Se describen los protocolos para el uso de la plataforma de seguimiento de nematodos de amplio campo de visión (WF-NTP), que permite alto rendimiento caracterización fenotípica de poblaciones grandes de Caenorhabditis elegans. Estos protocolos se pueden utilizar para caracterizar cambios sutiles del comportamiento en cepas mutantes o en respuesta al tratamiento farmacológico de manera altamente escalable.
Caenorhabditis elegans es un modelo bien establecido en la investigación biomédica, ampliamente empleada en estudios de envejecimiento y genómica funcional. Para evaluar la salud y la aptitud de los animales bajo estudio, uno normalmente se basa en lecturas de la motilidad, como la medición de la cantidad de curvas del cuerpo o la velocidad de movimiento. Estas medidas implican generalmente el recuento manual, lo que es difícil obtener buena significación estadística, como el tiempo y las limitaciones de mano de obra a menudo limitan el número de animales en cada experimento a 25 o menos. Ya que alta potencia estadística es necesario para obtener resultados reproducibles y limitar resultados falsos positivos y negativos cuando se investigan los efectos fenotípicos débiles, recientemente se han hecho esfuerzos para desarrollar protocolos automatizados se centró en el aumento de la sensibilidad de detección de motilidad y multi-paramétrico de perfiles conductuales. Para ampliar el límite de detección al nivel necesario para capturar los pequeños cambios fenotípicos que son a menudo cruciales en estudios genéticos y descubrimiento de fármacos, se describe aquí un desarrollo tecnológico que permite el estudio de los animales individuales hasta 5.000 simultáneamente, aumentar el poder estadístico de las mediciones por unos 1,000-fold en comparación con el análisis manual y unos 100-fold en comparación con otros métodos automatizados disponibles.
Hace aproximadamente medio siglo Sydney Brenner introdujo Caenorhabditis elegans (C. elegans) como un sistema modelo para estudiar desarrollo y Neurobiología, como este pequeño (1 mm de longitud), gusano del nematodo transparente es fácil de manipular genéticamente y a mantener en el laboratorio1. C. elegans se utiliza hoy, para el estudio de una amplia variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, la naturaleza del ciclo celular, regulación génica, metabolismo y envejecimiento2. Además, la complejidad celular y tejido, patrones de expresión de la proteína y la conservación de los caminos de la enfermedad entre C. elegans y organismos más altos (80% de los genes del gusano tienen un orthologue humano), con la sencillez y rentabilidad del cultivo, que sea un organismo eficaz en vivo modelo susceptibles a genética de alto rendimiento3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , drogas y 13 14,15,16 proyecciones. Por todas estas razones, C. elegans se ha empleado para la caracterización de vías moleculares normales y relacionadas con la enfermedad; en el campo de la neurodegeneración, por ejemplo, ha permitido la exploración de los efectos del envejecimiento en la proteína agregación3,4,7,15,17, 18y la caracterización de promotores e inhibidores de la proteína agregación3,4,5,6,7,14, 18.
La condición física general de los gusanos, que es un parámetro de comportamiento importante en este tipo de estudio, puede medirse manualmente en una variedad de maneras, como contando el número de curvas de cuerpo por minuto (BPM)4,6, 19, o mediante la medición de la velocidad de movimiento20,21,22, así como mediante la medición de la vida útil promedio y las tasas de parálisis. Aunque mediciones manuales de cuerpo curvas y velocidad de movimiento han conducido a muchos conocimientos profundos e importantes en una variedad de vías moleculares y mecanismos3,4,14,19, 20,23, manual de ensayos siguen siendo actualmente bajo rendimiento altamente necesitandos mucho trabajo y mucho tiempo y son propensos a errores y prejuicios humanos. Estas cuestiones presentan desafíos considerables en la recogida de datos con suficiente poder estadístico para distinguir cambios sutiles del comportamiento. Esta limitación es particularmente relevante para drogas de detección como los tratamientos con drogas potenciales moléculas a menudo conducen a cambios fenotípicos pequeños24, requiriendo por lo tanto el estudio de un gran número de animales con el fin de obtener resultados reproducibles. Para ilustrar este punto, estudios recientes han demostrado que un alto poder de detección (POD) es necesario definir con confianza cualquier cambio significativo en el comportamiento y limitar falsos positivos25. Esto ha resultado en una fuerte motivación en la comunidad de C. elegans para reemplazar el conteo manual con mediciones reproducible, automatizada, tiempo – y costo – efectiva. Para satisfacer esta demanda, varios laboratorios han desarrollado recientemente métodos para mediciones de alta sensibilidad y seguimiento gusano precisa de mayor número de gusanos22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Para ampliar aún más el proceso de automatización a las cohortes grandes de animales necesarios para las mediciones estadísticamente significativas, hemos desarrollado recientemente un nematodo de amplio campo de visión de seguimiento de plataforma (WF-NTP)15,34 ,35,36, que permite la investigación simultánea de múltiples lecturas fenotípicas en las poblaciones de gusano muy grande, un factor clave en la detección fenotípica estadísticamente relevantes25. No sólo puede el WF-NTP monitor actualmente hasta 5.000 animales en paralelo, pero las lecturas fenotípicas también incluyen varios parámetros, incluyendo el ritmo y la amplitud de las curvas del cuerpo, la velocidad de movimiento, la fracción de la población que está paralizada, y la tamaño de los animales. Por lo tanto es fácilmente posible pantalla miles de gusanos en paralelo y para combinar las diferentes lecturas en un mapa de comportamiento para crear una huella digital multidimensional36. El software de código abierto asociado está escrito en Python, que es también necesaria para operarlo y es totalmente personalizable. También se proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI) para permitir a los usuarios a adoptar esta tecnología.
Aquí, presentamos una serie de protocolos que ilustran algunas de las aplicaciones potenciales de la WF-NTP. En particular, discutimos la administración de compuestos, que van desde moléculas pequeñas de proteínas terapéuticas y se describe cómo detectar sus efectos directamente sobre grandes poblaciones de gusanos, efectivamente eliminando así la necesidad de la muestra pequeño las subpoblaciones. El uso del NTP WF para ello ya ha traído ventajas significativas en procedimientos encaminados a diseñar programas de descubrimiento de drogas de la enfermedad de Alzheimer (EA)15,34,35 y enfermedad de Parkinson (EP)18 con datos in vivo para la evaluación de los candidatos terapéuticos35,37.
Debido a la rápida expansión de las técnicas dentro del campo de las Ciencias ópticas, ahora es posible abordar la necesidad de métodos automatizados en los estudios de C. elegans en sustancialmente nuevas formas. Como resultado, un número de seguimiento de plataformas20,41,42,43,44,45,46 digital diseñados y disponibles en los últimos años para sustituir el recuento manual de los parámetros tales como velocidad de movimiento, frecuencia, tipo de parálisis, así como formas más complejas de comportamientos tales como vueltas de omega y mediciones de vida útil de flexión. Plataformas de automatización más recientes han mejorado notablemente la reproducibilidad y sensibilidad de C. elegans estudios41 y proporciona datos de alta calidad en cohortes pequeñas o incluso los individuos. Decidimos extender la automatización del análisis de comportamiento de gusano que permiten también evaluar los fenotipos de las cohortes de miles de animales en paralelo. La principal ventaja del enfoque de estudio de cohortes de gusano es que permite para la contabilidad para la alta variabilidad intrínseca de gusano comportamiento24 y por el hecho de que los estudios de tratamiento de drogas a menudo conducen a sutiles variaciones fenotípicas, que son difícil de detectar con suficiente significación estadística cuando se usa un pequeño grupo de animales. Un alto poder de detección (POD) es de hecho necesario para detectar con confianza cualquier variación significativa en el comportamiento y limitar falsos positivos25.
Aquí, hemos descrito una serie de protocolos basados en un método de reciente proyección automatizada para C. elegans, el nematodo de amplio campo de visión de seguimiento de la plataforma (WF-NTP)36. El protocolo descrito aquí se divide en 5 partes. Partes 1 y 2 describen la preparación de las poblaciones de gusano grande. Pasos críticos son la esterilidad de las condiciones de trabajo y preparación de reactivos y placas necesarias para ejecutar los experimentos. Tomamos nota de que, debido al mayor rendimiento proporcionado por este protocolo en comparación con otros36de metodologías de detección, también requiere de mayores cantidades de reactivos; Este factor debe ser considerado cuidadosamente en el diseño experimental. También observamos que el paso de decoloración es fundamental y debe probarse de antemano como un gran número de huevos y larvas sanas son necesarias para ejecutar estos experimentos. Parte 3 de este protocolo detalla cómo administrar medicamentos en gusano sólido de los medios de comunicación y la pantalla de las poblaciones. Podemos observar que esta parte del protocolo es fuertemente dependiente en la cantidad de droga y concentraciones de la droga para ser probado por el usuario en la URL. La automatización completa del procedimiento de selección y adquisición de datos rápida cambiar el paso limitante de observación conductual para preparación del reactivo y el crecimiento y la sincronización de las poblaciones de gusano grande. Los pasos clave en la proyección conductual son los tiempos de la grabación y cualquier gusano manejo pasos (por ejemplo, la transferencia de gusanos de las planchas NGM en la plataforma de seguimiento). El protocolo descrito aquí es un ejemplo diseñado para detectar los gusanos hasta 9 días durante la vida adulta; sin embargo, este protocolo puede ser fácilmente adaptado a la pantalla tantos puntos de tiempo como el usuario desea, por ejemplo, 18 días consecutivos36. Parte 4 a continuación ilustra la aplicación del protocolo para entregar las moléculas de proteína (p. ej., anticuerpos y chaperones moleculares) en C. elegansy muestra cómo el protocolo ilustrado en partes 1-3 puede ser fácilmente personalizado, dependiendo de la aplicación. Demostramos cómo este procedimiento puede extenderse no sólo a la entrega de droga-como las moléculas, sino también para la administración de anticuerpos o chaperones moleculares37. Los primeros cuatro pasos (piezas) se llevan a cabo en condiciones estériles, si no se indica lo contrario. Todos los componentes del líquido deben ser esterilizados antes de su uso y los pasos de incubación deben realizarse a una humedad relativa de 70%. En la parte 5, se describe cómo utilizar el paquete de software suministrado en combinación con la etapa de seguimiento. Este software ha sido diseñado para el análisis de datos WF-NTP relacionadas con el comportamiento de las poblaciones de gusano grande. Sugerimos que el usuario sigue las pautas previstas en la parte 5 el análisis de datos; sin embargo, estos parámetros dependen de las características específicas de los vídeos grabados (es decir, fps, campo de visión, resolución de vídeo, número de cuadros adquiridos). La función de ejemplo proporcionada en el GUI ha sido diseñada para facilitar la evaluación de los parámetros correctos antes del análisis.
Esta serie de protocolos que permiten analizar los fenotipos de grandes poblaciones de C. elegans (actualmente hasta 5.000 lombrices individuales en paralelo) con eficacia, reduciendo artefactos debido a la variabilidad intrínseca del comportamiento de los animales , de acuerdo con estudios preliminares sobre el poder de detección necesaria para lograr significación estadística de estudios de C. elegans25. La plataforma utiliza un sistema de cámaras de alta resolución, capaces de grabar imágenes de un gran número de animales a gran velocidad, mientras se graban simultáneamente múltiples cohortes grandes. El alto rendimiento y alto rendimiento del protocolo NTP WF permite determinar cambios muy pequeños en el comportamiento del gusano de manera muy precisa. Por lo tanto, esta metodología permite nuevos enfoques a considerar para el estudio de la biología de C. elegans, pero además para la investigación farmacológica y médica, como la proyección de alto rendimiento de modificaciones genéticas y de la droga tratamientos. Este procedimiento también tiene la ventaja de permitir estudios de parálisis que se realizará en paralelo con otras mediciones de comportamiento, una característica clave en los estudios de investigación molecular.
Los resultados que se han logrado hasta ahora en los programas de descubrimiento de drogas de AD15,34,35 y PD18 demuestran la importancia de la adquisición de datos de amplio campo de visión en incrementar sustancialmente la número de animales que pueden ser monitoreados en un solo experimento, reduciendo así significativamente los errores experimentales y grandemente mejorando la validez estadística de los estudios. Mientras que el enfoque actual se describe en este protocolo se ha centrado en abordar los desafíos en el campo del descubrimiento de fármacos, esperamos que la metodología se adoptará extensamente en la comunidad, y que su aplicación se extenderá al conjunto genético y estudios de comportamiento y ampliar el número de fenotipos que son detectables en la actualidad.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el centro para enfermedades mal plegamiento (CMD). FAA es apoyada por un premio de beca de investigación Senior de la sociedad, Reino Unido de Alzheimer (beca número 317, AS-SF-16-003). Se obtuvieron las cepas de C. elegans de lo elegans de Caenorhabditis centro genético (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |