condiciones estériles de la placa a un tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 2.000 x g durante 2 min y retirar el sobrenadante.
- Suspender la solución de gusanos en 1 mL de buffer M9. Transferencia de los gusanos a un tubo de microcentrífuga, centrífuga a 300 x g durante 2 min y eliminar el sobrenadante.
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Para la transducción de proteínas, añadir 40 μl del reactivo de entrega de transfección y 20 μl de proteína nativa en la concentración deseada (normalmente 40 μm) e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Bajo condiciones estériles, utilice una pipeta de vidrio estéril para transferir gusanos de paso 4.2.1 en un tubo de microcentrífuga que contiene proteínas encapsuladas para dar un volumen total de 1060 μl. tubos lugar horizontalmente y agitar a 60 rpm en a 24 ° C agitando incubadora de 8 h.
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Bajo condiciones estériles, añadir 4 mL de solución de M9 a una placa Mot y transferir a un tubo de microcentrífuga de gusanos más droga en la placa Mot.
- Configurar el rastreador repitiendo los pasos 3.3 a 3.3.2.
- Bajo condiciones estériles, añadir 4 mL de solución de M9 a una placa Mot y transferir a un tubo de microcentrífuga de gusanos más droga en la placa Mot.
- Coloque la placa Mot en la etapa de seguimiento, enfoque la cámara en un gusano individual y comenzar a grabar. Cuando termine, etiqueta de la placa Mot y ponga a un lado.
- Repita los pasos 4.4.1 y 4.4.3 para todas las muestras.
- Con una pipeta de vidrio, gusanos bajo condiciones estériles de transferencia de la placa Mot a un tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 2.000 x g durante 2 min transferencia flotante, quitar el sedimento a una placa FUDR y deje que se seque bajo condiciones estériles.
- Repita el paso 4.4.5 para todas las muestras.
- Incubar los gusanos a 24 ° C hasta D6 de la edad adulta.
Nota: Incubaciones de anticuerpos múltiples también son posibles. -
Añadir 3 mL del buffer M9 para la placa Mot y use 2 mL de solución de M9 para lavar todos los gusanos de una placa FUDR sobre la placa Mot.
- Configurar el rastreador repitiendo los pasos 3.3 a 3.3.2.
- Coloque la placa Mot en la etapa de seguimiento, enfoque la cámara según sea necesario y comenzar a grabar. Cuando la grabación termine, deseche la placa Mot o recuperar para más investigación si lo desea.
- Repita los pasos del 4.6 a 4.6.2 para todas las muestras.
5. analizar los datos de vídeo
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Después de adquirir los vídeos, seleccionar los parámetros adecuados en el software GUI (figura 2) para análisis de datos.
- Cargar uno o varios vídeos mediante la función de navegación . Seleccione una carpeta de destino de salida. Asegúrese de que 600 a 1.200 marcos se utilizan para un análisis s 30.
Nota: Cualquier rango de cuadros puede ser analizada. - Inserte un píxel a mm factor de conversión, que será 0,029 para un platos de Petri de 9 cm en máxima resolución de imagen. Seleccione el algoritmo de seguimiento 'keep dead'.
Nota: El factor de conversión dependerá del campo de visión utilizado. Z-transforme algoritmo también puede utilizarse como alternativa. - Rellene los parámetros en la sección de localización (figura 2): Z utilizar imágenes = 100, relleno de Z = 3, píxeles Std = 54, umbral = 9, apertura = 1, cierre = 2. Ajustar los parámetros de filtrado a tamaño mínimo = 20, tamaño máximo = 180, gusanos = 0.94.
- Ajustar los parámetros de trayectorias de formación : distancia máxima mover = 10; Longitud mínima = 150, memoria = 10.
- Definir los parámetros de velocidad y curvas . Utilizar 1.8 para el umbral de la curva, 0 para mínimo doblay 150 para los marcos para estimar la velocidad.
- Sintonizar las estadísticas de gusano muerto. Utilice 5.0 máxima Beat por minuto y 1.0 para la velocidad máxima.
- Elegir la carpeta de salida. Establecer el número de fotogramas de salida para 50. Ajustar tamaño de fuente 10.
Nota: Opcionalmente, seleccione una o más regiones de interés (ROIs).
- Cargar uno o varios vídeos mediante la función de navegación . Seleccione una carpeta de destino de salida. Asegúrese de que 600 a 1.200 marcos se utilizan para un análisis s 30.
- Comprobar los parámetros utilizando la función de ejemplo . Las imágenes de ejemplo de la salida y compruebe que los gusanos son visibles a lo largo de los 8 pasos de umbral (figura 1).
- Utilice la función iniciar trabajo .
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Analizar los archivos de resultados de texto mediante la combinación de los resultados individuales del conjunto de datos enteros. Utilice la exportación a la función de tsv en el GUI.
Nota: Opcionalmente, también se pueden considerar mediciones individuales de los gusanos para estudios de la población.- Analizar los datos con un paquete de software estadístico.
Representative Results
La facilidad de explotación, análisis multiparamétrico y alto rendimiento del protocolo NTP WF ilustrado (figuras 1 y 2) es posible determinar cambios muy pequeños en el comportamiento del gusano de manera muy precisa. La plataforma de proyección de imagen se basa en opto-mecánica por encargo, y puede ser montado usando una cámara monocromática de 6 MP combinado con alta resolución lente de longitud focal de 16 mm para sensor de 1'', iluminada con 8'' por 8'' blanco luz de fondo (véase Tabla de materiales y también referencia a36 para detalles adicionales). El software asociado de WF-NTP está escrito en Python y fue desarrollado para funcionar en plataformas Windows. Ejecuta en un equipo ensamblado personalizado con 3,00 GHz de octa-core y 64 GB de memoria de acceso aleatorio (RAM). El software fue diseñado también para paralelizar el trabajo y análisis de vídeo basado en la RAM y CPU de la computadora; es decir,, una máquina con un menor poder de cálculo resultará en menos videos ejecutan en paralelo. La configuración que estamos utilizando en la actualidad está optimizada para funcionar aprox. 16 videos en paralelo y puede completar un análisis de 100 videos de ca. durante la noche. Por otra parte, el alto nivel de detalle de personalización en la GUI de la WF-NTP permite gran control de la calidad de los análisis de proyección de imagen. La GUI se puede utilizar para subir directamente conjuntos de datos grandes en paralelo o individuales videos; marcos específicos también se pueden seleccionar para los análisis, junto con un factor de conversión de pixel, que puede utilizarse para estimar indicadores de comportamiento. Uno de los dos algoritmos de seguimiento diferentes (mantener muerto y Z-transforme) puede ser elegido dependiendo de si el usuario desea animales paralizados en el análisis. El parámetro de umbral puede ser experimental y por lo tanto atento con el video de calidad. Los parámetros de cierre y apertura permiten al usuario eliminar el ruido y además implementar las funciones de thresholding. El algoritmo skeletonizing ofrece un método alternativo de análisis. El objeto tamaño cortes (filtrado) proveen un filtro adicional para el ruido de fondo y el gusano-como parámetro permite al usuario considerar objetos sólo gusanos con forma elipsoidal, por lo tanto distinguir de otros objetos que tengan el mismo tamaño de píxel de los gusanos. Después de estas operaciones de umbralización, todas las regiones con resultantes pueden ser identificadas como los gusanos y las posiciones de las regiones se almacenan para cada fotograma para posterior análisis y seguimiento. La excentricidad de cada gusano oruga se utiliza para estimar los parámetros de la lombriz como la medida del gusano (BPM) de la flexión en función del tiempo. Los usuarios también se pueden seleccionar el número de fotogramas utilizado para mantener a un gusano en la memoria del software después de colisiones, y el número de píxeles que un gusano puede moverse entre cuadros también puede ser afinado para distinguir el ruido de los animales. La opción de longitud mínima de pista permite al usuario eliminar gusanos que han sido rastreados para sólo unos pocos fotogramas. Otros parámetros claves, tales como curvas y la velocidad, permiten al usuario seleccionar el grado de flexión necesario para ser contado como una curva de cuerpo y el número de fotogramas que se consideran necesarios para estimar la velocidad de los animales. Parámetros de corte se pueden ajustar aún más para la inclusión de animales paralizados. La salida se muestra automáticamente en los archivos de resultados. Estos valores se consideran como límites superiores para la evaluación de la fracción de animales paralizados. El usuario también puede seleccionar una o más regiones de interés. Esta característica es particularmente útil para analizar subpoblaciones de los gusanos y la salida se ordena automáticamente en los archivos de resultados. La opción de salida permite al usuario seleccionar la carpeta de salida y el número de fotogramas que se producirán para de seguimiento. Diversos conjuntos de herramienta pueden utilizarse también para su posterior análisis de datos, como la herramienta de trazado de la trama que muestra cada gusano pistas y la herramienta de huellas dactilares que permite al usuario crear huellas digitales mapas.
Esta metodología permite nuevos enfoques para ser adoptada, no sólo para estudios biológicos de C. elegans , pero también para fines de investigación médica y farmacológica, como proyección de alto rendimiento de modificaciones genéticas y tratamientos farmacológicos. Hemos ilustrado este potencial mediante la descripción de la caracterización de los fenotipos para los estudios de población (N > 1000) de varios modelos de gusano de enfermedades neurodegenerativas (frontotemporal demencia (FTD)39, enfermedad de Parkinson (EP)7 , Enfermedad de Alzheimer (EA)16,40y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)19 (figura 3a) y caracterizar los efectos de potenciales moléculas terapéuticas utilizando modelos de gusano de PD18 y AD 15,12 (figura 3b). Dos pequeñas moléculas, escualamina18 y bexaroteno15, fue administrado en concentraciones de hasta 25 μm a PD (figura 3b) y 10 μm a AD38 (figura 3b) gusanos, respectivamente. Ambos compuestos mostraron claros efectos dosis-dependiente en el rango de las concentraciones probaron. Hemos demostrado que esta alta precisión de las mediciones se logra aumentando el número de gusanos que pueden analizarse en comparación con los métodos tradicionales (Figura 3C). Nos ilustra la importancia del tamaño de la muestra (figura 3 c) en investigación molecular así como en la caracterización de cepas mutantes. El aumento de temperatura de 20 ° C conduce a aproximadamente la mitad de los gusanos de AD ser paralizados después de tres días de la edad adulta. Poblaciones de gusano fueron defendidas bajo diferentes condiciones, por ejemplo,, cuando gusanos sobre-expresando la forma 42-residuos del péptido β amiloide (Aβ1-42) (anuncio gusanos) fueron expuestos a las variaciones sutiles de la temperatura (figura 3 c, izquierda panel), cuando se expresó Aβ1-42 en todas las neuronas (figura 3 c, panel central), o cuando anuncio gusanos fueron expuestos a bexaroteno (figura 3 c, panel derecho). También se analizaron los gusanos de pequeño ROIs seleccionadas al azar de todo el campo de visión de los vídeos adquiridos con el WF-NTP (barras de < 50, amarillo N) destacando la comparación de la motilidad de estos gusanos con la movilidad media de la población del gusano entero (N < 1.000). En todos los paneles, la diferencia medida en el conjunto población de gusano parece ser estadísticamente significativa con p ≤ 0.0001 (*).
El protocolo NTP WF descrito aquí también permite la grabación simultánea de varios parámetros (Figura 1b) para apoyar de manera óptima, el desarrollo de una huella dactilar completa de una amplia gama de condiciones y validación interna Comparado con una muestra control, lo que permite comparaciones significativas a través de múltiples estudios. Este enfoque multi-paramétrico incluye el análisis simultáneo de múltiples características conductuales, incluyendo doblar la frecuencia, velocidad, tasa de parálisis, tamaño, amplitud de la curva y curva desplazamiento36. Esto permite a miles de animales a controlar con gran detalle y en una muy alta sensibilidad y la significación estadística y ofrece oportunidades para estudios de grandes poblaciones. Este procedimiento de seguimiento también tiene la ventaja de permitir estudios de parálisis que se realizará en paralelo con otras mediciones de comportamiento, una característica clave en los estudios de investigación molecular.
Los resultados que se han logrado hasta ahora en AD15,34,35 y descubrimiento de fármacos PD18 demuestran la importancia de la adquisición de datos de amplio campo de visión para incrementar el número de animales que pueden ser controlar en un solo experimento, disminuyendo significativamente los errores experimentales y grandemente mejorando la validez estadística de los estudios. Basado en estos resultados, esperamos que el protocolo NTP WF, que hemos hecho disponibles para la comunidad36, ampliará significativamente el uso de C. elegans.
Figura 1: pasos de análisis WF-NTP y ejemplo de una huella digital. (a) 1. Video original. 2. background image. 3. fondo resta imagen. 4-6. pasos de umbral. 7-9. etiquetado único de gusanos. (b) múltiples fenotipos son registrados con una huella dactilar para gusanos de tipo salvaje y el gusano modelos de PD y AD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: interfaz gráfica de usuario (GUI) del WF-NTP. Videos específicos y fotogramas seleccionados se pueden seleccionar en la interfaz gráfica para el análisis, y puede introducirse un factor de conversión de pixel, después de lo cual el análisis se lleva a cabo con uno de los dos algoritmos de seguimiento determinado. Es posible seleccionar el grado de flexión necesario contar con una curva de cuerpo así como el número de fotogramas necesarios para estimar la velocidad de los animales. Curvas del cuerpo y los umbrales de velocidad pueden determinar las estadísticas de gusano paralizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ejemplos de aplicaciones preparadas por el método de WF-NTP. (a) aplicación de WF-NTP en estudios poblacionales grandes (N > 1.000) de las mediciones de BPM para C. elegans los modelos de una gama de las enfermedades neurodegenerativas incluyendo la FTD, PD, AD y ALS. (b) aplicación de WF-NTP en descubrimiento de fármacos. (c) importancia de los estudios de población en la sensibilidad de temperatura, eficacia de la droga y caracterización de la cepa mutante. Fenotipos de subpoblaciones N < 50 (barras de color amarillo) se comparan con los de la población del gusano entero (N < 1.000). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Debido a la rápida expansión de las técnicas dentro del campo de las Ciencias ópticas, ahora es posible abordar la necesidad de métodos automatizados en los estudios de C. elegans en sustancialmente nuevas formas. Como resultado, un número de seguimiento de plataformas20,41,42,43,44,45,46 digital diseñados y disponibles en los últimos años para sustituir el recuento manual de los parámetros tales como velocidad de movimiento, frecuencia, tipo de parálisis, así como formas más complejas de comportamientos tales como vueltas de omega y mediciones de vida útil de flexión. Plataformas de automatización más recientes han mejorado notablemente la reproducibilidad y sensibilidad de C. elegans estudios41 y proporciona datos de alta calidad en cohortes pequeñas o incluso los individuos. Decidimos extender la automatización del análisis de comportamiento de gusano que permiten también evaluar los fenotipos de las cohortes de miles de animales en paralelo. La principal ventaja del enfoque de estudio de cohortes de gusano es que permite para la contabilidad para la alta variabilidad intrínseca de gusano comportamiento24 y por el hecho de que los estudios de tratamiento de drogas a menudo conducen a sutiles variaciones fenotípicas, que son difícil de detectar con suficiente significación estadística cuando se usa un pequeño grupo de animales. Un alto poder de detección (POD) es de hecho necesario para detectar con confianza cualquier variación significativa en el comportamiento y limitar falsos positivos25.
Aquí, hemos descrito una serie de protocolos basados en un método de reciente proyección automatizada para C. elegans, el nematodo de amplio campo de visión de seguimiento de la plataforma (WF-NTP)36. El protocolo descrito aquí se divide en 5 partes. Partes 1 y 2 describen la preparación de las poblaciones de gusano grande. Pasos críticos son la esterilidad de las condiciones de trabajo y preparación de reactivos y placas necesarias para ejecutar los experimentos. Tomamos nota de que, debido al mayor rendimiento proporcionado por este protocolo en comparación con otros36de metodologías de detección, también requiere de mayores cantidades de reactivos; Este factor debe ser considerado cuidadosamente en el diseño experimental. También observamos que el paso de decoloración es fundamental y debe probarse de antemano como un gran número de huevos y larvas sanas son necesarias para ejecutar estos experimentos. Parte 3 de este protocolo detalla cómo administrar medicamentos en gusano sólido de los medios de comunicación y la pantalla de las poblaciones. Podemos observar que esta parte del protocolo es fuertemente dependiente en la cantidad de droga y concentraciones de la droga para ser probado por el usuario en la URL. La automatización completa del procedimiento de selección y adquisición de datos rápida cambiar el paso limitante de observación conductual para preparación del reactivo y el crecimiento y la sincronización de las poblaciones de gusano grande. Los pasos clave en la proyección conductual son los tiempos de la grabación y cualquier gusano manejo pasos (por ejemplo, la transferencia de gusanos de las planchas NGM en la plataforma de seguimiento). El protocolo descrito aquí es un ejemplo diseñado para detectar los gusanos hasta 9 días durante la vida adulta; sin embargo, este protocolo puede ser fácilmente adaptado a la pantalla tantos puntos de tiempo como el usuario desea, por ejemplo, 18 días consecutivos36. Parte 4 a continuación ilustra la aplicación del protocolo para entregar las moléculas de proteína (p. ej., anticuerpos y chaperones moleculares) en C. elegansy muestra cómo el protocolo ilustrado en partes 1-3 puede ser fácilmente personalizado, dependiendo de la aplicación. Demostramos cómo este procedimiento puede extenderse no sólo a la entrega de droga-como las moléculas, sino también para la administración de anticuerpos o chaperones moleculares37. Los primeros cuatro pasos (piezas) se llevan a cabo en condiciones estériles, si no se indica lo contrario. Todos los componentes del líquido deben ser esterilizados antes de su uso y los pasos de incubación deben realizarse a una humedad relativa de 70%. En la parte 5, se describe cómo utilizar el paquete de software suministrado en combinación con la etapa de seguimiento. Este software ha sido diseñado para el análisis de datos WF-NTP relacionadas con el comportamiento de las poblaciones de gusano grande. Sugerimos que el usuario sigue las pautas previstas en la parte 5 el análisis de datos; sin embargo, estos parámetros dependen de las características específicas de los vídeos grabados (es decir, fps, campo de visión, resolución de vídeo, número de cuadros adquiridos). La función de ejemplo proporcionada en el GUI ha sido diseñada para facilitar la evaluación de los parámetros correctos antes del análisis.
Esta serie de protocolos que permiten analizar los fenotipos de grandes poblaciones de C. elegans (actualmente hasta 5.000 lombrices individuales en paralelo) con eficacia, reduciendo artefactos debido a la variabilidad intrínseca del comportamiento de los animales , de acuerdo con estudios preliminares sobre el poder de detección necesaria para lograr significación estadística de estudios de C. elegans25. La plataforma utiliza un sistema de cámaras de alta resolución, capaces de grabar imágenes de un gran número de animales a gran velocidad, mientras se graban simultáneamente múltiples cohortes grandes. El alto rendimiento y alto rendimiento del protocolo NTP WF permite determinar cambios muy pequeños en el comportamiento del gusano de manera muy precisa. Por lo tanto, esta metodología permite nuevos enfoques a considerar para el estudio de la biología de C. elegans, pero además para la investigación farmacológica y médica, como la proyección de alto rendimiento de modificaciones genéticas y de la droga tratamientos. Este procedimiento también tiene la ventaja de permitir estudios de parálisis que se realizará en paralelo con otras mediciones de comportamiento, una característica clave en los estudios de investigación molecular.
Los resultados que se han logrado hasta ahora en los programas de descubrimiento de drogas de AD15,34,35 y PD18 demuestran la importancia de la adquisición de datos de amplio campo de visión en incrementar sustancialmente la número de animales que pueden ser monitoreados en un solo experimento, reduciendo así significativamente los errores experimentales y grandemente mejorando la validez estadística de los estudios. Mientras que el enfoque actual se describe en este protocolo se ha centrado en abordar los desafíos en el campo del descubrimiento de fármacos, esperamos que la metodología se adoptará extensamente en la comunidad, y que su aplicación se extenderá al conjunto genético y estudios de comportamiento y ampliar el número de fenotipos que son detectables en la actualidad.
Disclosures
Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el centro para enfermedades mal plegamiento (CMD). FAA es apoyada por un premio de beca de investigación Senior de la sociedad, Reino Unido de Alzheimer (beca número 317, AS-SF-16-003). Se obtuvieron las cepas de C. elegans de lo elegans de Caenorhabditis centro genético (CGC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable reagents | |||
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
| C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
| C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
| C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
| pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| air duster | Office Depot | 1511631 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
| 8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
| 16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
| 6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
| FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
| WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
| Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |
References
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