Descrevemos os protocolos para a utilização da plataforma de controle de nematoides amplo campo de visão (WF-NTP), que permite alta produtividade Caracterização fenotípica de grandes populações de Caenorhabditis elegans. Estes protocolos podem ser usados para caracterizar mudanças comportamentais sutis em cepas mutantes ou em resposta ao tratamento farmacológico de forma altamente escalável.
Caenorhabditis elegans é um modelo animal bem estabelecido na investigação biomédica, amplamente empregada em genômica funcional e estudos de envelhecimento. Para avaliar a saúde e a aptidão dos animais em estudo, um normalmente se baseia em leituras de motilidade, tais como a medição do número de dobras do corpo ou a velocidade de movimento. Estas medidas geralmente envolvem a contagem manual, tornando-se desafiador para obter boa significância estatística, como tempo e restrições de trabalho muitas vezes limitar o número de animais em cada experimento para 25 ou menos. Desde alta potência estatística é necessária para obter resultados reprodutíveis e limitar resultados falsos positivos e negativos quando fracos efeitos fenotípicos são investigados, recentemente foram feitos esforços para desenvolver protocolos automatizados focados em aumentar a sensibilidade de detecção de motilidade e perfis comportamentais multi paramétrico. A fim de ampliar o limite de detecção para o nível necessário para capturar as alterações fenotípicas pequenas que muitas vezes são cruciais em estudos genéticos e descoberta da droga, nós descrevemos aqui um desenvolvimento tecnológico que permite o estudo de até 5.000 animais individuais simultaneamente, aumentando o poder estatístico das medições por cerca 1,000-fold em relação ao manual de ensaios e tal 100-fold em comparação com outros métodos automatizados disponíveis.
Cerca de meio século atrás, Sydney Brenner introduzido Caenorhabditis elegans (c. elegans) como um sistema modelo para estudar o desenvolvimento e a neurobiologia, como este pequeno (1 mm em comprimento), verme nematoide transparente é fácil de manipular geneticamente e manter no laboratório1. Hoje, o c. elegans é usado para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, a natureza do ciclo celular, regulação gênica, metabolismo e envelhecimento2. Além disso, a complexidade celular e tecidos, testes padrões da expressão da proteína e a conservação dos caminhos de doença entre c. elegans e organismos superiores (80% dos genes de verme tem um orthologue humano), vinculado com a simplicidade e rentabilidade do cultivo, torná-lo um organismo modelo eficaz na vivo passível de alto rendimento genético3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 e drogas14,15,16 seleções. Por todas estas razões, c. elegans tem sido empregado para a caracterização de normais e doença relacionada com vias moleculares; no campo de neurodegeneração, por exemplo, permitiu a exploração dos efeitos do envelhecimento na proteína agregação3,4,7,15,17, 18e a caracterização dos promotores e inibidores de proteína agregação3,4,5,6,7,14, 18.
A adequação global dos vermes, que é um importante parâmetro comportamental para ser definidos nesse tipo de estudo, pode ser medida manualmente em uma variedade de maneiras, tais como pela contagem do número de curvas do corpo por minuto (BPM)4,6, 19, ou medindo a velocidade de movimento20,21,22, bem como medindo-se a esperança média de vida e as taxas de paralisia. Embora medição manual das curvas do corpo e da velocidade de movimento tem levado muitos insights importantes sobre uma variedade de vias moleculares e mecanismos3,4,14,19, 20,23, ensaios manuais permanecem atualmente baixa produtividade, altamente trabalhosa e demorada enquanto ser propensa a erros e preconceitos humanos. Essas questões apresentam desafios consideráveis na recolha de dados com poder estatístico suficiente para distinguir sutis mudanças de comportamento. Essa limitação é particularmente relevante para droga triagem como tratamentos com drogas potenciais moléculas muitas vezes levam a pequenas alterações fenotípicas24, exigindo, portanto, o estudo de um grande número de animais a fim de adquirir resultados reprodutíveis. Para ilustrar este ponto, estudos recentes têm mostrado que um alto poder de deteção (POD) é necessário para definir, com confiança, quaisquer alterações significativas no comportamento e limitar resultados falso-positivos25. Isto resultou em uma forte motivação na Comunidade c. elegans para substituir a contagem manual com medições reproduzíveis, automatizado, tempo – e cost – effective. Para atender esta demanda, vários laboratórios recentemente desenvolveram métodos para medições de alta sensibilidade e monitoramento de verme precisa de maior número de minhocas22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
A fim de expandir ainda mais o processo de automação para as grandes coortes de animais necessários para medições estatisticamente significativas, recentemente desenvolvemos um amplo campo de visão de nematódeo rastreamento de plataforma (WF-NTP)15,34 ,35,36, que permite a investigação simultânea de múltiplas leituras fenotípicas em populações de verme muito grande, um fator chave na deteção fenotípica estatisticamente relevantes25. Não só pode o WF-NTP atualmente monitorar até 5.000 animais em paralelo, mas as leituras fenotípicas também incluem vários parâmetros, incluindo a frequência e a amplitude das curvas do corpo, a velocidade de movimento, a fração da população que está paralisada, e o tamanho dos animais. É, portanto, prontamente possível tela milhares de vermes em paralelo e combinar as diferentes leituras em um mapa comportamental para criar uma impressão digital multidimensional36. O software open-source associado é escrito em Python, que também é necessária para operá-lo e é completamente personalizável. Uma interface de usuário gráfica (GUI) também é fornecida para permitir que os usuários a adotar esta tecnologia.
Aqui, apresentamos uma série de protocolos que ilustram algumas das aplicações potenciais do WF-NTP. Em particular, discutimos a administração de compostos, variando de pequenas moléculas a terapêutica de proteínas e descrevem como tela seus efeitos diretamente sobre grandes populações de minhocas, eficazmente eliminando assim a necessidade de amostra pequeno sub-populações. O uso do WF-NTP para tal finalidade já trouxe vantagens significativas nos procedimentos destinados para projetar programas de descoberta de drogas da doença de Alzheimer (AD)15,34,35 e a doença de Parkinson (PD)18 usando dados in vivo para avaliação dos candidatos terapêutico35,37.
Por causa da rápida expansão das técnicas no âmbito das Ciências ópticas, agora é possível abordar a exigência de métodos automatizados nos estudos de c. elegans em maneiras substancialmente novas. Como resultado, um número de digital plataformas20,41,42,,43,44,,45,46 de rastreamento foram concebidos e disponibilizados ao longo nos últimos anos a fim de substituir a contagem manual dos parâmetros tais como a velocidade de movimento, dobra a frequência, a taxa de paralisia, bem como formas mais complexas de comportamentos tais como ômega voltas e medições de expectativa de vida. Mais recentes plataformas automatizadas melhoraram grandemente a reprodutibilidade e sensibilidade de c. elegans estudos41 e forneceu dados de alta qualidade em pequenos cortes ou mesmo determinados animais. Decidimos estender a automação da análise do comportamento de worm que permitam também avaliar os fenótipos de coortes de milhares de animais em paralelo. A principal vantagem da abordagem de estudando coortes de verme é que ele permite que para a contabilidade para a alta variabilidade intrínseca do worm comportamento24 e para o fato de que estudos de tratamento de drogas frequentemente conduzem a variações fenotípicas sutis, que são difíceis de detectar com significância estatística suficiente quando usando um pequeno grupo de animais. Alto poder de deteção (POD) é efectivamente necessário para detectar, com confiança, qualquer variação significativa no comportamento e limitar resultados falso-positivos25.
Aqui, descrevemos uma série de protocolos baseados em um método de triagem automatizada recentemente relatado por c. elegans, o nematódeo de amplo campo de visão de rastreamento de plataforma (WF-NTP)36. O protocolo descrito aqui é dividido em 5 partes. As partes 1 e 2 descrevem a preparação das populações de verme grande. Passos críticos são a esterilidade das condições de trabalho e preparação dos reagentes e placas necessárias para executar os experimentos. Constatamos que, devido o maior throughput fornecido pelo presente protocolo, em comparação com outras metodologias36de triagem, ele também requer aumento das quantidades de reagentes; Este fator deve ser considerado com cuidado no projeto experimental. Constatamos também que a etapa de branqueamento é crítica e precisa ser testado com antecedência como um grande número de ovos e larvas saudáveis são necessárias para executar estas experiências. Parte 3 do presente protocolo detalha como entregar drogas no verme sólido de mídia e tela populações. Notamos que esta parte do protocolo é fortemente dependente do número de drogas e concentrações de droga a ser testado pelo usuário em paralelo. A automação completa do processo de triagem e aquisição de dados rápida mudar o passo limitante de observação comportamental para preparação dos reagentes e crescimento e sincronização das populações de verme grande. As principais etapas durante a projecção comportamental são os intervalos de gravação e qualquer verme manipulação etapas (por exemplo, a transferência de vermes das placas NGM para a plataforma de rastreamento). O protocolo descrito aqui é um exemplo projetado para a tela os vermes para até 9 dias durante a vida do adulto; no entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a tela de tantos pontos de tempo como o usuário deseja, por exemplo, por 18 dias consecutivos36. Parte 4, em seguida, ilustra a aplicação do protocolo para entregar as moléculas de proteína (por exemplo, anticorpos e moleculares chaperones) em c. eleganse mostra como o protocolo ilustrado em partes 1-3 pode ser facilmente personalizado, dependendo o desejado aplicação. Vamos demonstrar como este procedimento pode ser estendido não só para a entrega da droga, como moléculas, mas também para a administração de molecular chaperones ou anticorpos37. As quatro primeiras etapas (peças) são realizadas em condições estéreis, salvo indicação em contrário. Todos os componentes líquidos devem ser esterilizados antes da utilização e as etapas de incubação devem ser realizadas em 70% de humidade relativa. Na parte 5, descrevemos como usar o pacote de software fornecido em combinação com a fase de acompanhamento. Este software tem sido personalizado projetado para a análise dos dados de WF-NTP relacionados ao comportamento das populações de verme grande. Sugerimos que o usuário segue as diretrizes fornecidas na parte 5 para a análise de dados; no entanto, estes parâmetros dependem as características específicas dos vídeos gravados (i.e., fps, campo de visão, resolução de vídeo, número de quadros adquiridos). A função de exemplo fornecida na GUI foi concebida para facilitar a avaliação dos parâmetros corretos antes da análise.
Estas séries de protocolos que permitam analisar os fenótipos de grandes populações de c. elegans (atualmente até 5.000 vermes individuais em paralelo), efetivamente, reduzir artefactos devido à variabilidade intrínseca do comportamento dos animais , de acordo com estudos preliminares sobre o poder da deteção necessário para a obtenção de significância estatística de estudos de c. elegans25. A plataforma usa um sistema de câmeras de alta resolução, capazes de gravar imagens de um grande número de animais em alta velocidade, enquanto gravava simultaneamente vários grandes coortes. O alto desempenho e alta taxa de transferência do protocolo NTP-WF torna possível determinar muito pequenas alterações no comportamento de worm de forma muito precisa. Portanto, esta metodologia permite que novas abordagens a considerar não só para o estudo da biologia da c. elegans, mas adicionalmente para pesquisas médicas e farmacológicas, tais como o rastreio com throughput alto de modificações genéticas e drogas tratamentos. Este procedimento também tem a vantagem de permitir estudos de paralisia, a ser realizado em paralelo com outras medidas comportamentais, uma característica fundamental em estudos de triagem molecular.
Os resultados até agora alcançados nos programas de descoberta de drogas de AD15,34,35 e PD18 demonstram a importância da aquisição de dados de amplo campo de visão em aumentar substancialmente a números de animais que podem ser monitorados em uma única experiência, diminuindo assim significativamente os erros experimentais e melhorando consideravelmente a validade estatística dos estudos. Enquanto a abordagem atual descrita neste protocolo centrou-se em enfrentar os desafios no campo da descoberta da droga, esperamos que a metodologia seja amplamente adoptada na Comunidade, e que sua aplicação seja alargada ao complexo genético e estudos comportamentais e expandir o número de fenótipos que são detectáveis no momento.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo centro para doenças enrolamento (CMD). FAA é suportada por um prêmio bolsa de pesquisa sênior de Alzheimer Society, UK (Grant número 317, AS-SF-16-003). As cepas de c. elegans foram obtidas a partir do Caenorhabditis elegans centro genético (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |